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Analytical Chemistry

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High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)

00:00Overview
01:22Principles of HPLC
05:05Preparation of the Mobile Phase
06:08Preparation of Component and Standard Solutions
07:25HPLC Setup
09:25Diet Soda Samples
10:16Results
11:27Applications
12:44Summary

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Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

English

Overview

Quelle: Dr. Paul Bower – Purdue Universität

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine wichtige analytische Methode häufig verwendet, um zu trennen und Komponenten von flüssigen Proben zu quantifizieren. Bei dieser Technik wird eine Lösung (erste Phase) durch eine Spalte gepumpt, die eine Verpackung von kleinen porösen Partikeln mit einer zweiten Phase gebunden an die Oberfläche enthält. Die verschiedenen Solubilities der Probe Komponenten in den beiden Phasen dazu führen, dass die Komponenten durch die Säule mit unterschiedlichen durchschnittlichen Geschwindigkeiten, wodurch eine Trennung dieser Komponenten verschieben. Die gepumpte Lösung heißt der mobilen Phase, während die Phase in der Spalte der stationären Phase genannt wird.

Es gibt verschiedene Modi der Flüssigchromatographie, je nach Art der stationären oder mobilen Phase eingesetzt. Dieses Experiment verwendet umgekehrt-Phase Chromatographie, wo die stationäre Phase unpolar, und die mobile Phase ist polar. Die stationäre Phase eingesetzt werden ist C18 Kohlenwasserstoff-Gruppen auf 3 µm Silica-Partikel gebunden, während die mobile Phase eine wässrige Puffer mit polaren organischen Modifier (Acetonitril ist) hinzugefügt, um seine Medikamentenfreisetzende Stärke variieren. In dieser Form kann die Kieselsäure für Proben verwendet werden, die wasserlöslich ist, bietet ein breites Anwendungsspektrum. In diesem Experiment werden die Mischungen der drei Komponenten häufig in Diät Softdrinks (nämlich Koffein Natriumbenzoat und Aspartam) getrennt. Sieben vorbereitete Lösungen mit bekannten Beträge der drei Arten dienen, und ihre Chromatogramme werden dann aufgezeichnet.

Principles

Während ein HPLC-Experiment nimmt eine Hochdruckpumpe die mobile Phase aus einem Reservoir durch einen Injektor. Er reist dann durch eine Reverse-Phase C18-verpackten Spalte für Trennung der Komponenten. Schließlich zieht die mobile Phase in eine Detektorzelle, wo die Extinktion bei 220 nm und endet in einer Abfallflasche gemessen wird. Die Höhe der Zeitaufwand für eine Komponente vom Injektor Hafen zum Detektor zu reisen ist die Retentionszeit genannt.

Ein liquid Chromatograph ist in diesem Experiment verwendet wo erfolgt die Trennung auf einer Reverse-Phase-Spalte. Die Spalte Abmessungen sind 3 mm (Innendurchmesser) x 100 mm und die Kieselsäure (3 µm Partikelgröße) Verpackung mit C18 Octadecylsilane (ODS) funktionalisiert wird. Eine Rheodyne 6-Port rotary Einspritzventil wird verwendet, um zunächst die Probe in einer kleinen Schleife speichern und führt die Probe in der mobilen Phase beim Drehen des Ventils.

Erkennung ist durch Absorption Spektroskopie bei einer Wellenlänge von 220 nm. Dieses Experiment ausgeführt werden kann, bei 254 nm, wenn ein Melder nicht variabel ist. Daten vom Melder hat einen analogen Spannungsausgang, gemessen mit einem digitalen Multimeter (DMM), und lesen Sie von einem Computer mit einer Daten-Übernahme-Programm geladen. Die daraus resultierende Chromatogramm hat eine Spitze für jede Komponente in der Probe. Für dieses Experiment eluieren aller drei Komponenten innerhalb von 5 Minuten.

