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Biology

भाजित Ubiquitin आधार झिल्ली खमीर (मिथक) दो - हाइब्रिड सिस्टम: प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण

Published: February 1, 2010 doi: 10.3791/1698
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Biochemistry, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Terrence Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research (CCBR), University of Toronto

Summary

मिथकः क्षणिक और स्थिर मॉडल जीव Saccharomyces cerevisiae में व्यक्त कर रहे हैं कि प्रोटीन के बीच बातचीत के संवेदनशील पता लगाने की अनुमति देता है. यह सफलतापूर्वक किया गया है exogenous और खमीर अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के अध्ययन के क्रम में एक उच्च throughput ढंग से उनकी बातचीत भागीदारों की पहचान करने के लिए लागू है.

Abstract

अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के मौलिक जैविक और नैदानिक ​​महत्व पूर्ण लंबाई transmembrane प्रोटीन के लिए प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (पीपीआई) के उच्च throughput पहचान के लिए एक खमीर आधारित प्रणाली के विकास को प्रेरित किया. यह अंत करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला विभाजन ubiquitin आधारित झिल्ली (मिथक) खमीर दो संकर प्रणाली विकसित की है. इस तकनीक क्षणिक और स्थिर प्रोटीन का उपयोग कर बातचीत के संवेदनशील पता लगाने के लिए अनुमति देता है

Protocol

1. पृष्ठभूमि जानकारी

प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत (PPIs) सभी सेलुलर प्रक्रियाओं गवर्निंग में शामिल मौलिक निर्माण ब्लॉकों हैं. नतीजतन, यह आवश्यक है कि सभी बातचीत कसकर क्रम में सेलुलर homeostasis को बनाए रखने के लिए, इस जैविक संतुलन में बदलाव के रूप में आमतौर पर रोग और कैंसर सेल परिवर्तन में एक भूमिका निभाता है विनियमित रहे हैं. झिल्ली जुड़े प्रोटीन प्रोटीन का सबसे biologically महत्वपूर्ण वर्ग के बीच के रूप में वे जटिल संकेत cascades आरंभ कर सकते हैं और दोनों और दवाओं सहित विभिन्न अणुओं है, जो स्वास्थ्य देखभाल के क्षेत्र में हाल ही में महत्व के से संबंधित समस्याओं के रूप में किया गया है, आयात और निर्यात मध्यस्थता दवा प्रतिरोध तेजी से सामान्य हो गए हैं. इस प्रोटीन वर्ग की जटिलता में अंतर्दृष्टि पाने उनकी बातचीत भागीदारों की पहचान करने की आवश्यकता है. ऐसे भागीदारों की खोज साबित चुनौतीपूर्ण है, के रूप में अक्सर यह कठोर परिस्थितियों है कि प्रत्येक झिल्ली बाध्य प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए की आवश्यकता है. [1].

अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के मौलिक जैविक और नैदानिक ​​महत्व पूर्ण लंबाई transmembrane प्रोटीन के लिए उच्च throughput पीपीआई की पहचान के लिए एक खमीर आधारित प्रणाली के विकास के लिए प्रेरित किया. यह अंत करने के लिए, हम विभाजन ubiquitin आधारित झिल्ली खमीर दो हाइब्रिड (मिथक) प्रणाली [2-4] विकसित की है. इस उपकरण क्षणिक और स्थिर प्रोटीन बातचीत के संवेदनशील पता लगाने के लिए अनुमति देता है. यह सफलतापूर्वक किया गया है exogenous और अंतर्जात मॉडल जीव Saccharomyces cerevisiae में व्यक्त प्रोटीन [3-7] के अध्ययन के लिए लागू मिथक है कि दो moieties में ubiquitin अलग हो सकता अवलोकन के लाभ लेता है: सी - टर्मिनल (सी यूबी) आधा और आधा एन टर्मिनल (NubI) vivo अध्ययन में पता चला है कि इन अनायास के लिए अपने उच्च आत्मीयता के कारण reconstitute moieties एक दूसरे (Figure. 1a). हालांकि, ग्लाइसिन ubiquitin के आधा एन टर्मिनल बिंदु उत्परिवर्तन के लिए एक 13 isoleucine शुरू रोकता है (एन यूबी जी के रूप में निर्दिष्ट टुकड़ा उत्पादन) इस सहज संघ फिर [8] (Figure. 1b) .

हम मिथक प्रणाली (Figure. -1 सी और 2) में इस सिद्धांत का उपयोग करें. संक्षेप में, अभिन्न झिल्ली चारा प्रोटीन सी यूबी आधा भाग जो Escherichia कोलाई डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन LexA से मिलकर एक कृत्रिम प्रतिलेखन कारक है और सक्रियण डोमेन VP16 की दाद सिंप्लेक्स वायरस से जुड़ा हुआ है से जुड़े हुए है. Preys सीडीएनए या जीनोमिक डीएनए NubG आधा भाग व्युत्पन्न टुकड़े के संलयन से उत्पन्न कर रहे हैं. और एक खमीर की मेजबानी में चारा शिकार प्रोटीन के बीच एक बातचीत साइटोसोलिक deubiquitinating (dubs) एंजाइमों और प्रतिलेखन कारक के proteolytic रिलीज के बाद मान्यता के साथ एक पूर्ण लंबाई 'छद्म ubiquitin' अणु के पुनर्गठन के लिए होता है. प्रतिलेखन कारक तो सेल के नाभिक में प्रवेश कर सकते हैं और एक पत्रकार जीन प्रणाली (आमतौर पर HIS3, lacZ और ADE2 जीन की अभिव्यक्ति शामिल) चयनात्मक मीडिया पर खमीर उपभेदों के विकास की अनुमति है, जो चारा और शिकार बातचीत के संकेत है सक्रिय [ 2-4].

और अभिन्न झिल्ली प्रोटीन बातचीत की पहचान और लक्षण वर्णन जानकारी प्रदान करने के लिए पूरी तरह से उनके कार्य को समझने में मदद करेगा. जैसा कि हम और अधिक ठीक समझते हैं और प्रोटीन है कि अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के साथ बातचीत की भूमिका काटना, हम गतिशील इन प्रोटीनों को विनियमित करने में शामिल परस्पर क्रिया में अंतर्दृष्टि लाभ और उपन्यास लक्ष्य है कि चिकित्सीय क्षमता हो सकता है की खोज कर सकते हैं.

