Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Microbiology

Konjugation: Eine Methode zur Übertragung der Ampicillinresistenz vom Spender auf den Empfänger E. coli

Overview

Quelle: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Department of Microbiology, Boston University School of Medicine, National Emerging Infections Diseases Laboratories, Boston, MA

Erstmals 1946 von Lederberg und Tatum entdeckt, ist die Konjugation eine Form des horizontalen Gentransfers zwischen Bakterien, die auf direkten physischen Kontakt zwischen zwei Bakterienzellen beruht (1). Im Gegensatz zu anderen Formen des Gentransfers, wie Transformation oder Transduktion, ist konjugation ein natürlich vorkommender Prozess, bei dem DNA unidirektional von einer Spenderzelle in eine Empfängerzelle abgesondert wird. Diese Richtung und die Fähigkeit für diesen Prozess, die genetische Vielfalt von Bakterien zu erhöhen, hat der Konjugation den Ruf als eine Form der bakteriellen "Paarung" verliehen, von der angenommen wird, dass sie wesentlich zum jüngsten Anstieg der antibiotikaresistenten Bakterien (2, 3). Durch den Einsatz selektiver Drücke, z. B. durch den Einsatz von Antibiotika, wurde die Konjugation für den Einsatz im Labor manipuliert, was sie zu einem leistungsfähigen Werkzeug für den horizontalen Gentransfer zwischen Bakterien und in einigen Fällen von Bakterien auf Hefe, Pflanze und Tier macht. Zellen (4). Neben Anwendungen im Labor ist der Bakterielle-Eukaryote-Gentransfer durch Konjugation ein spannender Weg des DNA-Transfers mit einer Vielzahl möglicher biotechnischer Anwendungen und natürlich vorkommender Implikationen (5).

Die Konjugation wird vermutlich durch einen "zweistufigen Mechanismus" (6) funktioniert. Erstens muss die Spenderzelle, bevor dna übertragen werden kann, direkten Zell-zu-Zell-Kontakt mit dem Empfänger herstellen. Dieser Prozess wurde am besten in gram-negativen Bakterien charakterisiert, von denen die am meisten untersuchten Escherichia coliist. Der Zell-zu-Zell-Kontakt wird durch das Vorhandensein eines komplexen Netzes extrazellulärer Filamente auf dem Spender hergestellt, der als Geschlechtspilus bekannt ist, ein konjugatives Element, das durch das übertragbare Gen kodiert wird, das als F-Faktor (Fruchtbarkeit) (7, 8) bezeichnet wird. Neben der Herstellung eines Kontakts zwischen Spender und Empfänger werden mehrere Proteine über den Geschlechtspilus zum Empfängerzytoplasma transportiert, wodurch ein Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS) zwischen den beiden Zellen gebildet wird, eine notwendige Struktur für den zweiten Schritt der Konjugation, DNA-Transfer (6). Durch die Kombination dieser Funktion des Geschlechtspilus mit der Rollkreisreplikation der DNA ist die Spenderzelle in der Lage, DNA in Form eines transponierbaren Elements, wie eines Plasmids oder Transposons, durch ein "Shoot and Pump"-Modell (6) an den Empfänger zu übertragen. In diesem Fall ist das "Schießen" der Transport des Pilotproteins mit verknüpfter DNA durch das T4SS in die Empfängerzelle, und das "Pumpen" ist der aktive Transport von DNA zum Empfänger, ein Prozess, der vom T4SS abhängig ist und durch Kopplungsproteine katalysiert wird (6). Die in diesem Verfahren verwendete Maschinerie besteht aus einem Ursprung der Übertragungssequenz (oriT), die von der DNA in cis und trans-Genen bereitgestellt werden muss, die eine Relaxase, paarpaarbildung Komplex und Typ IV Kopplungsprotein kodieren, und kann in cis oder trans (9) vorhanden sein. Diese Relaxase spaltet die nic-Site innerhalb der OriT-Sequenz und heftet sich kovalent am 5' Ende des übertragenen Strangs an, um das Relaxosome zu produzieren, einen einsträngigen DNA-Relaxase-Komplex mit anderen Hilfsproteinen (9). Nach der Bildung verbindet sich das Relaxosom über das Kopplungsprotein Typ IV mit dem Paarungskomplex typ IV, das die Übertragung des ssDNA-Relaxase-Komplexes in Empfängerzellen durch den T4SS (10) ermöglicht. Einmal im Zytoplasma des Empfängers, kann sich die DNA in das Empfängergenom integrieren oder separat in Form eines Plasmids existieren, von denen beide die Expression ihrer Gene ermöglichen.