Dieses Experiment verwendet eine einzelne mobile Phase und Pumpe, die eine isokratische mobile Phase genannt wird. Für Proben, die schwer zu trennen sind, kann eine Farbverlauf mobile Phase verwendet werden. Dies ist bei die erste mobilen Phase in erster Linie eine wässrige ist und im Laufe der Zeit eine zweite organische mobile Phase allmählich die insgesamt mobile Phase hinzugefügt. Diese Methode löst die Polarität dieser Phase im Laufe der Zeit die senkt der Retentionszeiten der Komponenten und funktioniert ähnlich wie ein Temperaturgradient auf einen Gaschromatographen. Es gibt einige Fälle, wo die Spalte (in der Regel auf 40 ° C) erhitzt wird, die nimmt Aufbewahrung Zeitfehler im Zusammenhang mit einer Änderung der Umgebungstemperatur.

Im Reverse-Phase-HPLC ist die Spalte stationäre Phase Verpackung in der Regel eine C4, C8 und C18 Verpackung. Die C4-Spalten sind in erster Linie für Proteine mit großen Molekulargewichten C18 Spalten für Peptide und einfache Beispiele mit niedrigeren Molmassen sind.

Erkennung durch Absorption Spektroskopie ist mit überwältigender Mehrheit die Methode der Wahl, da die Absorptionsspektren der Komponenten alle leicht zugänglich sind. Einige Systeme verwenden elektrochemische Messungen, wie Leitfähigkeit oder strommesstechnik, als ihre Nachweismethode.

Für dieses Experiment die mobile Phase ist in erster Linie 20 % Acetonitril und 80 % gereinigte deionisiertes Wasser (DI). Eine kleine Menge an Essigsäure wird hinzugefügt, um den pH-Wert der mobilen Phase zu senken, hält die Silanol in der stationären Nachdruckphase in einem undissoziierten Zustand. Dies reduziert die Adsorption Spitze von Tailing, schmalere Spitzen geben. Dann ist der pH-Wert eingestellt, mit 40 % Natriumhydroxid, den pH-Wert zu erhöhen und verringern die Retentionszeiten der Komponenten.

Jede Gruppe nutzt eine Reihe von den 7 Ampullen mit verschiedenen Konzentrationen von Standardlösungen (Tabelle 1). Die ersten 3 werden verwendet, um jede Spitze zu identifizieren, und die letzten 4 sind zur Grafikerstellung Kalibrierung für jede Komponente. Maßstäbe 1 – 3 sind auch für die Kalibrierung-Diagramm verwendet.

Anzahl	Koffein (mL)	Benzoat (mL)	Aspartam (mL)
1	4	0	0
2	0	4	0
3	0	0	4
4	1	1	1
5	2	2	2
6	3	3	3
7	5	5	5

Tabelle 1. Mengen an Lager Standards verwendet, um die 7 bereitgestellten Arbeitsstandards vorbereiten (Gesamtvolumen von jedem Standard ist 50 mL).