2. चारा और उपयुक्त मिथक सिस्टम का चयन

  1. मिथक विश्लेषण आयोजित करने से पहले, सत्यापित करें कि आपके प्रोटीन सेल के cytosol में अपनी एन और / या सी टर्मिनस. यह आवश्यक है कि सी यूबी - LexA - VP16 टैग ऐसी टर्मिनस पर अपने प्रोटीन को इनकार हो सकता है, के बाद से deubiquitinating प्रतिलेखन कारक रिहाई के लिए आवश्यक एंजाइमों cytosol में स्थित हैं. [4]
  2. अगला निर्णय लेते हैं, जो मिथक के दो प्रमुख वेरिएंट के उपयुक्त है. गैर देशी प्रोटीन खमीर के लिए, पारंपरिक मिथक (tMYTH), इस्तेमाल किया जा सकता है जिसमें फँसाना चाहे ectopically एक प्लाज्मिड से overexpressed हैं. देशी खमीर प्रोटीन के लिए, एकीकृत मिथक (iMYTH) पसंद की विधि है. IMYTH में फँसाना चाहे endogenously सी यूबी - LexA - VP16 टैग के साथ टैग कर रहे हैं, उन्हें उनके मूल प्रमोटर के नियंत्रण के तहत छोड़कर . यह फायदेमंद है, के रूप में जंगली प्रकार फँसाना चाहे की अभिव्यक्ति के स्तर झूठी सकारात्मक का एक संख्या में वृद्धि हुई [3] के रूप में इस तरह के प्रोटीन overexpression, के साथ जुड़े समस्याओं को खत्म करने में मदद करता है. प्रारंभिक चारा निर्माण और चयनात्मक इस्तेमाल किया मीडिया के अपवाद के साथ, मिथक के दोनों रूपों अनिवार्य रूप से एक समान तरीके में किया जाता है. स्पष्टता के लिए, हम मुख्य रूप से इस रिपोर्ट में tMYTH का उपयोग पर ध्यान केंद्रित के रूप में इस प्रकार, सिद्धांत रूप में, वस्तुतः किसी भी जीव से कर सकते हैं झिल्ली प्रोटीन के साथ इस्तेमाल किया जा है औरइस प्रकार अधिक व्यापक रूप से लागू है.