In diesem Experiment wurde der weit verbreitete Konjugationsspenderstamm E. coli WM3064 verwendet, um das Gen zur Ampicillinresistenz auf den Empfängerstamm E. coli J53 zu übertragen. Während beide Stämme der gramnegativen Bakterien gegen Tetracyclin resistent waren, hatte nur der Spenderstamm WM3064 das Gen für Ampicillinresistenz, für den im pWD2-oriT-Shuttlevektor kodiert, und war auxotroph bis Diaminopimelsäure (DAP) (11-13). Dieses Experiment bestand aus zwei Hauptschritten, der Vorbereitung von Spender- und Empfängerstämmen, gefolgt von der Übertragung des Ampicillinresistenzgens vom Spender zum Empfänger durch Konjugation (Abbildung 1).

Figure 1
Abbildung 1: Konjugationsschema. Dieser Schaltplan zeigt die erfolgreiche Übertragung eines Plasmids, nur ein Beispiel für ein transposierbares DNA-Element, von einer Spenderzelle zu einer Empfängerzelle mittels Konjugation. Bei Kontakt mit der Empfängerzelle durch die Spenderzelle über den Sexpilus repliziert sich das Plasmid durch Rollenkreisreplikation, bewegt sich durch den Multiproteinkomplex, der die beiden Zellen verbindet, und bildet ein neues vollwertiges Plasmid in der Empfängerzelle.

Durch die Inkubation einer Mischung aus Spender- und Empfängerzellen, die diese Zellen sukzessive in Gegenwart von Tetracyclin und DAP plattiert, ermöglichte dies die erfolgreiche Übertragung des Ampicillinresistenzgens. Nacheinander wurden Zellen, die aus dieser Mischung in Gegenwart von Tetracyclin und Ampicillin auswachsen, entfernt, alle Spenderzellen aufgrund des Mangels an DAP und alle Empfängerzellen entfernt, die möglicherweise nicht das Ampicillin-Resistenzgen gewonnen haben, was streng Empfänger-J53-Stamm ergibt. Bakterien, die ampicillinResistenz erworben haben (Abbildung 2). Nach der Durchführung wurde die erfolgreiche Übertragung des Ampicillinresistenzgens durch PCR bestätigt. Da die Konjugation erfolgreich war, enthielt der J53-Stamm von E. coli pWD2-oriT und war resistent gegen Ampicillin, und die Genkodierung für diese Resistenz ist durch PCR nachweisbar. Bei erfolglosem Erfolg hätte es jedoch keinen Nachweis des Ampicillinresistenzgens gegeben und Ampicillin würde immer noch als wirksames Antibiotikum gegen den J53-Stamm funktionieren.

Figure 2
Abbildung 2: Protokollschema. Dieser Schaltplan zeigt eine Übersicht über das vorgestellte Protokoll.

Figure 3A
Abbildung 3A: Die Bestätigung einer erfolgreichen Konjugation durch PCR. A) Die Gefrierbestände der konjugierten und negativen Kontrollproben wurden auf Agarplatten ausgestreift und eine Kolonie (rot) für die DNA-Isolierung ausgewählt.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Einrichtung

  1. Autoklav ca. 1L von Luria-Bertani medium (LB). Diese sterile LB wird verwendet, um ca. 5 ml LB mit 0,3 ml Diaminopimelsäure (DAP) herzustellen.
  2. Sammeln Sie folgende Platten: LB Agarplatten mit 1X Tet und 0,3 mM DAP, LB Agarplatten nur mit 1X Tet und LB Agarplatten nur mit 1X Amp/Tet.
  3. Stellen Sie sicher, dass einige Glycerin und eine Box mit vorsterilisierten Kunststoff Pipettenspitzen in der Nähe sind.
  4. Vor Beginn der Arbeiten mit Mikroben, sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. Tragen Sie immer die notwendige persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Labormantel und Handschuhe.
  5. Nach der Fertigstellung alle Oberflächen und Handschuhe mit 70% Ethanol sterilisieren und die Hände waschen.