Procedure

(1) macht der mobilen Phase Bereiten Sie die mobile Phase von ca. 1,5 L Trinkwasser DI 400 mL Acetonitril hinzufügen. 2,4 mL Eisessig sorgfältig diese Projektmappe hinzufügen. Verdünnen Sie die Lösung für ein Gesamtvolumen von 2,0 L in einem volumetrischen Kolben mit gereinigtem DI Wasser. Die resultierende Lösung sollte einen pH-Wert zwischen 2,8 bis 3.2 aufweisen. Stellen Sie den pH-Wert auf 4.2 durch Zugabe von 40 % Natronlauge tropfenweise mit dem Einsatz von einem kalibrierten digital pH-Meter. Fügen Sie sehr langsam, sobald der pH-Wert 4.0 erreicht. Dies dauert rund 50 Tropfen zu erreichen. Filtern Sie die mobile Phase durch ein 0,47-µm-Nylon 66-Membranfilter unter Vakuum um die Lösung zu entgasen und Feststoffe zu entfernen, die die chromatographische Säule stecken könnte. Es ist wichtig zu entgasen die mobile Phase zu vermeiden, dass eine Blase, die entweder eine Lücke in der stationären Phase am Einlass der Spalte verursachen oder Arbeit ihren Weg in der Detektorzelle verursacht Instabilität mit der UV-Absorption. 2. erstellen die Komponentenlösungen Die drei Komponenten, die getroffen werden müssen sind Koffein (0,8 mg/mL), Kalium-Benzoat (1,4 mg/mL) und Aspartam (L-Aspartyl-L-Phenylalanin Methylester) (6,0 mg/mL). Diese Konzentrationen verdünnt einmal in der gleichen Weise setzen die Standards auf den Ebenen in den Soda-Proben gefunden. Eine volumetrische 500-mL-Flasche 0,40 g Koffein hinzufügen, dann auf die 500-mL-Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen. Eine volumetrische 500-mL-Flasche 0,70 g Natriumbenzoat hinzufügen, dann auf die 500-mL-Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen. Eine volumetrische 100 mL-Flasche 0,60 g von Aspartam hinzufügen, dann auf den 100-mL-Markierung mit VE-Wasser zu verdünnen. Legen Sie diese Lösung in einem Kühlschrank, Zersetzung während der Lagerung zu vermeiden. 3. machen die 7 Standard-Lösungen Alle drei Komponenten haben unterschiedliche Verteilung Koeffizienten, die beeinflusst, wie jeder mit den beiden Phasen interagiert. Je größer der Verteilung Koeffizient, desto mehr Zeit verbringt die Komponente in der stationären Phase, was zu längerer Verweildauer in den Detektor erreichen Zeiten. Nach der Tabelle in Tabelle 1, pipettieren die korrekte Menge der einzelnen Komponenten in eine volumetrische 50-mL-Flasche. Verdünnen Sie die Stammlösungen, die 50-mL-Markierung auf die volumetrische Fläschchen mit mobilen Phase. Gießen Sie jede standard-Lösung in beschrifteten kleinen Fläschchen in einem Probenrack. Die Regale von Proben im Kühlschrank, zusammen mit den restlichen Lösungen in die volumetrische 50-mL-Fläschchen aufbewahren. 4. überprüfen die Grundeinstellungen der HPLC-Anlage Bestätigen Sie, dass die Abwasserlinie in einem Abfallbehälter und ist nicht wieder in der mobilen Phase recycling. Stellen Sie sicher, dass die Durchflussmenge der mobilen Phase auf 0,5 mL/min eingestellt ist. Dies ist hoch genug, um ermöglichen allen Gipfeln eluieren innerhalb von 5 min und langsam genug, um schöne Auflösung zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass die minimalen und maximalen Druck und die Durchflussmenge auf die korrekten Werte auf der Vorderseite der Lösungsmittel Delivery Systems (die Pumpe) festgelegt sind. Minimale Druckeinstellung: 250 Psi (Dies ist die Pumpe abgeschaltet, wenn ein Leck auftritt). Maximale Druckeinstellung: 4.000 Psi (Dies ist zum Schutz der Pumpe vor dem brechen, wenn ein Clog bildet). Drücken Sie “Null” auf den Detektor Frontplatte um die Leerzeichen gesetzt (die leere ist die reine mobile Phase). Spülen einer 100 µL Spritze mit entionisiertem Wasser, dann mit mehreren Bänden eines Arbeitsstandards werden analysiert, und füllen die Spritze mit der Lösung. Beginnen Sie mit 3 Einkomponenten-Proben, wodurch für die Ermittlung der Höhepunkt jeder Komponente von Interesse. 