3. चारा पीढ़ी और मान्यकरण

  1. आवश्यक मीडिया और समाधान
    1. बाँझ DDH हे 2 पर 121 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 15 साई autoclaving द्वारा तैयार की .
    2. 3 अमीनो 1 (3) ,2,4 triazole DDH में एक 1M शेयर समाधान के रूप में तैयार समाधान 2 ओ एक 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से पारित होने से जीवाणुरहित.
    3. YPAD ग्रोथ 1% w / ध् खमीर निकालने, 2% w / वी peptone, 2% w / ध् ग्लूकोज और 100 सुक्ष्ममापी DDH ओ 2 में तैयार adenine मिलकर मीडिया 121 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 15 साई autoclaving द्वारा जीवाणुरहित.
    4. 10x एमिनो एसिड / nucleotide बेस मिक्स: पूरा मिश्रण 1.0 मिमी adenine, 1.8 मिमी Uracil, 1.0 मिमी Arginine, 1.0 मिमी हिस्टडीन, 2.3 मिमी Isoleucine, 7.6 मिमी Leucine, 1.6 मिमी Lysine, 10.1 Methionine मिमी, 3.0 मिमी फेनिलएलनिन, 16.8 मिमी शामिल threonine, 2.0 मिमी Tryptophan में 1.7 मिमी Tyrosine और 12.8 मिमी valine, DDH 2 हे में तैयार है. के लिए ड्रॉप आउट आवश्यक अमीनो एसिड (ओं) और / या nucleotide आधार (ओं) को छोड़ देते हैं. 121 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 15 साई autoclaving द्वारा जीवाणुरहित.
    5. सिंथेटिक ड्रॉप - आउट (एसडी) ग्रोथ 0.67% w / ध् खमीर नाइट्रोजन बेस (एमिनो एसिड के बिना, लेकिन अमोनियम सल्फेट के साथ), 2 w / ध् ग्लूकोज%, 2 w / ध् अगर% और 1x एमिनो एसिड / nucleotide मिक्स मिलकर मीडिया, DDH 2 ओ में तैयार दोनों तरल और ठोस (2% अगर युक्त) एसडी Leucine मीडिया तैयार करें. इसके अलावा एसडी ठोस - Tryptophan - Leucine और एसडी Tryptophan - Leucine adenine-हिस्टडीन मीडिया तैयार करते हैं. 121 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 15 साई autoclaving द्वारा जीवाणुरहित. 100x15 मिमी पेट्री डिश में ठोस मीडिया डालो.
    6. सिंथेटिक ड्रॉप - आउट ग्रोथ (एसडी) 3 - एटी युक्त मीडिया SD-Tryptophan Leucine - adenine-हिस्टडीन मीडिया की तैयारी के रूप में वर्णित किया, लेकिन 25, 50, 75, और 100 मिमी की सांद्रता में 3-एटी युक्त . की उचित राशि जोड़ें 3-1M बाँझ स्टॉक मीडिया के समाधान के बाद यह autoclaved गया है और ठंडा (लेकिन अभी तक जम नहीं) पर से. 100x15 मिमी पेट्री डिश में डालो.
    7. खूंटी / लिथियम एसीटेट 40% मिलकर मिक्स w / ध् खूंटी 3350, 120 मिमी लिथियम एसीटेट और 167 μg / एमएल सामन शुक्राणु डीएनए (प्रकार III सोडियम साल्ट) DDH ओ 2 में तैयार इस मिश्रण के बाँझपन यह बाँझ पानी और समाधान से तैयार यह सुनिश्चित करने (यानी 50% खूंटी 3350 autoclaved, 1M लिथियम एसीटेट और 2 मिलीग्राम / एमएल सामन शुक्राणु डीएनए प्रकार III सोडियम नमक बाँझ DDH 2 हे में तैयार autoclaved).
    8. एनजाइम और पीसीआर के संचालन के लिए अभिकर्मकों.
    9. वाणिज्यिक miniprep किट.
    10. सोडा नींबू ग्लास मनकों (0.5 मिमी).
    11. सक्षम Escherichia कोलाई प्लाज्मिड (जैसे DH5α, XL10 सोना) के प्रसार और मानक जीवाणु के प्रसार और प्लाज्मिड चयन के लिए उपयुक्त मीडिया के लिए उपयुक्त कोशिकाओं.
    12. विशिष्ट खमीर उपभेदों, plasmids और प्राइमरों के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है.
  2. TMYTH फँसाना चाहे का गैप मरम्मत द्वारा जनरेशन
    1. चारा टैगिंग और अभिव्यक्ति के लिए एक उपयुक्त वेक्टर में क्लोन किया जाना चाहिए. वर्तमान में चारा निर्माण में उपयोग के लिए tMYTH वैक्टर की एक किस्म उपलब्ध हैं. PCMBV4, pAMBV4 और pTMBV4 जैसे वैक्टर की अनुमति सी टर्मिनली टैग फँसाना चाहे के CYC1 (कमजोर), (मजबूत) ADH1 और TEF1 प्रमोटरों (बहुत मजबूत), क्रमशः नियंत्रण के तहत निर्माण (चारा - सी यूबी LexA - VP16) . एन टर्मिनली टैग फँसाना चाहे (LexA - VP16 - सी यूबी - चारा) pTLB-1 और pBT3 - एन TEF1 और CYC1 प्रमोटरों के नियंत्रण के तहत, क्रमशः के रूप में वैक्टर का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है. वेक्टर पसंद चारा पर निर्भर करता है और empirically निर्धारित किया जाना चाहिए. कुछ मामलों में उच्च चारा अभिव्यक्ति के क्रम में बातचीत का पता लगाने के लिए आवश्यक है, जबकि अन्य मामलों चारा overexpression में वास्तव में हानिकारक हो सकता है, झूठी सकारात्मक की एक वृद्धि की संख्या के लिए अग्रणी.
    2. प्रतिबंध उचित प्रतिबंध साइट (ओं) में चयनित प्लाज्मिड को पचाने. विखंडन केवल सी टैग यूबी LexA - VP16 (अपस्ट्रीम सी टर्मिनल टैगिंग या एन टर्मिनल टैगिंग के लिए बहाव के लिए टैग की) के तत्काल आसपास के क्षेत्र में हो जाना चाहिए . उदाहरण के लिए, जब pAMBV4 सदिश का उपयोग कर, SfiI एक आदर्श विकल्प है. -20 डिग्री सेल्सियस पर इस्तेमाल के लिए तैयार तक पचा प्लाज्मिड स्टोर.
    3. प्रवर्धन और हित के जीन की क्लोनिंग के लिए डिजाइन प्राइमरों. 5 'अपने फॉरवर्ड प्राइमर के अंत 35-40 लगभग प्रतिबंध साइट के अपस्ट्रीम nucleotides मैच है, जबकि 3' अंत लक्ष्य जीन का पहला मैच 18-20 nucleotides चाहिए. 5 अंत लक्ष्य जीन की पिछले 18-20 nucleotides के रिवर्स पूरक (मिलान 'रिवर्स प्राइमर के अंत 3 के साथ लगभग 35-40 प्रतिबंध साइट के बहाव nucleotides के रिवर्स पूरक से मेल खाना चाहिए' रोक codon omitting यदि यूबी LexA - वी.पी. सी16 टैग सी टर्मिनस पर रखा जा रहा है). पर निर्भर करता है कि एन या सी - टर्मिनल टैगिंग प्रदर्शन किया जा रहा है, आगे या रिवर्स ऐसे प्राइमर के 35-40 nucleotides कि लक्ष्य जीन सी टैग यूबी - LexA - VP16 साथ फ्रेम में क्लोन है का चयन करें.
    4. ऊपर प्राइमरों का उपयोग करते हुए पीसीआर द्वारा ब्याज की जीन बढ़ाना. पीसीआर मापदंडों विशेष एंजाइम और विशिष्ट प्राइमरों इस्तेमाल किया पर निर्भर करेगा.
    5. एक उचित खमीर प्रयोगशाला leu2 उत्परिवर्तन (BY4741 उदाहरण के लिए) का असर तनाव में पचा प्लाज्मिड के साथ पीसीआर उत्पाद रूपांतरण . एक मिथक संवाददाता तनाव (जैसे THY.AP4 या L40) पर इस्तेमाल किया जा सकता है आवश्यक नहीं है, इस बिंदु पर खमीर के उद्देश्य के रूप में बस है एक वातावरण में जो अंतराल मरम्मत मुताबिक़ पुनर्संयोजन हो सकता है के रूप में सेवा. परिवर्तन के रूप में निम्नानुसार बाहर किया जाना चाहिए:
      1. बाँझ YPAD मीडिया के 5 एमएल में आपके चयनित खमीर तनाव के एक एकल कॉलोनी टीका लगाना और 30 में रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस निरंतर झटकों के साथ (200 rpm).
      2. ताजा YPAD मीडिया के 50 एमएल में 0.15 ~ का एक OD600 रातोंरात संस्कृति और पतला 30 में सेते ° मिलाते हुए (200 rpm) के साथ सी. लगभग 3-4 घंटे के लिए आगे बढ़ें ~ 0.6 का एक OD600 तक पहुँच जाता है.
      3. 700xg कोशिकाओं 5 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र हटायें.
      4. 25 एमएल बाँझ DDH 2 हे में सेल गोली और 700xg पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र Resuspend.
      5. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 1 एमएल बाँझ DDH 2 ओ में सेल गोली resuspend