2. Vorbereitung der Spender- und Empfängerstämme

  1. 5 ml Bakterienkulturen der Spender- und Empfängerstämme vorbereiten und bei 37 °C mit Belüftung und Schütteln bei 220 Umdrehungen pro Minute über Nacht anbauen. Der Spenderstamm sollte in LB mit 0,3 mM DAP angebaut werden.
  2. Drehen Sie 1 ml beider Kulturen (ca. 3000 U/min für 5 Minuten) und waschen Sie die Zellen mit PBS.
  3. Setzen Sie die Zellen in 500 l Phosphatgepufferte Saline (PBS) wieder aus.

3. Konjugation

  1. Kombinieren Sie 50 l Empfängerzellen mit 50 l Spenderzellen in einem Mikrozentrifugenrohr und mischen Sie sie durch Pipettieren.
  2. Die Zellmischung 1 Stunde bei 37 °C inkubieren. Dies wird die Effizienz der Konjugation vor und während des nächsten Beschichtungsschritts verbessern.
  3. Pipetten Sie 100 l des Zellgemisches auf eine Agarplatte mit 1X Tet und 0,3 mM DAP. Nicht auf dem Teller verteilen.
  4. Pipetten Sie 100 l der Empfängerzellkultur auf eine Agarplatte mit 1X Tet und 0,3 mM DAP. Nicht auf dem Teller verteilen.
  5. Beide Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  6. Verschrotten Sie die Konjugationszellmischung und die Empfängerzellkultur mit einem sterilen Zellschaber. Übertragen Sie die Zellen in ein steriles Mikrozentrifugenrohr und setzen Sie die Zellen in 1 ml PBS wieder auf.
  7. Wirbeln Sie die Zellen und drehen Sie sie sanft nach unten (ca. 3000 U/min für 5 Minuten).
  8. Setzen Sie die Zellen in 1 ml PBS wieder aus.
  9. Die Konjugationsreaktionszellmischung auf einer LB-Agarplatte nur mit 1X Amp/Tet vereiteln. Auf dieser Platte werden nur die Empfängerbakterien, die das Amp-Resistenzgen durch Konjugation erfolgreich gewonnen haben, voraussichtlich wachsen.
  10. Die Empfängerzellen nur mit 1X Tet auf eine LB-Agarplatte geben. Auf dieser Platte werden nur nicht konjugierte Empfängerbakterien erwartet, die nicht über das Amp-Resistenzgen verfügen.
  11. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  12. Wählen Sie einzelne Kolonien aus beiden Platten und verwenden Sie sie, um Übernachtkulturen in 5 ml Medien (37 °C mit Belüftung bei 220 Rpm) zu züchten.

4. DNA-Isolation

  1. Isolieren Sie DNA aus den zuvor hergestellten Kulturen mit 4,5 ml des gesamten Kulturvolumens durch DNA Miniprep.
  2. Um dies zu tun, elute die DNA mit 35 l Nuklease-freies Wasser.
  3. Reine DNA erzeugt ein Absorptionsverhältnis (A260/280) von etwa 1,8.
  4. Verwenden Sie die restlichen 0,5 ml jeder Kultur, um Glyzerinvorräte zuzubereiten, indem Sie eine 1:1-Mischung aus Bakterienkultur und 100% Glycerin herstellen.
  5. Lagern Sie die Gefriervorräte bei -80 °C.