5. manuell Einspritzen der Probe und Datenerhebung Injizieren Sie mit dem Injektor Griff in Ladeposition langsam 100 µL der Lösung durch das Septum Port. Überprüfen Sie, ob Datenbeschaffungsprogramm ist für die Datensammlung für 300 s, die genügend für alle 3 Gipfel Zeit, durch den Detektor eluieren. Wenn Sie bereit zum Starten der Testversion, drehen Sie den Injektor Griff in die Spritzen-Position (die Probe in der mobilen Phase injiziert) und klicken Sie auf “Test starten” auf dem Computer Datenbeschaffungsprogramm sofort. Erscheinen Sie für Standards 1-3, nur einer der drei sequenziellen Gipfel auf dem Bildschirm während des Laufs (Abbildung 1). Einmal 300 s vergangen, die Datenerhebung sendet eine Aufforderung zum Speichern der Datei. Sichern Sie die Daten unter einem passenden Dateinamen (z. B.STD #1). Beachten Sie die Zeit in Sekunden für die Peak von jeder Studie, die bei der Ermittlung dieser Komponente verwendet wird. Ziehen Sie die Spritze aus dem Septum, und wiederholen Sie den Vorgang für jede der verbleibenden Arbeitsstandards, mit der gleichen Zeit pro Chromatogramm wie aus dem ersten Lauf ermittelt. Abbildung 1: Das Chromatogramm der 3 Komponenten. Von links nach rechts sind sie Koffein, Aspartam und Natriumbenzoat. (6) die Proben der Diät Limonaden Diet Coke, Diet Pepsi und Coke Zero sind die “unbekannten”. Sie haben in offenen Behältern über Nacht get rid of die Kohlensäure ausgelassen worden wie Luftblasen nicht gut für die HPLC-Anlage sind. Dies beseitigt ausreichend keine Gase in den Proben. Ziehen Sie etwa 2 mL die Diätsoda in einer Kunststoffspritze. Legen Sie die Filterspitze auf die Spritze über Luer-Lok durch Drehen an Ort. Drücken Sie die Flüssigkeit in der Spritze durch den Filter und in ein kleines Glas-Fläschchen. Dies beseitigt unerwünschte Partikel, die potenziell die Trennsäule verstopfen könnten. Jede Probe mit einer gleichen Menge von VE-Wasser zu verdünnen, so sind sie bei 50 % Reinheit. Injizieren Sie 100 µL der Probe in die Probenschleife, und laufen Sie Studien mit den gleichen Parametern wie die Standards. (7) Berechnungen Berechnen Sie von den Konzentrationen der Komponentenlösungen die Konzentration aller Komponenten in den Standards, basierend auf die Verdünnungen, die für die 7 Proben vorgenommen wurden. Bestimmen Sie Peakflächen auf die Chromatogramme für jeden Standard und der unbekannten Proben durch die dreieckigen Methode, die Höhe Spitzenzeiten die Breite auf ½ Höhe (Abbildung 2 entspricht). Treten Sie nach der Festlegung, welchen Gipfel entspricht jede Komponente basiert auf den Zeitaufwand für die einzelnen Komponenten zu ihren jeweiligen Höhepunkt zeigen diese Peakflächen in einem Tabellenkalkulationsprogramm auf dem Computer. Kalibrierkurven von Peak vs. Konzentration (mg/L) in den Normen für alle drei Komponenten zu erstellen. Bestimmen der kleinsten Quadrate für jede Kalibrierungskurve passen. Berechnen Sie die Konzentration der einzelnen Komponenten in der Diät-Limonaden aus der Peakflächen der HPLC-Studien für die Beispiele gezeigt. Denken Sie daran, dass die Diät-Cola, um den Faktor 2 vor dem Einspritzen in das HPLC-System verdünnt wurde. Berechnen Sie die Menge in mg/L, der einzelnen Komponenten in der Diät-Limonaden. Basierend auf den Ergebnissen, berechnen Sie die Milligramm der einzelnen Komponenten in der 12-Unze-Dose Soda gefunden. 12 Unzen = 354,9 mL zu übernehmen. Abbildung 2. Ein einfaches Beispiel für einer Kurve Peakhöhe und Breite, die multipliziert werden sollen (Peakhöhe x Breite in ½ Höhe).