      6. एक microfuge ट्यूब के लिए कोशिकाओं की μL 100, 300 μL एसीटेट / खूंटी लिथियम मिश्रण, और पचा प्लाज्मिड (50 fmol) और पीसीआर उत्पाद (250-500 fmol) जोड़ें.
      7. 30 ° C पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
      8. 42 ° C से कम 1 घंटे के लिए गर्मी झटका.
      9. 5 मिनट के लिए 3000xg पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटायें.
      10. 200 μL बाँझ DDH 2 हे में सेल गोली और ठोस, ​​एसडी Leucine चयनात्मक मीडिया पर पूरी मात्रा प्लेट Resuspend. 2-4 दिनों के लिए 30 ° C पर आगे बढ़ें.
      11. 30 ° रातोंरात सी 5 एमएल एसडी Leucine तरल मीडिया में तब्दील तनाव का एक ही कॉलोनी हो जाओ.
      12. 700xg कोशिकाओं 5 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र हटायें.
      13. सेल किसी भी व्यावसायिक miniprep किट का उपयोग कर छर्रों से चारा प्लास्मिड डीएनए अलग. एक संशोधन के साथ मानक प्रोटोकॉल का पालन करें. आदेश में पर्याप्त खमीर सेल lysis सुनिश्चित करने के लिए, प्रारंभिक resuspension और 5 मिनट के लिए भंवर सख्ती के बाद गोली के लिए 0.5 मिमी सोडा नींबू ग्लास मनकों की एक छोटी मात्रा जोड़ने. तो सामान्य रूप वाणिज्यिक प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ना.
      14. एक सक्षम ई. में पृथक खमीर डीएनए रूपांतरण कोलाई 1x10 कम से कम 7 कोशिकाओं / μg डीएनए के एक परिवर्तन दक्षता (जैसे DH5α, XL10 गोल्ड) के साथ प्लाज्मिड प्रचार के लिए उपयुक्त तनाव . ध्यान दें कि चारा plasmids kanamycin का उपयोग करने के लिए चयनित किया जा सकता है.
      15. हार्वेस्ट तब्दील ई. से डीएनए प्लाज्मिड एक मानक डीएनए अलगाव विधि या वाणिज्यिक किट का उपयोग कोलाई .
      16. अनुक्रमण द्वारा प्लाज्मिड चारा के उचित निर्माण सत्यापित करें.
      17. रूपांतरण सत्यापित चारा एक उपयुक्त मिथक संवाददाता तनाव (THY.AP4 जैसे, L40) में निर्माण. खमीर परिवर्तन अभी वर्णित प्रोटोकॉल, पचा प्लाज्मिड और पीसीआर उत्पाद के स्थान में चारा प्लास्मिड डीएनए प्रतिस्थापन इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. चारा मान्यकरण - उचित स्थानीयकरण
    1. उपयोग करने के लिए पहले, चारा उपभेदों करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे ठीक से खमीर झिल्ली के लिए स्थानीयकृत रहे हैं का विश्लेषण कर रहे हैं. जब iMYTH का उपयोग करते हुए, इस स्थानीयकरण को विशेष रूप से टैग चारा के गुणों पर निर्भर करेगा. TMYTH के लिए, चारा plasmids आम तौर पर एक संकेत अनुक्रम (जैसे Matα) प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन व्यक्त निर्देशन. स्थानीयकरण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए निर्धारित किया जाता है. चारा टैग अनुक्रम में एक YFP अणु का समावेश (यानी सी यूबी-YFP - LexA - VP16) सरल और सबसे सीधा दृष्टिकोण है, जीवित कोशिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति है, और सामान्यतः iMYTH में इस्तेमाल किया है. वैकल्पिक रूप से, एक मानक immunofluorescence LexA या टैग के VP16 घटक के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर दृष्टिकोण इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. चारा मान्यकरण - एन यूबी जी / मैं टेस्ट नियंत्रण
    1. चारा के एक बार जब उचित स्थानीयकरण स्थापित किया गया है, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि चारा संवाददाता प्रणाली अकेले या गैर बातचीत preys (यानी सत्यापित है कि स्वयं को सक्रिय चारा नहीं है) की उपस्थिति में सक्रिय नहीं है. यह एन यूबी जी / मैं टेस्ट, जहां चारा (सकारात्मक) बातचीत और गैर बातचीत नियंत्रण (नकारात्मक) preys के साथ बदल रहा है, और विकास चयनात्मक मीडिया पर मूल्यांकन किया है का उपयोग कर निपुण है. मैं एक चारा चयनात्मक मीडिया पर हो जाना चाहिएn सकारात्मक नियंत्रण की उपस्थिति बढ़ने, और नकारात्मक नियंत्रण की उपस्थिति में नहीं, क्रम में मिथक में उपयोग के लिए उपयुक्त हो.
    2. चारा तनाव बदलने के लिए नियंत्रण प्लाज्मिड शिकार के 100-200 एनजी के साथ परीक्षण किया जा द्वारा शुरू करो. पहले से वर्णित खमीर परिवर्तन प्रोटोकॉल, YPAD की जगह में एसडी Leucine मीडिया प्रतिस्थापन और अंतिम चढ़ाना चरण के लिए एसडी Tryptophan Leucine मीडिया का उपयोग कर इस्तेमाल किया जा सकता है. निम्नलिखित नियंत्रण शिकार constructs आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है:
      1. pOST1 - एन यूबी मैं (सकारात्मक नियंत्रण)
      2. यूबी pOST1 - एन जी (नकारात्मक नियंत्रण)
      3. pFUR4 - एन यूबी मैं (सकारात्मक नियंत्रण)
      4. यूबी pFUR4 - एन जी (नकारात्मक नियंत्रण)
    3. OST1 oligosaccharyl परिसर का एक घटक है और endoplasmic जालिका [9] झिल्ली के लिए स्थानीयकृत जबकि FUR4 uracil permease है और प्लाज्मा झिल्ली के लिए स्थानीयकृत [10] हालांकि इन प्रोटीनों को आम तौर पर गैर बातचीत preys के रूप में उपयोग करने के लिए हमारी पहली पसंद हैं, उनकी उपयुक्तता मामले के आधार द्वारा एक मामले पर अलग अलग होंगे. अप्रत्याशित घटना है कि अपने चारा वास्तव में इन दोनों नियंत्रण के साथ बातचीत करने के लिए भविष्यवाणी की है, वैकल्पिक preys के लिए चयनित होने की आवश्यकता होगी. याद है कि एन मैं यूबी ubiquitin के एन टर्मिनस के जंगली प्रकार के फार्म का है, और अनायास सी प्रोटीन है जो सी यूबी और एन यूबी में जुड़े हुए हैं के बीच एक बातचीत के यूबी स्वतंत्र के साथ interacts. इस प्रकार एन यूबी मैं preys सकारात्मक नियंत्रण का गठन, जबकि एन यूबी जी preys (Glycine उत्परिवर्तन जो एन यूबी और सी यूबी के सहज सहयोग रोकता 13 Isoleucine ले जाने) नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं .
    4. 100 μL बाँझ DDH 2 ओ में प्रत्येक तब्दील चारा के एकल कालोनियों Resuspend
    5. Serially बाँझ DDH 2 हे में resuspended कोशिकाओं को कमजोर dilutions की 10 / 1, 1 / 100 और 1 / 1000 का उत्पादन.
    6. के साथ और बिना एसडी Tryptophan - Leucine और एसडी Tryptophan - Leucine adenine-हिस्टडीन मीडिया पर 3 - एटी undiluted और पतला सांद्रता के एक रेंज में कक्षों के 5 μL मात्रा स्पॉट. 3 एटी HIS3 रिपोर्टर जीन की एक प्रतिस्पर्धी अवरोध करनेवाला के रूप में कार्य करता है, और चयन प्रक्रिया की तंगी को बढ़ाने के लिए कार्य करता है. यह कुछ मामलों में बाधा गैर विशिष्ट दुर्बलता को मामूली स्वयं को सक्रिय फँसाना चाहे का विकास के लिए उपयोगी हो सकता है.
    7. स्पॉट सूखी और फिर 2-4 दिनों के लिए 30 ° C पर प्लेटें सेते दें.
    8. सभी transformants एसडी Tryptophan - Leucine प्लेटों पर बढ़ने का संकेत है कि वे सफलतापूर्वक किया गया है प्लाज्मिड शिकार के साथ बदल चाहिए. फँसाना चाहे जो नहीं स्वयं सक्रिय एसडी Tryptophan Leucine - adenine-हिस्टडीन मीडिया पर बढ़ने केवल जब एन यूबी के साथ बदल मैं constructs शिकार है, और एन यूबी जी preys के साथ नहीं होगा. नोट की एकाग्रता क्या 3 - एटी मीडिया में की आवश्यकता है (यदि कोई हो) के रूप में इस स्क्रीनिंग के दौरान इस्तेमाल किया जा आवश्यकता होगी.