5. Bestätigung der Plasmid-Transferkonjugation durch PCR

  1. Bereiten Sie zwei PCR-Master-Mixe vor, die jeweils einen anderen Satz von Vorwärts- und Rückwärtsprimern aufweisen, wobei einer auf ein 500 Base-Pair-Segment innerhalb des Ampicillin-Resistenz-Gens abzielt und der andere auf ein Segment innerhalb eines Housekeeping-Gens abzielt.
    1. Housekeeping-Genprimer wurden entwickelt, um ein DNA-Segment innerhalb des bakteriellen Gens zu verstärken, das für DNA-Gyrase B (14) kodiert.
    2. Die folgenden Reagenzienvolumina wurden verwendet, um 90 l jeder Mastermischung vorzubereiten:
      7,5 l von 10 m Vorwärtsgrundierung
      7,5 l von 10 m Reverse-Primer
      75 l mit 2X PCR Master Mix
  2. Bereiten Sie die folgenden sechs PCR-Reaktionen mit 15 L-Master-Mix, 10 ng Vorlagen-DNA und nukleasefreiem Wasser bis zu einem Endvolumen von 25 l vor.
    Konjugationsreaktion DNA und Ampicillin-Primer
    Konjugationsreaktion DNA und Housekeeping Primer
    Negative Kontroll-DNA und Ampicillin-Primer
    Negativkontroll-DNA und Housekeeping-Primer
    Keine DNA und Ampicillin-Primer
    Keine DNA- und Housekeeping-Primer
  3. Übertragen Sie diese Reaktionen auf eine PCR-Maschine mit vorgewärmten Block auf 98 C und beginnen Sie mit dem Thermocycling unter folgenden Bedingungen:
    98 °C für 30 Sekunden
    25-35 Zyklen von 98 °C für 5-10 Sekunden, 45-72 °C für 10 bis 30 Sekunden und 72 °C für 15-30 Sekunden pro kb
    72 °C für 5-10 Minuten
    Halten bei 4 °C
  4. Laden Sie alle sechs PCR-Reaktionen auf ein 1% Agarose-Gel und laufen Sie bei 150V für ca. 20 Minuten.
  5. Visualisieren Sie das PC-Produkt mit einem UV-Beleuchtungsgerät.

Bakterielle Zellen, wie E. coli,sind in der Lage, genetische Informationen von Zelle zu Zelle zu übertragen. Konjugation unterscheidet sich von anderen Mechanismen der DNA-Übertragung, wie Transduktion oder Transformation, insofern, als sie physischen Kontakt zwischen den Zellen erfordert.

Um fortzufahren, erfordert konjugation eine Spenderzelle, die die Fruchtbarkeit oder F, Faktor und eine Empfängerzelle ohne sie, eine F minus Zelle ausdrückt. Der Prozess erfordert zwei Schritte. Die erste ist die Etablierung eines direkten Zell-zu-Zell-Kontakts. Dazu erzeugt die Spenderzelle eine extrazelluläre fadenförmige Struktur, die als Sexpilus bezeichnet wird. Es wird dies genannt, da Konjugation eine Form der Paarung für asexuell reproduzierende Bakterien ist, aber es sollte beachtet werden, dass es sich nicht um eine wahre sexuelle Fortpflanzung handelt, da keine Gameten ausgetauscht werden und keine Nachkommen gebildet werden.

Der zweite Schritt ist die Lieferung von DNA an die Empfängerzelle. Nachdem der Sexpilus den Kontakt zwischen zwei Zellen herstellt, wird ein Kanal namens Typ IV-Sekretionssystem gebaut, das die Übertragung von DNA ermöglicht. Die Spenderzelle beginnt dann, die extrachromosomale DNA zu replizieren, die basierend auf dem Vorhandensein eines genetischen Elements, das als OriT oder Herkunft der Übertragung bekannt ist, ausgewählt wird. Ein Ende der neu replizierten DNA wird durch DNA-Proteinbindung in den Kanal eingefädelt. Da die DNA weiter repliziert wird, wird sie durch den Kanal gepumpt, erleichtert durch einen Komplex von Proteinen, die von Genen in der Nähe des OriT kodiert sind. Sobald die DNA vollständig übertragen ist, bildet sie entweder ein zusätzliches Chromosomenplasmid oder sie kann sich in das Chromosom der Empfängerzelle integrieren. Unabhängig vom Endpunkt der übertragenen DNA werden dann die Gene, die sie kodiert, exprimiert. Diese Genexpression kann verwendet werden, um eine erfolgreiche Konjugation zu bestätigen.

