ADN complementario

Visión general

Solo los genes que se transcriben en ARN mensajero (ARNm) son activos o expresados. Por lo tanto, los científicos pueden extraer el ARNm de las células para estudiar la expresión génica en diferentes células y tejidos. El científico convierte el ARNm en ADN complementario (ADNc) a través de la transcripción inversa. Debido a que el ARNm no contiene intrones (regiones no codificantes) y otras secuencias reglamentarias, el ADNc, a diferencia del ADN genómico, también permite a los investigadores determinar directamente la secuencia de aminoácidos del péptido codificado por el gen.

Síntesis del ADNc

El ADNc se puede generar por varios métodos, pero una forma común es extraer primero el ARN total de las células, y luego aislar el ARNm de los tipos más predominantes: ARN de transferencia (ARNt) y ribosomal (ARNr). El ARNm eucariota maduro tiene una cola poli(A), una cadena de nucleótidos de adenina, añadida a su extremo de 3′, mientras que otros tipos de ARN no. Por lo tanto, una cadena de nucleótidos de timina (oligo-dTs) se puede unir a un sustrato como una columna o cuentas magnéticas, para emparejar específicamente la base con las colas de poli(A) de ARNm. Mientras se captura el ARNm con una cola de poli(A), los otros tipos de ARN se lavan.

A continuación, la transcriptasa inversa, una enzima de la polimerasa de ADN de retrovirus, se utiliza para generar ADNc a partir del ARNm. Dado que, como la mayoría de las polimerasas de ADN, la transcriptasa inversa puede añadir nucleótidos sólo al extremo de 3′ de una cadena, se añade una imprimación de poli(T) para unirse a la cola de poli(A) para proporcionar un punto de partida para la síntesis de ADNc. La hebra de ADNc termina en un lazo de horquilla.El ARN se degrada, comúnmente con el tratamiento alcalés o las enzimas ARNasa, dejando intacto el ADNc de una sola cadena.

Una segunda cadena de ADN complementaria al ADNc es sintetizada por ADN polimerasa, a menudo usando el lazo de horquilla de la primera hebra de ADNc o una pieza de ARNm como cebador.

El ADNc a doble cadena resultante se puede insertar en vectores bacterianos o virales y clonarse utilizando técnicas de biología molecular estándar. También se puede construir una biblioteca de ADNc, que representa todos los ARNms en las células o el tejido de interés, para realizar investigaciones adicionales.