4. जाँच

  1. आवश्यक मीडिया और समाधान
    1. बाँझ DDH हे 2 पर 121 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 15 साई autoclaving द्वारा तैयार की .
    2. 0.9% NaCl समाधान DDH 2 हे में तैयार है और 121 पर autoclaving द्वारा निष्फल डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 15 साई .
    3. सोडियम फास्फेट DDH 2 ओ में 493 मिमी सोडियम फॉस्फेट dibasic और 250 मिमी सोडियम फॉस्फेट अकेले आधार का मिलकर समाधान 121 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 15 साई autoclaving द्वारा जीवाणुरहित.
    4. एक्स - लड़की (5 ब्रोमो - 4 क्लोरोफ्लूरोकार्बन 3 indolyl-β-galactopyranoside डी) एक 100 मिलीग्राम / एन, एन - डाइमिथाइल formamide में एमएल शेयर समाधान के रूप में तैयार समाधान.
    5. 2xYPAD ग्रोथ 2% w / ध् खमीर निकालने, 4% w / वी peptone, 4% w / ध् ग्लूकोज और 100 सुक्ष्ममापी adenine, DDH ओ 2 में तैयार युक्त मीडिया 121 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 15 साई autoclaving द्वारा जीवाणुरहित.
    6. सिंथेटिक (एसडी) छोड़ने वालों की ग्रोथ मीडिया, तैयार के रूप में पहले वर्णित. तरल एसडी Leucine और ठोस एसडी Tryptophan - Leucine तैयार. दोनों 100x15 मिमी पेट्री डिश में ठोस मीडिया डालो. 150 मिमी दौर प्लेटें, प्रत्येक स्क्रीन के लिए 16 प्लेटें, यूबी एन जी / मैं नियंत्रण परीक्षण से निर्धारित एकाग्रता में 3-एटी युक्त यदि आवश्यक हो, में ठोस एसडी Tryptophan - Leucine - adenine-हिस्टडीन मीडिया तैयार करें.
    7. सिंथेटिक ख़ारिज किया हुआ (एसडी) मीडिया + 5-Bromo-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन 3 Indoyl-β-डी Galactopyranoside (एक्स - लड़की) तैयार करें. एसडी Tryptophan - Leucine - adenine हिस्टडीन अगर युक्त के रूप में पहले वर्णित मीडिया. Autoclaving के बाद, शांत करने के लिए, जोड़ने के 3 एटी अनुमति देते हैं (यदि आवश्यक) 1/10th मात्रा ओ द्वारा पीछाच बाँझ सोडियम फास्फेट समाधान. अगला, 80 μg / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए एक्स - लड़की समाधान जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और 150 मिमी दौर प्लेटों में डाल देना.
    8. खूंटी / लिथियम एसीटेट समाधान द्वितीय युक्त 40% खूंटी - 3350, 100 मिमी लिथियम एसीटेट, 1 मिमी EDTA और 10 मिमी Tris 7.5 पीएच. इस समाधान का उपयोग कर बाँझ DDH 2 हे और समाधान तैयार (जैसे autoclaved 50% खूंटी - 3350, 1 एम लिथियम एसीटेट, 100 मिमी Tris पीएच 7.5 और 500 मिमी EDTA पीएच 8.0).
    9. लिथियम एसीटेट / Tris EDTA 110 मिमी लिथियम एसीटेट, 11 मिमी Tris पीएच 7.5 और 1.1 मिमी EDTA युक्त समाधान. इस समाधान का उपयोग कर बाँझ DDH 2 हे और समाधान (जैसे autoclaved 1M लिथियम एसीटेट, 100 मिमी Tris पीएच 7.5 और 500 मिमी EDTA पीएच 8.0) तैयार करें.
    10. 10x Tris EDTA 100 मिमी Tris पीएच 7.5 और 10 मिमी EDTA से मिलकर समाधान DDH ओ 2 में तैयार 121 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 15 साई autoclaving द्वारा जीवाणुरहित.
    11. एकल असहाय कैरियर डीएनए (ssDNA) 2 मिलीग्राम / एमएल सामन शुक्राणु डीएनए प्रकार III सोडियम नमक, बाँझ DDH 2 ओ में तैयार युक्त समाधान
    12. वाणिज्यिक miniprep किट.
    13. सोडा नींबू ग्लास मनकों (0.5 मिमी).
    14. सक्षम Escherichia कोलाई प्लाज्मिड (जैसे DH5α, XL10 सोना) के प्रसार और मानक जीवाणु के प्रसार और प्लाज्मिड चयन के लिए उपयुक्त मीडिया के लिए उपयुक्त कोशिकाओं.
    15. विशिष्ट खमीर उपभेदों और plasmids के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित
  2. बड़े स्केल परिवर्तन
    1. मिथक संवाददाता एसडी Leucine मीडिया के 5 एमएल में अपने चारा युक्त तनाव का एक ही कॉलोनी टीका लगाना और 30 में रातोंरात सेते ° मिलाते हुए (200 rpm) के साथ सी.
    2. 200 एमएल OD600 एक एसडी Leucine मीडिया में रातोंरात संस्कृति पतला 0.15 = सेते और 30 ° सी मिलाते हुए (200 rpm) के साथ. OD600 जब तक बढ़ने = 0,6 - 0.7 (लगभग 4-5 घंटे).
    3. कुछ ही समय पहले लक्ष्य OD600 तक पहुँच जाता है, ssDNA समाधान के एक विभाज्य पिघलना. 100 में उबाल लें डिग्री सेल्सियस के लिए 5 मिनट और फिर बर्फ पर शांत. एक बार दोहराएँ.
    4. जब OD600 लक्ष्य तक पहुँच गया है, 700xg पर 5 मिनट (4x50 एमएल पेंच टोपी अपकेंद्रित्र ट्यूबों के बीच 200 एमएल संस्कृति विभाजित) के लिए centrifugation के माध्यम से कोशिकाओं फसल.
    5. 30 एमएल बाँझ DDH 2 हे और संक्षिप्त नमूना भंवर प्रत्येक गोली के साथ धोएं . 5 मिनट के लिए 700xg पर अपकेंद्रित्र.
    6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1 एमएल लिथियम एसीटेट / Tris EDTA समाधान में प्रत्येक गोली resuspend. एक बाँझ 1.5 एमएल microfuge ट्यूब और 700xg पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करने के लिए स्थानांतरण.
    7. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और लिथियम एसीटेट / Tris EDTA समाधान के 600 μL में प्रत्येक गोली resuspend.
    8. 4x15 एमएल पेंच टोपी अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए निम्नलिखित जोड़ें:
      1. 2.5 एमएल खूंटी / लिथियम एसीटेट समाधान द्वितीय
      2. 600 μL resuspended कोशिकाओं
      3. 100 μL ssDNA समाधान
      4. शिकार पुस्तकालय डीएनए के 7 μg
    9. या तो एन एन यूबी जी के साथ या सी टर्मिनस पर टैग, और सीडीएनए या जीनोमिक सूत्रों की एक किस्म से तैयार preys युक्त पुस्तकालय, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ( www.dualsystems.com) . विशिष्ट इस्तेमाल किया पुस्तकालय एक मामले के आधार द्वारा मामला, चयनित चारा और प्रायोगिक उद्देश्यों पर निर्भर पर निर्धारित किया जाना चाहिए.