Betrachten Sie beispielsweise ein Szenario, in dem der Spenderstamm ampicillin-Resistenz ausdrückt und diese in der konjugierten DNA an das Empfängerbakterium weitergibt, aber der Empfängerstamm hat auch ein Tetracyclin-Resistenzgen, das nicht im Spender vorhanden ist. In diesem Fall, wenn die Zellen auf LB-Medien plattiert werden, die sowohl Tetracyclin als auch Ampicillin enthalten, sollten Kolonien nur aus erfolgreich konjugierten Bakterien wachsen, die beide Resistenz-Phänotypen exdrücken. Um eine erfolgreiche Konjugation weiter zu bestätigen, kann Plasmid-DNA aus diesen Kolonien geerntet werden und dann kann ein dna-spezifisch für das übertragene Plasmid mit Polymerase-Kettenreaktion oder PCR verstärkt werden. Wenn das PCR-Produkt auf einem Elektrophorese-Gel neben einer Leiter von Standardgrößen ausgeführt wird, sollte ein PCR-Fragment bekannter Größe auf dem Gel sichtbar sein, was eine erfolgreiche Konjugation bestätigt. In diesem Experiment wird ein Plasmid verwendet, um das Ampicillinresistenzgen über Konjugation von einem Spenderstamm auf einen tetracyclinresistenten Empfängerstamm zu übertragen. Danach, um die Konjugation zu bestätigen, wird das Konjugationsgemisch auf einem Teller inkubiert, der beide Antibiotika enthält und nur die transformierten Bakterien zurücklässt. Schließlich wird die erfolgreiche Konjugation mit PCR weiter bestätigt.

Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, ziehen Sie die entsprechende persönliche Schutzausrüstung an, einschließlich laborierter Kleidung und Handschuhe. Als nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol, um die Oberfläche abzuwischen.

Bei diesem Verfahren wird das Ampicillinresistenzgen vom WM3064-Stamm von E. coli über Konjugation auf den J53-Stamm von E. coli übertragen. Der Spenderstamm WM3064 ist resistent gegen Tetracyclin und Ampicillin und erfordert Diaminopimelsäure, oder DAP, um zu wachsen. Die Empfängersorte J53 ist nur gegen Tetracyclin resistent und erfordert kein DaP-Wachstum. Dies bedeutet, dass erfolgreich konjugierte Zellen gegen Tetracyclin und Ampicillin resistent sein und ohne DAP wachsen können.

Bereiten Sie die Spenderstammkultur vor, indem Sie fünf Milliliter LB mit 0,3 Millimoles DAP mit einem Schrott des gefrorenen Spenderstamms Glycerin-Bestand impfen. Bereiten Sie dann die Empfängersorte vor, indem Sie fünf Milliliter LB-Brühe ohne DAP mit einem Schrott des gefrorenen Empfängerstamms Glycerinbrühe impfen. Wachsen Sie diese Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Belüftung und Schütteln bei 220 RPM in einem schütteren Brutkasten. Sobald die Kulturen auf eine OD 600 von zwei gewachsen sind, entfernen Sie jeweils einen Milliliter Kultur und legen Sie diese in zwei neue separate 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren. Dann zentrifugieren Sie diese Aliquots bei 3000 U/min für fünf Minuten, um die Bakterienzellen zu pellet. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie jedes Pellet mit 250 Mikrolitern 1X PBS. Zentrifugieren Sie die Proben erneut und setzen Sie nach dem Wegwerfen des Überstandes jedes Pellet in 500 Mikroliter PBS wieder auf.