Results

The HPLC chromatograms are able to quantify each of the 3 components for all the samples based upon the calibration curves of the standards (Figure 3).

From this set of experiments, it was determined that a 12-oz can of these diet sodas contained the following amounts of each component:

Diet Coke: 50.5 mg caffeine; 217.6 mg aspartame; 83.6 mg benzoate.
Coke Zero: 43.1 mg caffeine; 124.9 mg aspartame; 85.3 mg benzoate.
Diet Pepsi: 34.1 mg caffeine; 184.7 mg aspartame; 79.5 mg benzoate.

Not surprisingly, all 3 had roughly the same amount of benzoate, as it is just a preservative. The Coke products had a bit more caffeine, and the Coke Zero had much less aspartame than the other two sodas, as it also includes citric acid for some flavoring.

The following numbers are the actual amounts of caffeine and aspartame in a 12-oz can of the 3 diet sodas (The caffeine content was obtained from the Coca-Cola and Pepsi websites. The aspartame content was obtained from both LiveStrong.com and DiabetesSelfManagement.com.):

Diet Coke: 46 mg caffeine; 187.5 mg aspartame
Coke Zero: 34 mg caffeine; 87.0 mg aspartame
Diet Pepsi: 35 mg caffeine; 177.0 mg aspartame

Sample Calculations (Table 2):

Concentration of caffeine in STD#1: The component solution for caffeine had 0.400 g of caffeine diluted to 500 mL = 0.500 L → 0.800 g/L = 0.800 mg/mL.

STD#1 had 1 mL of this solution diluted to 50.0 mL
0.800 mg/mL * (1.0 mL / 50.0 mL) = 0.016 mg/mL = 16.0 mg/L.

STD#2 had 2 mL of this solution diluted to 50.0 mL
0.800 mg/mL * (2.0 mL / 50.0 mL) = 0.032 mg/mL = 32.0 mg/L.

The results from the three calibration graphs (Figure 4) yielded the following equations:

Caffeine Peak Area = 0.1583*[Caffeine mg/L] – 0.574
Aspartame Peak Area = 0.02696*[Aspartame mg/L] – 0.405
Benzoate Peak Area = 0.1363*[Benzoate mg/L] – 1.192

Diet Coke: Caffeine Peak Area = 10.68 = 0.1583*[Caffeine mg/L] – 0.574

[Caffeine mg/L] = (10.68 + 0.574)/ (0.1583) = 71.1 mg/L in the injected sample.

Since the sample was diluted by a factor of 2, the Diet Coke had 141.2 mg/L caffeine.

The amount per 12-oz can = (141.2 mg/L)(0.3549 mL/12-oz can) = 50.5 mg caffeine/can.

Figure 3. The HPLC chromatograms of the 5 standards and the 3 samples.

Figure 4. The calibration curves for each of the 3 components.

Table 2. The data tables for the HPLC trials used for generating the calibration curves.

Applications and Summary

HPLC is a widely-used technique in the separation and detection for many applications. It is ideal for non-volatile compounds, as gas chromatography (GC) requires that the samples are in their gas phase. Non-volatile compounds include sugars, vitamins, drugs, and metabolites. Also, it is non-destructive, which allows each component to be collected for further analysis (such as mass spectrometry). The mobile phases are practically unlimited, which allows changes to the polarity of pH to achieve better resolution. The use of gradient mobile phases allows for these changes during the actual trials.

There has been concern over the possible health issues that may be associated with the artificial sweetener aspartame. Current product labeling does not show the amount of these components inside of the diet beverages. This method allows for quantifying these amounts, along with the caffeine and benzoate.

Other applications include determining the amounts of pesticides in water; determining the amount of acetaminophen or ibuprofen in pain reliever tablets; determining whether there are performance-enhancing drugs present in the bloodstream of athletes; or simply determining the presence of drugs in a crime lab. While the concentrations of these samples, and often the identity of the components, can be readily determined, the one limitation is that several samples could have close to identical retention times, resulting in co-eluting.

Transcript

High-performance liquid chromatography, or HPLC, is a highly versatile technique that separates components of a liquid mixture based on their different interactions with a stationary phase.

HPLC is an adaptation of column chromatography. In column chromatography, a column is packed with micro-scale beads called the stationary phase. The stationary phase beads are functionalized with chemical groups that induce an interaction between the bead and the components of a mixture located in the liquid, or mobile phase. As the mixture flows through the column, the components interact with the stationary phase differently.