    10. भंवर 1 मिनट के लिए ट्यूबों पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए और फिर 45 मिनट के लिए एक 30 डिग्री सेल्सियस waterbath में सेते हैं. संक्षिप्त मिक्स हर 15 मिनट.
    11. प्रत्येक ट्यूब 160 μL डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) जोड़ें और inverting ट्यूब द्वारा तुरंत मिश्रण.
    12. 20 मिनट के लिए एक 42 डिग्री सेल्सियस waterbath में सेते हैं.
    13. Centrifugation द्वारा transformants 700xg पर 5 मिनट के लिए ले लीजिए.
    14. सतह पर तैरनेवाला त्यागें. प्रत्येक गोली के 3 एमएल 2xYPAD में resuspension द्वारा transformants पुनर्प्राप्त. एक एकल 50 एमएल अपकेंद्रित्र पेंच टोपी ट्यूब में सभी नमूने एक साथ पूल.
    15. सेल वसूली के लिए 90 मिनट के लिए 30 ° C पर सेते हैं.
    16. 5 मिनट के लिए 700xg पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
    17. 4.9 एमएल बाँझ 0.9% NaCl में सेल छर्रों Resuspend.
    18. Resuspended कोशिकाओं के 100 μL का उपयोग बाँझ 0.9% NaCl में 10 गुना धारावाहिक dilutions तैयार लेकर 10x से 1000x के लिए.
    19. प्लेट 30 में 100 एसडी Tryptophan Leucine मीडिया और सेते पर 100x और 1000x dilutions की μL ° सी 2-3 दिनों के लिए. ये प्लेटें एक नियंत्रण के रूप में सेवा कर रहे हैं और परिवर्तन की दक्षता की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया.
    20. समान रूप से बड़े (150 मिमी) एसडी Tryptophan - Leucine - adenine-हिस्टडीन प्लेटों पर शेष की 4.8 एमएल resuspended कोशिकाओं और थाली विभाजित,30 ° C से कम 3-4 दिन के लिए 3 - एटी के लिए आवश्यक राशि के रूप में एन यूबी जी / मैं परीक्षण में निर्धारित है, और सेते युक्त.
    21. 0.9% NaCl और प्लेट 5 पर μL aliquots के 100 μL में एकल कालोनियों (प्रत्येक का प्रतिनिधित्व कोशिकाओं एक संभावित बातचीत चारा शिकार जोड़ी युक्त) Resuspend एसडी Tryptophan - Leucine adenine-हिस्टडीन + एक्स लड़की मीडिया (और सहित 3 एटी अगर आवश्यक). 2-4 दिनों के लिए बढ़ने की अनुमति दें. यह कदम चयनात्मक स्क्रीनिंग के दूसरे दौर के रूप में कार्य करता है, और प्रारंभिक दौर में प्राप्त झूठी सकारात्मक को हटाने में मदद करता है. केवल कालोनियों जो मजबूत विकास और एक नीले रंग का प्रदर्शन आगे के विश्लेषण के लिए चुने गए हैं.
  3. शिकार डीएनए अलगाव और अनुक्रमण
    1. नीले खमीर पहले वर्णित संशोधनों के साथ एक miniprep प्रोटोकॉल का उपयोग कर कालोनियों से प्लास्मिड डीएनए अलग. एसडी Tryptophan मीडिया में कोशिकाओं को विकसित करने के लिए यकीन है केवल, शिकार की अवधारण के लिए चयन करने के लिए, लेकिन, plasmids नहीं चारा. स्क्रीन है कि हिट की एक बहुत बड़ी संख्या में उत्पादन के लिए, एक वाणिज्यिक उपलब्ध उच्च throughput miniprep किट इस बिंदु पर फायदेमंद हो सकता है.
    2. एक सक्षम ई. में पृथक खमीर प्लाज्मिड डीएनए रूपांतरण कोलाई 1x10 कम से कम 7 कोशिकाओं / μg डीएनए के एक परिवर्तन दक्षता (जैसे DH5α, XL10 गोल्ड) के साथ प्लाज्मिड प्रचार के लिए उपयुक्त तनाव . ध्यान दें कि शिकार plasmids एम्पीसिलीन का उपयोग करने के लिए चयनित किया जा सकता है.
    3. बदल ई. से प्लास्मिड डीएनए को अलग एक मानक डीएनए अलगाव विधि या वाणिज्यिक किट का उपयोग कोलाई . एक बार फिर, एक उच्च throughput miniprep किट उपयोगी हो सकता है अगर नमूना संख्या बड़ी है हो सकता है. ई. में डीएनए का प्रवर्धन कोलाई बहुत प्लाज्मिड उपज बढ़ जाती है और यह सुनिश्चित करता है कि दोनों अनुक्रमण और आगे के विश्लेषण के लिए डीएनए के एक पर्याप्त राशि मौजूद है.
    4. अनुक्रम पृथक एन यूबी जी के भीतर एक दृश्य के लिए पूरक प्राइमर का उपयोग plasmids
    5. संकलित करें और सभी अनुक्रमण interactors के अपने प्रारंभिक सूची को इकट्ठा डेटा का विश्लेषण. यह मैन्युअल रूप से किया जा सकता है, या एक स्वचालित तरीके से उचित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर.
  4. चारा निर्भरता परीक्षण
    1. Interactors की प्रारंभिक सूची के विधानसभा के बाद यह महत्वपूर्ण है करने के लिए बातचीत फिर से जाँच करें और अनेक preys जो बातचीत / चारा पहचान की स्वतंत्र तरीके में संवाददाता प्रणाली को सक्रिय करने को खत्म करने. यह चारा निर्भरता टेस्ट का उपयोग कर निपुण है. इस परीक्षण में, पहचान interactors के सभी वापस मूल चारा तनाव, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक नियंत्रण कृत्रिम एक एकल transmembrane सी टैग यूबी - LexA - VP16 इनकार डोमेन से मिलकर चारा शरण तनाव में तब्दील कर रहे हैं. परिवर्तन मानक प्रोटोकॉल के प्रति पहले से वर्णित रूप में किया जाता है, YPAD और अंतिम चढ़ाना चरण के लिए एसडी Tryptophan - Leucine ठोस मीडिया की जगह में एसडी Leucine मीडिया का उपयोग.
    2. बाँझ DDH 2 हे और जगह के 100 μL में उपरोक्त परिवर्तनों से एक कालोनियों Resuspend SD-Tryptophan - Leucine adenine-हिस्टडीन + एक्स लड़की मीडिया (और 3-एटी सहित, यदि आवश्यक) पर 5 μL संस्करणों. प्लेट्स तो 30 में 2-4 दिनों डिग्री सेल्सियस के लिए incubated हैं आदर्श रूप में एकाधिक transformants प्रत्येक शिकार के लिए चयनित किया जाना चाहिए, और दोनों मूल चारा और कृत्रिम प्रलोभन एक ही थाली पर देखा जाना चाहिए.
    3. खमीर कृत्रिम प्रलोभन और शिकार है कि रिपोर्टर प्रणाली (यानी विकास और नीले रंग) के कारण सक्रियण अनेक माना जाता है और उस विशिष्ट शिकार interactors की सूची से हटा दिया है ले.
    4. Preys कि प्रलोभन ब्याज, लेकिन कृत्रिम चारा नहीं के साथ विकास और खमीर में नीले रंग की रंगाई के कारण, इस विशिष्ट बातचीत की पुष्टि करता है. अगर, हालांकि, खमीर शिकार शरण और अपने चारा के हित हो जाना नहीं है, इस शिकार interactors की सूची से हटा दिया है.
    5. शेष preys interactors मिथक स्क्रीन में पहचान की पूरी सूची बनाते हैं.

5. आगे के अध्ययन

एक बार मिथक स्क्रीनिंग पूरा हो चुका है, आगे विश्लेषण के क्रम में मान्य है और पता लगाया बातचीत के जैविक महत्व का निर्धारण किया जाना चाहिए. विशिष्ट अध्ययन करने के लिए प्रदर्शन किया जा एक मामले द्वारा मामले के आधार पर भिन्न होगा, और व्यक्तिगत शोधकर्ता द्वारा निर्धारित होना चाहिए. अनुवर्ती कार्य के कुछ सामान्य उदाहरण सह immunoprecipitation देशी जीव में और प्रयोगों विलोपन अध्ययन शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, प्राप्त डेटा के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण पैटर्न का पता लगाने, और संभावित प्रासंगिकता और भूमिका के अलग अलग बातचीत निभा सकते हैं की पहचान में मदद करने के लिए उपयोगी हो सकता है. इस प्रकार, मिथक प्रौद्योगिकी झिल्ली प्रोटीन के महत्वपूर्ण कार्यात्मक बातचीत की पहचान और समझ की दिशा में एक शक्तिशाली पहला कदम 'के रूप में कार्य करता है. विस्तृत अनुवर्ती अध्ययन और अन्य हाल ही में विकसित और उभरते ते के साथ युग्मितchnologies, यह सेल के रहस्यों को ताला खोलने में एक महत्वपूर्ण उपकरण होने का वादा करता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. के सिद्धांत विभाजन ubiquitin ए. सी - टर्मिनल (सी यूबी) आधा और आधा एन टर्मिनल (एन यूबी मैं): दो moieties में Ubiquitin अलग हो सकता है. ये अनायास एक दूसरे के लिए क्योंकि उनके उच्च आत्मीयता के पुनर्गठन moieties. ज. ग्लाइसिन के लिए एक isoleucine से 13 स्थान पर ए.एन. यूबी मैं बिंदु उत्परिवर्तन (एन यूबी जी) इस सहज पुनः संघ रोकता है. सी. मिथकः प्रणाली में, सी यूबी चारा की (बी) ब्याज जुड़े हुए है और शिकार एन यूबी जी (ए) से जुड़े हुए है. अटल बिहारी प्रोटीन छद्म ubiquitin बातचीत reconstitutes.

चित्रा 2
चित्रा 2. भाजित ubiquitin आधारित झिल्ली (मिथक) खमीर दो संकर प्रणाली है .
झिल्ली प्रोटीन ब्याज की (चारा) ubiquitin खमीर के आधे सी टर्मिनल (सी यूबी) से जुड़े हुए है, एक प्रतिलेखन कारक संयुग्मित. एक सीडीएनए या gDNA लायब्रेरी का उपयोग, प्रत्येक लायब्रेरी (शिकार) के द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन ubiquitin आधा भाग (एन यूबी जी) के एन टर्मिनस इसी से जुड़े हुए है. यदि दो प्रोटीन बातचीत नहीं करते हैं, प्रतिलेखन कारक झिल्ली इंटरफ़ेस (बाएं पैनल) में रहता है. हालांकि, अगर प्रोटीन बातचीत, दो ubiquitin moieties में शामिल होने, ubiquitin विशेष proteases द्वारा दरार में जिसके परिणामस्वरूप. विखंडन प्रतिलेखन कारक विज्ञप्ति, रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति (सही पैनल) में जिसके परिणामस्वरूप

चित्रा 3
चित्रा 3. मिथकः पाइपलाइन.

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Discussion

मिथक पहली उच्च throughput सिस्टम है कि पूरी लंबाई झिल्ली प्रोटीन और साइटोसोलिक या झिल्ली ही सीमित भागीदारों के बीच बातचीत की पहचान की अनुमति देता है. [3-7] जीवों की एक सीमा से झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. वहाँ रहे हैं, तथापि, विशिष्ट विवरण है कि सुनिश्चित करने के लिए प्रोटीन के ब्याज मिथक के साथ अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी है छानबीन हो की आवश्यकता हो सकती है.

कई बाध्य झिल्ली प्रोटीन है कि बाद में परिपक्व प्रोटीन का उत्पादन cleaved है एक संकेत अनुक्रम के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली के लिए निर्देशित कर रहे हैं. यह जीव विशिष्ट अनुक्रम है और यह संभव है कि इस देशी संकेत अनुक्रम गलत प्रोटीन के ब्याज का स्थानीयकरण कारण जब खमीर में व्यक्त क्योंकि संकेत अनुक्रम अपरिचित रहता है. इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, हम इन विशिष्ट प्रोटीन खमीर संकेत अनुक्रम, संभोग कारक अल्फा (MATα) से प्राप्त करने के लिए इनकार किया जा इंजीनियर. इस पेप्टाइड अनुक्रम (तथाकथित MFα-एस एस) खमीर प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन फिर से localizes और महत्वपूर्ण बात, खमीर संकेत peptidases द्वारा cleaved है. इस पेप्टाइड अनुक्रम pTMBV MFα plasmids और pAMBV - MFα में पाया जाता है.