Um das Konjugationsverfahren zu beginnen, kombinieren Sie zunächst 50 Mikroliter Empfängerzellen mit 50 Mikrolitern Spenderzellen in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und mischen Sie sich durch sanftes Auf- und Abpfeifen. Als nächstes Pipette 100 Mikroliter der Empfängerzellkultur auf eine weitere 1X Tetracyclinplatte, die DAP enthält. Bereiten Sie als Nächstes Ihre Negativkontrolle vor, indem Sie 100 Mikroliter der Empfängerzellkultur nur auf eine nicht selektive Agarplatte, die DAP enthält, pipetieren. Dann inkubieren Sie die Konjugations- und Negativkontrollplatten über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag einen sterilen Zellschaber nehmen und Zellen von der Konjugationsplatte ernten, indem Sie Kolonien sammeln. Dann übertragen Sie die Kolonien in ein steriles 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr, das einen Milliliter 1X PBS enthält. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die Empfängerzellen von der anderen Platte zu sammeln.

Danach wirbeln die zu mischenden Proben aus. Nach dem Mischen die Rohre in eine Zentrifuge geben, um die Zellen sanft zu pelleten. Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie dann die Zellpellets in einem Milliliter PBS und wirbeln Sie die Rohre, um die Zellen wieder aufzuhängen. Pellet die Zellen wieder durch Zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand erneut und setzen Sie beide Zellpellets in einem Milliliter PBS wieder aus. Jetzt, mit einer sterilen Pipettenspitze, Platte 100 Mikroliter der Konjugationsreaktionszellmischung auf eine LB Agarplatte ohne DAP enthält 1X Tetracyclin und 1X Ampicillin. Wiederholen Sie das Beschichtungsverfahren mit 100 Mikrolitern einer zehnfachen Verdünnung desselben Zellgemisches in PBS auf eine andere LB-Agarplatte ohne DAP, die 1X Tetracyclin und 1X Ampicillin enthält.

Schließlich Pipette 100 Mikroliter der negativen Kontrollzellmischung auf eine einzelne LB-Agarplatte mit 1X Tetracyclin nur. Nach einer nächtlichen Inkubation bei 37 Grad Celsius sollten die Kolonien sichtbar sein. Mit einer sterilen Pipettenspitze eine einzelne Kolonie aus der Konjugationsreaktionsplatte pflücken und in ein Rohr geben, das fünf Milliliter selektiver LB-Medien enthält, die beide Antibiotika enthalten. Wiederholen Sie dann die Kolonieisolation, indem Sie eine einzelne Kolonie aus der Empfängerzellplatte auswählen. Wachsen Sie diese Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Belüftung bei 220 RPM.

Am nächsten Tag die Bankspitze mit 70% Ethanol abwischen und die Platten aus dem Inkubator entfernen. Verwenden Sie ein DNA-Mini-Vorbereitungskit, um DNA von 4 zu isolieren. 5 Milliliter jeder Kultur nach den Anweisungen des Herstellers. Nach Abschluss der DNA-Mini-Vorbereitung, elute die DNA mit 35 Mikroliter nukleasefreies Wasser. Verwenden Sie schließlich die verbleibende 0. 5 Milliliter jeder Kultur, um einen Milliliter Glycerinvorräte zuzubereiten, indem 0,5 Milliliter 100% Glycerin für eine Eins-zu-eins-Verdünnung hinzugefügt werden. Platzieren Sie diese Aliquots bei minus 80 Grad Celsius, bis sie gelagert werden.

Um die erfolgreiche Konjugation durch PCR zu bestätigen, bereiten Sie zunächst einen PCR-Master-Mix vor, indem Sie 75 Mikroliter 2X PCR-Master-Mix zu einem Mikrozentrifugenrohr hinzufügen. Fügen Sie dann 7,5 Mikroliter eines 10 Mikromolaren Vorwärtsprimers und einer 10 Mikromolaren-Reverse-Primer hinzu, die entwickelt wurde, um das Ampicillin-Resistenzgen aus dem Plasmid zu verstärken. Als nächstes bereiten Sie einen zweiten PCR-Master-Mix vor, indem Sie 75 Mikroliter 2X PCR-Master-Mix zu einem Mikrozentrifugenrohr hinzufügen und dann 7,5 Mikroliter eines 10 Mikromolaren-Vorwärtsprimers und 10 Mikromolaren-Reverseprimers hinzufügen, die entwickelt wurden, um ein Housekeeping-Gen, in diesem Fall DNA, zu verstärken. Gyrase B.