In HPLC, column chromatography is performed at a higher flow rate, and therefore higher pressure, than classical column chromatography. This enables the use of smaller stationary phase beads with a greater surface area to volume ratio, which greatly increases the interaction of the stationary phase and components in the mobile phase.

This video will introduce the basics of the operation of HPLC by demonstrating the separation of components of various diet sodas.

There are two types of HPLC used in the laboratory: analytical, and preparative. In analytical HPLC, the instrument is used to identify components of a small volume, and the analyzed sample is then discarded as waste. In preparative HPLC, the instrument is used to purify a mixture and a desired amount of each component is collected in fractions.

The HPLC instrumentation consists of a series of simple components. First, the mobile phase, held in solvent reservoirs, is pumped through the system by one or more pumps at a constant flow rate. The sample is injected into the mobile phase stream by the sample injector. The sample, diluted by the mobile phase, is then delivered to the HPLC column, where the components of the sample are separated. The components are then analyzed by the detector, and either saved in fractions for later use, or transferred to a waste bottle.

The HPLC column is the key component to the system. It is composed of a metal or plastic cylinder, packed with micro-scale beads of stationary phase, or chromatography resin. The sample mixture flows through the packed particle bed at a constant flow rate and each component interacts with the stationary phase as it flows by.

The compounds interact with the stationary phase differently, and therefore travels down the length of the column to the detector at a different rate. The time required for a component to exit the column, or elute, is called the retention time. The result is a plot of retention time vs. intensity, or a chromatogram. The retention time is used to identify the component. The peak size, specifically the area under the peak, is used to quantify the amount of the compound in the initial solution.

The choice of stationary phase depends on the properties of the components in the sample mixture. The most commonly used stationary phase is silica beads, as they are an inert nonpolar material that forms micro-scale beads, and achieves sufficient packing density. The most common type of HPLC is reversed-phase chromatography, which utilizes a hydrophobic stationary phase, typically silica beads with C18 chains bonded to the beads’ surface. The components are eluted in order of decreasing polarity.

The mobile phase used in reversed-phase chromatography is typically a mixture of water and an organic solvent, such as acetonitrile. Depending on the sample, the mobile phase can remain a constant ratio of water and organic solvent, known as isocratic mode. However, this can lead to broad peaks, in the case of high water content, or overlapping peaks—in the case of high organic content.

The mobile phase ratio can also be changed linearly or stepwise during the separation, to create a mobile phase gradient. A gradient elution can prevent peak broadening of the less polar components, thereby improving the separation and shortening the elution time.

Now that the basics of HPLC have been outlined, the HPLC technique will be demonstrated in the laboratory. In this experiment, HPLC will be used to separate and quantify three common components of diet soda.

First, to prepare the mobile phase, add 400 mL of acetonitrile to 1.5 L of purified deionized water. Then carefully add 2.4 mL of glacial acetic acid. Dilute the solution to a total volume of 2 L. The resulting solution should have a pH between 2.8 and 3.2.

Adjust the pH to 4.2 by adding 40% NaOH, drop-wise to the stirring solution, with the use of a calibrated pH meter.

Filter the mobile phase through a 0.47-μm membrane filter under vacuum to degas the solution and remove solids that could plug the column. It is important to degas the solution, as bubbles can cause voids in the stationary phase, or work their way to the detector cell and cause instability in measurements.

Prepare three component solutions of caffeine, benzoate, and aspartame, which are three typical components of diet sodas. These component solutions are then used to prepare the standard solutions that will be utilized to determine the unknowns. Prepare 500 mL of the caffeine and benzoate solutions.

Prepare 100 mL of the aspartame component solution. Store the solution in the refrigerator when not in use to avoid decomposition.

Next, prepare 7 standard solutions, each with different concentrations of caffeine, benzoate, and aspartame. Pipet the proper amount of each component into a volumetric flask, and dilute to the 50-mL mark with mobile phase.

The first 3 solutions each contain one component, to enable peak identification. The other 4 solutions contain a range of concentrations of all 3 components, in order to correlate peak height to concentration.

Pour each standard solution into a labeled vial in a sample rack. Store the sample rack with samples and the remaining solutions in the refrigerator.

First, set up the mobile phase and waste containers. Ensure that the waste lines are fed into a waste container, and are not recycling back into the mobile phase. Ensure that the inlet mobile phase line is fed into the mobile phase container.

Verify that the flow rate of the mobile phase is set to 0.5 mL/min. This flow rate will enable all components to elute within 5 min, but is slow enough to ensure resolution of individual peaks.

Next, verify the minimum and maximum pressures on the solvent delivery system. These settings shut the pump off in case of a leak or clog, respectively.

Press “zero” on the detectors front panel, to set the blank. Rinse a 100-μL syringe with deionized water, then with several volumes of 1 of the 7 working standards. Then fill the syringe with that solution. Begin with the 3 single-component samples in order to identify the peak of each component.

Next, manually inject the solution, by placing the injector handle in the load position. Slowly inject the 100 μL of solution through the septum port.

Verify that the data collection program is set to collect data for 300 s, which allows for enough time for all 3 peaks to elute through the detector. When ready to begin the trial, rotate the injector handle to the inject position, in order to inject the sample into the mobile phase. Immediately, click “Start Trial” on the data collection program. When the scan is complete, repeat the process for each of the 7 standard solutions. For each of the first 3 standards, only one of the 3 peaks appears. Note the location of the peak, which is used to identify the component.

Select 3 diet soda samples, and allow them to sit out in open containers overnight to remove the carbonation.

After overnight degassing, draw approximately 3 mL of each diet soda into a plastic syringe. Next, attach a filter tip to the syringe and push the soda through the filter into a glass vial, in order to remove any solid particulates.

Dilute 2 mL of each sample with 2 mL of the mobile phase to decrease the soda concentration by half.

Draw 100 μL of one of the soda samples into a syringe, and inject it into the sample loop. Run the trial with identical parameters to the standard solutions. Repeat for each soda sample.

First, correlate the peak areas of the standard samples to the known concentrations. To do so, determine the peak areas on the chromatographs for each standard sample using the triangular method. Calculate the peak height times with the width at half of the height, and use this value as the peak area.

Using the peak area and known concentrations create a calibration curve for each component, and determine the least-squares fit for each calibration curve.

Calculate the concentration of each component in the diet sodas from the peak areas. Remember that the sodas were all diluted by a factor of 2 prior to injection into the HPLC. Based on these results, calculate the mg of each component in a 12-oz can of soda.

Unsurprisingly, all 3 sodas tested contained roughly the same amount of the preservative benzoate. However, the Coke products contained more caffeine. The calculated values for all components correlated well to reported values by the manufacturers.

HPLC is a highly versatile instrument, which is used in a wide range of analyses.

HPLC is often used to purify peptide molecules. In this example, transmembrane peptide complexes were prepared, and then stabilized by oxidative crosslinking the proteins with disulfide bonds.

The proteins were then dissolved in formic acid, and purified using reversed phase HPLC. The sample was then eluted using a linear gradient of two solvents, and the purity confirmed with mass spectrometry.

HPLC can also be used to identify organic compounds synthesized in the lab. In the Miller-Urey experiment, the abiotic synthesis of organic compounds on primordial earth was studied. Primordial gases, such as methane and ammonia, were introduced to a flask containing water, simulating early oceans. Electrical discharge was then applied, imitating lightning on primordial earth.

The water was then analyzed using HPLC coupled with mass spectrometry, and compared to known amino acid standards. 23 amino acids were synthesized and identified in this experiment.

You’ve just watched JoVE’s introduction to HPLC. You should now understand the basics of running the instrument, and analyzing the resultant data.

Thanks for watching!

Cite This

JoVE Science Education Database. JoVE Science Education. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). JoVE, Cambridge, MA, (2023).