एक अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि जरूरतों पर जोर दिया जाना चारा अभिव्यक्ति के स्तर है. प्रमोटर है कि चारा की अभिव्यक्ति ड्राइव इस पैरामीटर को नियंत्रित करता है. यह चारा अभिव्यक्ति स्तर परीक्षण / NubG NubI और की राशि का उपयोग का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है है 3 एटी overexpression कलाकृतियों, जहां चारा "स्वयं को सक्रिय करने" (यानी यह promiscuously कई गैर विशिष्ट शिकार प्रोटीन के साथ सूचना का आदान प्रदान) को खत्म करने के लिए आवश्यक . खमीर प्रोटीन की जांच सबसे physiologically प्रासंगिक चारा सांद्रता जब iMYTH लागू किया जाता है पैदा करता है. इस मामले में, जीन की ब्याज शावक-TF के साथ gDNA भीतर टैग है. वैकल्पिक रूप से, exogenous प्रोटीन pBT3 - Ste और pCMBV plasmids कि CYC1 कम चारा अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप प्रमोटर ले से व्यक्त किया जा सकता है. plasmids pTMBV और pTLB1 TEF1 प्रमोटर जबकि pAMBV ADH1 प्रमोटर है बंदरगाह, दोनों चारा प्रोटीन की है कि ड्राइव मजबूत अभिव्यक्ति. यदि चारा प्रोटीन का स्तर आगे के अनुकूलन की आवश्यकता होती है, यह आवश्यक हो pTLB-1 प्लाज्मिड कि TEF1 प्रमोटर किया जाता है का उपयोग कर सकते हैं, तथापि, LexA डीएनए बाध्यकारी डोमेन exogenous रिपोर्टर जीन प्रमोटरों के प्रति आत्मीयता abate R156G में mutated है, अंततः कम आत्म सक्रियण की संभावना [5]

एक और पहलू है कि मिथक सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है पसंद के पुस्तकालय जांच प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया है. इस अंतर्जात चारा अभिव्यक्ति प्रोफाइल पर निर्भर करेगा. उदाहरण के लिए, चारा विशिष्ट ऊतकों में व्यक्त किया जा सकता है, और इसलिए यह महत्वपूर्ण है एक पुस्तकालय है कि इस विशिष्ट ऊतकों से निर्माण किया है का उपयोग करें. इससे यह सुनिश्चित होगा physiologically प्रासंगिक बातचीत का पता चला रहे हैं.

मिथकः प्रणाली एक सरल और तेजी से उपकरण है कि प्रोटीन है कि अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो गया है के एक वर्ग के बारे में जानकारी के एक बहुतायत प्रदान करता है. ये पहचान बातचीत झिल्ली प्रोटीन से भरा जैविक समारोह की व्याख्या में सहायता कर सकते हैं.

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Disclosures

इगोर Stagljar DualSystems बायोटेक, स्विट्जरलैंड के एक सह संस्थापक है.

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि की एक महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉन एडमंड्स को धन्यवाद देना चाहूंगा. Stagljar प्रयोगशाला अभिनव (CFI), स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) के लिए कनाडा संस्थान, दिल और स्ट्रोक फाउंडेशन, कनाडा के कैंसर सोसायटी, और नोवार्टिस के लिए कनाडा फाउंडेशन से धन के द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethenlene Glycol (PEG3350) BioShop Canada PEG335
Lithium Acetate Bihydrate BioShop Canada LIA001
X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) BioShop Canada XGA001
N`,N-dimethyl formamide BioShop Canada DMF 451
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) BioShop Canada ATT124
Sodium phosphate dibasic BioShop Canada SPD307
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-500
Salmon Sperm DNA VWR international CA80601-120
D-Glucose BioShop Canada GLU501
LB Broth LENOX BioShop Canada LBL405
Yeast Nitrogen Base BioShop Canada YNB406
Yeast Extract BioShop Canada YEX401
Peptone BD Biosciences 211677
Bio-Tryptone BioShop Canada TRP402
Adenine Sulphate BioShop Canada ADS201
L-Uracil BioShop Canada URA241
L-Threonine BioShop Canada THR002
L-Histidine BioShop Canada HIS200
L-Methionine BioShop Canada MET222
L-Valine BioShop Canada VAL201
L-Phenylalanine BioShop Canada PHA302
L-Isoleucine BioShop Canada ISO910
L-Tyrosine BioShop Canada TYR333
L-Leucine BioShop Canada LEU222
L-Arginine BioShop Canada ARG006
L-Tryptophane Fisher Scientific BP395-100
L-Lysine BioShop Canada LYS101
L-Alanine Fisher Scientific BP369-100
Agar BioShop Canada AGR001
Soda Lime Galss Beads Biospec Products 11079105
Sodium Chloride BioShop Canada SLD002

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References

  1. Stagljar, I., Fields, S. Analysis of membrane protein interactions using yeast-based technologies. Trends Biochem Sci. 27 (11), 559-563 (2002).
  2. Iyer, K. Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to identify protein-protein interactions of integral membrane proteins. Sci STKE. 275, pl3-pl3 (2005).
  3. Paumi, C. M. Mapping protein-protein interactions for the yeast ABC transporter Ycf1p by integrated split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid analysis. Mol Cell. 26 (1), 15-25 (2007).
  4. Stagljar, I. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5187-5192 (1998).
  5. Gisler, S. M. Monitoring protein-protein interactions between the mammalian integral membrane transporters and PDZ-interacting partners using a modified split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1362-1377 (2008).
  6. Scheper, W. Coordination of N-glycosylation and protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane by Sss1 protein. J Biol Chem. 278 (39), 37998-38003 (2003).
  7. Thaminy, S. Identification of novel ErbB3-interacting factors using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Genome Res. 13 (7), 1744-1753 (2003).
  8. Johnsson, N., Varshavsky, A. Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (22), 10340-10344 (1994).
  9. Kelleher, D. J., Gilmore, R. The Saccharomyces cerevisiae oligosaccharyltransferase is a protein complex composed of Wbp1p, Swp1p, and four additional polypeptides. J Biol Chem. 269 (17), 12908-12917 (1994).
  10. Chevallier, M. R. Cloning and transcriptional control of a eucaryotic permease gene. Mol Cell Biol. 2 (8), 977-984 (1982).

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भाजित Ubiquitin आधार झिल्ली खमीर (मिथक) दो - हाइब्रिड सिस्टम: प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण
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Snider, J., Kittanakom, S., Curak, J., Stagljar, I. Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (36), e1698, doi:10.3791/1698 (2010).

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