Fügen Sie nun 15 Mikroliter des ersten Master-Mix zu einer PCR-Röhre hinzu und fügen Sie dann 10 Nanogramm, etwa zwei Mikroliter der versuchsexperimentellen DNA der Schablone, in dieselbe Röhre ein. Bringen Sie die Reaktion auf ein Endvolumen von 25 Mikrolitern mit nukleasefreiem Wasser. Wiederholen Sie diese Schritte, um die verbleibenden fünf Reaktionen zu erzeugen, so dass die Rohre die hier gezeigten Komponenten enthalten. Übertragen Sie nun diese Reaktionen auf einen Thermocycler, bei dem der Block auf 98 Grad Celsius vorgeheizt ist, und starten Sie dann das Programm. Entfernen Sie nach Abschluss der PCR die Rohre von der Maschine. Dann laden Sie zwei Mikroliter jeder Reaktion gemischt mit zwei Mikroliter Nutzfarbstoff und vier Mikroliter eines Molekulargewichtsmarkers in aufeinander folgende Brunnen eines 1% Agarose-Gels. Stellen Sie das Gel auf 150 Volt für 20 Minuten. Schließlich visualisieren Sie das Gel mit einem UV-Beleuchtung.

In diesem Experiment wurde die erfolgreiche Übertragung des Ampicillinresistenzgens über die Konjugation mittels PCR bestätigt. Hier bei der Konjugatierten DNA und ampicillin primer sollte ein etwa 500 Basispaargroßes Band beobachtet werden, gut zwei in diesem Beispiel. Ein Housekeeping-Gen, DNA-Gyrase B, wurde in Brunnen drei und fünf mit konjugierter DNA bzw. Empfängerzell-DNA geladen. Bänder, die in diesen Brunnen beobachtet werden, wirken als positive Kontrolle, um sicherzustellen, dass die DNA-Vorlage vorhanden war und dass PCR erfolgreich war. Bänder sollten im Brunnen, der die Reaktion für die Empfängerzell-DNA und das Ampicillin-Primerpaar enthält, nicht beobachtet werden, gut vier in diesem Beispiel, da die Empfängerzellen nicht ampicillinresistent sind. Zusätzlich sollten keine Bänder in den Reaktionen ohne Vorlagen-DNA beobachtet werden, Brunnen sechs und sieben hier. Wenn diese Bedingungen erfüllt sind, wird dies die erfolgreiche Übertragung des Ampicillin-Resistenzgens bestätigen, was eine Ampicillinresistenz vom WM3064-Stamm von E. coli auf den J53-Stamm von E. coliverleiht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Wenn die Konjugation erfolgreich war, wird ein 500 Basispaar-pcR-Produkt in dem Brunnen beobachtet, in dem PCR-Reaktion 1 geladen wurde (Gut #2 in Abbildung 3B), während keine Bänder in dem Brunnen beobachtet werden, in dem PCR-Reaktion 3 geladen wurde (Well #4 in Abbildung 3B). Das Vorhandensein dieses Bandes bestätigt die erfolgreiche Übertragung des Ampicillinresistenzgens und verleiht damit eine Ampicillinresistenz gegen den J53-Stamm von E. coli.

Figure 3B
Abbildung 3B: Die Bestätigung einer erfolgreichen Konjugation durch PCR. B) Die PCR-Analyse wurde mit DNA durchgeführt, die aus der ausgewählten Kolonie isoliert wurde. Der Inhalt jedes Brunnens ist wie folgt: 1) DNA-Leiter, 2) Konjugations-DNA und Ampicillin-Primer, 3) Konjugations-DNA und Housekeeping-Primer, 4) Negative Kontroll-DNA und Ampicillin-Primer, 5) Negative Kontroll-DNA und Housekeeping-Primer, 6) Keine DNA und Ampicillin-Primer und 7) Keine DNA- und Negativkontrollgrundierungen. Das Vorhandensein eines PCR-Produkts mit einem Basispaar-PCR-Produkt von 500 ° Chr.-Band (gut 2) und das Fehlen dieses Produkts aus der PCR-Reaktion 3 (gut 4) bestätigen die erfolgreiche Konjugation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Konjugation ist ein natürlich vorkommender Prozess des horizontalen Gentransfers, der auf dem direkten Zell-zu-Zell-Kontakt einer Spenderzelle und einer Empfängerzelle beruht. Dieser Prozess wird unter allen Arten von Bakterien geteilt und war entscheidend für die bakterielle Evolution, vor allem Antibiotikaresistenz. Im Labor kann konjugation als effektive Methode des Gentransfers eingesetzt werden, die im Vergleich zu anderen Techniken viel weniger störend ist. Außerhalb des Labors bietet die Fähigkeit, DNA von Bakterien auf Eukaryoten über Konjugation zu übertragen, eine aufregende neue Möglichkeit der Gentherapie und das Verständnis der Implikationen dieser natürlich vorkommenden Gentransfers, z. B. die Beziehung zwischen bakterielle Infektion und Krebs, ist ein schnell aufkommendes Forschungsgebiet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Lederberg J, Tatum, E.L. Gene recombination in Escherichia coli Nature. 1946;158:558.
  2. Holmes R.K. J, M.G. Genetics: Exchange of Genetic Information. 4th Edition ed. Baron S, editor. Galveston, TX: University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996.
  3. Cruz F, Davies, J. Horizontal gene transfer and the origin of species: lessons from bacteria. Trends in Microbiology. 2000;8:128-33.
  4. Llosa M, Cruz, F. Bacterial conjugation: a potential tool for genomic engineering. Ressearch in Microbiology. 2005;156:1-6.
  5. Lacroix B, Citovsky, V. Transfer of DNA from Bacteria to Eukaryotes. mBio. 2016;7(4):1-9.
  6. Llosa M, et al. Bacterial conjugation: a two-step mechanism for
  7. DNA transport. Molecular Microbiology. 2002;45:1-8.
  8. Grohmann E, Muth, G., Espinosa, M. Conjugative Plasmid Transfer in Gram-Positive Bacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2003;67:277-301.
  9. Firth N, Ippen-Ihler, K, Skurray, RA. Structure and function of the F factor and mechanism of conjugation. Escherichia coli and salmonella: cellular and molecular biology. 1996;2:2377-401.
  10. Smillie C, Garcillan-Barcia MP, Francia MV, Rocha EPC, De La Cruz F. Mobility of Plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2010;74(3):434-52.
  11. Cascales E. Definition of a Bacterial Type IV Secretion Pathway for a DNA Substrate. 2004;304(5674):1170-3.
  12. Wang P, Yu Z, Li B, Cai X, Zeng Z, Chen X, et al. Development of an efficient conjugation-based genetic manipulation system for Pseudoalteromonas. Microbial Cell Factories. 2015;14(1):11.
  13. Yi H, Cho YJ, Yong D, Chun J. Genome Sequence of Escherichia coli J53, a Reference Strain for Genetic Studies. Journal of Bacteriology. 2012;194(14):3742-3.
  14. Baumann RLB, E. H.; Wiseman, J. S.; Vaal, M.; Nichols, J. S. Inhibition of Escherichia coli Growth and Diaminopimelic Acid Epimerase by 3-Chlorodiaminopimelic Acid. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1988;32:1119-23.
  15. Rocha D, Santos, CS, Pacheco LG. Bacterial reference genes for gene expression studies by RT-qPCR: survey and analysis. Antonie Van Leeuwenhoek. 2015;108:685-93.
Konjugation: Eine Methode zur Übertragung der Ampicillinresistenz vom Spender auf den Empfänger <em>E. coli</em>
Play Video
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter