التركيبية تحليل شامل لجدران الخلايا النباتية (الكتلة الحيوية Lignocellulosic) الجزء الثاني : الكربوهيدرات

Summary

الكتلة الحيوية النباتية هي كبيرة خالية من الكربون الموارد المتجددة التي يمكن استخدامها لانتاج الوقود الحيوي. الكتلة الحيوية النباتية يتكون أساسا من جدران الخلايا ، والمواد المركبة المعقدة هيكليا ووصف lignocellulosics. نحن هنا وصف بروتوكول لإجراء تحليل شامل للمحتوى الكربوهيدرات وتكوين جدار مشتقة.

Abstract

أصبحت الحاجة للتجديد ومحايدة الكربون ، والمواد الخام اللازمة للصناعة مستدامة والمجتمع واحدة من القضايا الأكثر إلحاحا في القرن 21. وأعاد هذا الاهتمام في استخدام المنتجات النباتية والمواد الخام الصناعية لانتاج الوقود السائل للنقل² وغيرها من المنتجات مثل المواد biocomposite⁶. الكتلة الحيوية النباتية يظل واحدا من أكبر احتياطيات غير مستغلة على كوكب الأرض⁴. وتتألف في الغالب من جدران الخلايا التي تتكون من البوليمرات الغنية بالطاقة بما في ذلك السليلوز ، hemicelluloses المختلفة ، واللجنين مادة البوليفينول⁵ وبالتالي يطلق عليه أحيانا lignocellulosics. ومع ذلك ، فقد تطورت جدران الخلايا النباتية لتكون عنيدة والتدهور ، وتسهم الجدران على نطاق واسع على قوة وسلامة الهيكلية للمصنع بأكمله. على الرغم من جمود في الضرورة ، جدار الخلية هو كيان حيوي جدا أن تنشط عملية الأيض ، ويلعب دورا حاسما في العديد من أنشطة الخلية ، مثل نمو النباتات والتمايز⁵. يرجع ذلك إلى وظائف مختلفة من الجدران ، وهناك تنوع هائل الهيكلية داخل جدران من أنواع النباتات المختلفة وأنواع الخلايا داخل مصنع واحد⁴. وبالتالي ، اعتمادا على ما يتم استخدام أنواع المحاصيل ، وتنوع المحاصيل ، أو الأنسجة النباتية لمعامل تكرير أحيائية ، والخطوات التي depolymerisation لتجهيز العمليات الكيميائية / الأنزيمية والتخمير لاحقة من السكريات لمختلف أنواع الوقود الحيوي السائل تحتاج إلى تعديل وتحسين. هذا الواقع يعزز الحاجة إلى توصيف دقيق من المواد الأولية الكتلة الحيوية النباتية. نحن هنا وصف منهجية تحليلية شاملة تمكن من تحديد تركيبة lignocellulosics ، وهي قابلة للمتوسطة إلى عالية الإنتاجية تحليل (الشكل 1). الأسلوب يبدأ من بإعداد المواد destarched جدار الخلية. يتم تقسيم ثم lignocellulosics الناتجة تصل إلى تحديد أحادي السكاريد تكوينها من hemicelluloses ومصفوفة أخرى polysaccharides1 ، ومحتواه من السليلوز البلورية⁷. ويناقش بروتوكول لتحليل مكونات اللجنين في الكتلة الحيوية lignocellulosic في الجزء الأول³.

Protocol

1. جدار الخلية العزلة طحن ما يقرب من 60 70mg من الجو أو تجميد المواد النباتية المجففة مع الكرات 5.5 مم الفولاذ المقاوم للصدأ في أنبوب sarstedt 2ml سقف المسمار باستخدام retschmill (1 دقيقة و 25 هرتز). كبديل لذلك ، وصفت استخدام طحن عالية الإنتاجية والاستغناء iWall الروبوت يسمى في الجزء الأول 3. إزالة كرات الصلب قبل الاستمرار في إجراءات عزل جدار الخلية يتم عرض مفصل لبروتوكول إعداد المواد جدار الخلية في الجزء الأول 3. هنا لاكتمال الخطوات خطية من البروتوكول. إضافة 1.5 مل من الايثانول المائي 70 ٪ ، ودوامة بدقة الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة لتكوير بقايا الكحول قابل للذوبان نضح أو صب وطاف إضافة 1.5 مل من محلول الكلوروفورم / الميثانول (1:1 V / V) إلى بقايا ويهز جيدا لأنبوب resuspend الكرية الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة ، ونضح أو صب وطاف resuspend بيليه في 500 UL من الاسيتون يتبخر المذيب مع تيار من الهواء على 35 درجة مئوية حتى يجف إذا كان يمكن تخزين العينات في درجة حرارة المجفف حاجة الغرفة حتى مزيد من المعالجة. الشروع في إزالة النشا من العينة إعادة تعليق بيليه في 1.5 مل من sodiumacetate M 0.1 5.0 درجة الحموضة عازلة. غطاء الأنابيب sarstedt والحرارة لمدة 20 دقيقة. في 80 درجة مئوية في كتلة التدفئة. تبريد التعليق على الجليد إضافة إلى العوامل التالية بيليه : 35 ميكرولتر من Sodiumazide 0.01 ٪ (نان 3) ، 35 الأميليز ميكرولتر (50 μg/1mL H 2 O ؛ من الأنواع العصوية ، SIGMA) ؛ (؛ SIGMA 18.7 وحدات من acidopullulyticus عصية) 17 Pullulanase ميكرولتر . غطاء الأنبوب ودوامة بدقة. والمحتضنة للتعليق أكثر من ليلة عند 37 درجة مئوية في شاكر. توجيه أنابيب تحسين مساعديه أفقيا الاختلاط. التعليق على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في كتلة التدفئة لإنهاء عملية الهضم. الطرد المركزي (10،000 دورة في الدقيقة ، 10 دقيقة) وتجاهل طاف تحتوي على النشا solubilized تغسل ما تبقى من بيليه ثلاث مرات عن طريق إضافة 1.5 مل من الماء ، vortexing ، centriguation ، والصب من مياه الغسيل. resuspend بيليه في 500 UL من الاسيتون يتبخر المذيب مع تيار من الهواء عند 35 درجة مئوية حتى يجف. قد يكون من الضروري أيضا لتفتيت المواد في الأنبوب مع ملعقة من أجل تحسين التجفيف. المواد المجففة يعرض معزولة جدار الخلية (lignocellulosics). إذا كان يمكن تخزين العينات في درجة حرارة المجفف حاجة الغرفة حتى مزيد من المعالجة. 2. بوليساكيريد تكوين مصفوفة هذا الأسلوب هو أساسا تعديل الأسلوب نشرتها Albersheim 1. لتحديد تكوين أحادي السكاريد للمواد الجدار تزن 2 ملغ من مادة جدار الخلية في أنابيب starstedt 2ml إما باليد أو بطريقة highthroughput باستخدام iWall ، والروبوت الآلي الطحن وزنها. إضافة 20 ماي من حل إينوسيتول (5mg/ml) كمعيار داخلي. لعينة 2 ملغ جدار الخلية نوصي لإضافة 100 ميكروغرام. شطف الجدران أنبوب مع 250 UL من الأسيتون لجمع المواد جدار الخلية في أسفل الأنبوب ، وتتبخر والأسيتون لطيف جدا في ظل تدفق الهواء. التحلل المائي للحمض ضعيف إضافة UL 250 من حمض trifluoroacetic 2M (TFA) لكل عينة. إضافة TFA بعناية للتأكد من رش أي مواد حتى على جدران الأنبوب. غطاء بإحكام واحتضان لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية في كتلة التدفئة. تبريد تسخين كتل والعينات في الثلج. أنابيب الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة. نقل 100 من المجاهدين طاف الحمضية التي تحتوي على مصفوفة السكاريد المستمدة أحادي السكاريد لقوارير الزجاج سقف المسمار التأكد من عدم الإخلال المواد بيليه. يمكن استخدام بيليه للمقايسة السليلوز البلورية أدناه (انظر 3). تتبخر في TFA في أنبوب زجاجي تحت تيار من الهواء لطيف في جهاز التبخير. إضافة 300 ميكرولتر 2 بروبانول ، دوامة وتتبخر عند درجة حرارة 25 مئوية (تكرار لما مجموعه ثلاث مرات) الخطوة الأولى لإجراء خلات derivatization alditol هو إجراء تخفيض على السكريات الأحادية alditols يناظرها. إضافة لهذا الغرض 200 ميكرولتر من الصوديوم حل بوروهيدريد لكل عينة المجففة. يعد حل جديد في كل مرة باستخدام 10mg من بوروهيدريد الصوديوم لكل من هيدروكسيد الأمونيوم 1ml 1M. ترك قنينة من الزجاج في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة تحييد الحل بإضافة 150 UL من حامض الخليك الجليدي دوامة وتتبخر عند درجة حرارة 25 مئوية. إضافة 250 ميكرولتر دوامة حمض / الميثانول (1:9 ، V / V) ، الخليك وتتبخر عند 25 ˚ C إضافة 250 ميكرولتر الميثانول ، وتتبخر تحت تيار من الهواء (تكرار لما مجموعه ثلاث مرات) لأستلة من alditols ، بإضافة 50 ميكرولتر من أنهيدريد الخليك و 50 ميكرولتر من Pyridالمعهد الوطني للإحصاء ، ودوامة لاحتضان 20 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية في كتلة التدفئة. عينات بارد في كتلة الجليد في حين انخفض مع انخفاض درجة الحرارة انتظر إلى درجة حرارة الغرفة تقريبا. تتبخر الكواشف تحت تيار من الهواء لطيف في درجة حرارة الغرفة. كن حذرا : الأسيتات alditol متقلبة للغاية. إضافة 200 ميكرولتر التولوين وتتبخر تحت الهواء (X3) في الخطوات النهائية يتم استخراج الأسيتات alditol. الأولى ، إضافة 500 من المجاهدين خلات الإيثيل ودوامة طفيفة. إضافة 2 مل من الماء ، وأنابيب وقبعة الدوامة. أنابيب الطرد المركزي في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق للحصول على طبقات منفصلة واضحة (خلات الإيثيل على القمة ، والماء على القاع) 50 ماصة المجاهدين طبقة خلات الإيثيل في GC / MS قارورة مع تدرج. تمييع بإضافة 100 UL من الأسيتون لالقارورة – GC وقبعة. ويمكن تعديل حجم العينة وتخفيف حجم لتجنب إثقال كاهل GC / MS إذا كان تركيز العينة مرتفعة للغاية. ويمكن تخزين GC – فيال في 4 درجات مئوية ، إذا كان التحليل GC / MS لا الشروع فورا يتم حقن هذه العينات إلى أن القيادة العامة وهي مجهزة MS رباعي ، ولكن جهاز كشف تأين اللهب هو أيضا مناسبة. A Supelco SP – 2380 (30mm X 0.25mm × 0.25 ميكرومتر سمك الفيلم) يستخدم عمود مع تأخير مذيب 4min ومعدل تدفق 1.5ml/min. حقن عينات يتعرضون لبرنامج درجة الحرارة التالية : عقد أول عند 160 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ؛ و20 درجة مئوية / دقيقة المنحدر إلى 200 درجة مئوية ، وعقد لمدة 5 دقائق ؛ ومنحدر 20 درجة مئوية دقيقة / لتصل الى 245 درجة مئوية ، وعقد 12 دقيقة ؛ الارتفاع إلى 270 درجة مئوية ، وعقد لمدة 5 دقائق قبل التبريد لدرجة الحرارة الأولية من 160 درجة مئوية 2.26) يتم تحديدها من قبل قمم التشكيلات الجماعية و / أو الإبقاء على معايير مرات. السكريات الأحادية وكميا على أساس المنحنيات القياسية. 3. السليلوز البلورية المحتوى يوصف هذا الأسلوب أساسا بواسطة Updegraf 8. هناك عدد من المواد الأولية لهذا الإجراء : مواد متفرقة جدار الخلية (انظر 1) أو مواد الجدار الذي سبق أن تعامل مع TFA 2M (انظر 2.8) اما بيليه المتبقية على الفور بعد العلاج حمض (انظر 2.8) أو a TFA بيليه ، الذي تم غسلها مع بروبانول – 2 والمجففة. إضافة إلى بيليه في TFA مل المسمار الزجاج توج 1 أنبوب كاشف Updegraff (حمض الخليك : حمض النيتريك : المياه ، 08:01:02 V / V). أنبوب الغطاء بإحكام ، الدوامة ، والحرارة في كتلة التدفئة عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. نتيجة لهذا العلاج لا يزال السليلوز البلورية فقط غير قابلة للذوبان في بيليه. تبريد العينات في كتلة الجليد في درجة حرارة الغرفة أو أبرد عينات الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة تجاهل طاف ضمان ألا تؤثر على بيليه وأية مواد من بيليه وإزالتها. لهذا الغرض إجازة تقريبا. UL 150 من طاف في الأنبوب. إضافة 1.5 مل من الماء ، تهز ، الطرد المركزي ، وتجاهل طاف كما فعلت أعلاه تكرار الغسيل الداخلي 3 مرات إضافية باستخدام 1.5 مل من الاسيتون الهواء الجاف بيليه بلطف شديد مع الهواء ، أو ليلة وضحاها الجاف على مقاعد البدلاء وبيليه (السليلوز البلورية) هو الآن تماما في تحلل الجلوكوز عن طريق ما يسمى التحلل Saeman. إضافة لهذا الغرض 175 ميكرولتر حامض الكبريتيك 72 ٪ إلى أنبوب sarstedt يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 الدوامة ، دقيقة واحتضان لمدة 15 دقيقة إضافة 825 ميكرولتر المياه والدوامة أجهزة الطرد المركزي في 10000 دورة في الدقيقة العينات لمدة 5 دقائق. قد يكون هناك بعض المواد غير القابلة للذوبان البني ، اللجنين ، المتبقية في الأنبوب. ويعاير محتوى الجلوكوز من طاف باستخدام مقايسة anthrone اللونية. يتم إجراء هذا الاختبار في 96 لوحة microtiter جيدا البوليسترين. لمنحنى القياسية استخدام مخزون الجلوكوز 1mg/ml (المخزنة في 0 درجة مئوية) وإنشاء مكررة 0 ، 2 ، ومعايير المرحلة 4 ، 6 ، 8 ، و 10 pipetting 0 ، 2 ، 4 ، 6 ، 8 و 10 ماي كذلك في مناسبة منفصلة. ملء كل المجاهدين تصل إلى 100 جيدا مع الماء. إضافة 10 ميكرولتر طاف كل عينة و 90 مل من الماء في خلايا منفصلة ولكن على لوحة microtiter نفس المعيار. إضافة 200 ميكرولتر من الكاشف Anthrone الطازجة (Anthrone الذائب في حمض الكبريتيك المركز ، 2 ملغ anthrone / مل حامض الكبريتيك) لوحة الحرارة لمدة 30 دقيقة عند 80 درجة مئوية في فرن (الألومنيوم مفرشة الحرارة). العينات التي تحتوي على السكر بدوره من الأصفر الى الأخضر والأزرق. السماح لوحة تبرد لدرجة حرارة الغرفة ، ويهز جيدا. قراءة في لوحة استيعاب 625 ملم باستخدام قارئ لوحة microtiter. ويتم احتساب نسبة الجلوكوز (وبالتالي محتوى السليلوز البلورية) على أساس مقارنة الامتصاصية للمنحنى القياسية التي أنشئت على نفس المائدة. 4. ممثل النتائج ويقدم مثالا للتحليل الجدار في الشكل 2. في هذه الحالة تم تحليل الحور الجذعية (الخشب) من قبل مختلف الإجراءات المذكورة في المقطع البروتوكول. مصفوفة بوومن ابرز تكوين lysaccharide قبل chromatogram سبيل المثال تحديد الحاضر السكر العادي في جدران الخلايا النباتية ، فوكوز ، رامنوز ، الزيلوز ، أرابينوز ، الجالاكتوز ، مانوز والجلوكوز (واينوزيتول الداخلية قياسي). العنصر الرئيسي هو hemicellulosic من الحور xylan كما يتضح من مضمون الزيلوز عالية. ومع ذلك ، فإن وفرة من هذه السكريات تختلف تبعا لused4 سيطة. مشتق الجلوكوز في هذا التحليل من xyloglucan هيميسيلولوز والسليلوز غير متبلور. ويمكن نتيجة لتحليل البيانات ستعرض كنسبة مئوية أو مول ميكروغرام / مغ مواد الجدار (أو الوزن الجاف). محتوى السليلوز البلورية غني عن البيان ، يمكن للمرء أن يتوقع من القيم بين 20-50 ٪ من الوزن الجاف الجدار. بناء على النتائج المقدمة هنا وI3 في تكوين الجزء من خشب الحور lignocellulosic اللجنين هو 21 ٪ ، 30 ٪ hemicelluloses ، والسليلوز البلورية بنسبة 41 ٪. والباقي يكون الرماد. يتم عزل الجدران نظرة عامة خلية التحليل lignocellulosic (lignocellulosics) من المواد النباتية الخام المجففة : الشكل 1. ومن المرجح ثم المادة الجدارية في aliquots وتقسيمها لفحوصات مختلفة. يتم تأسيس تكوين مصفوفة السكاريد بعد معالجة المواد الحائط مع حمض ضعيف (TFA 2M) ، والسكريات الأحادية derivatizing الناتجة solubilized لالأسيتات alditol بهم ، وتحليلها من جانب GC – MS. تغسل بقايا من العلاج حمض ضعيف مع كاشف Updegraff يسمى ترك السليلوز فقط غير قابلة للذوبان وراء crystlline. والسليلوز هو solubilized بواسطة حامض الكبريتيك وكميا عن طريق الفحص اللونية تحديد محتوى الجلوكوز. بالتوازي ، يمكن تحديد مضمون وتكوين اللجنين كما هو موضح في الجزء الأول 3. وتعرض رقائق الخشب lignocellulosic تحليل شامل من خشب الحور الحور (حور tremoloides) إلى بروتوكول وصف : الشكل 2. العلوي الأيسر : تكوين مصفوفة السكاريد ؛ الجبهة فوكوز ؛ RHA رامنوز ؛ آرا أرابينوز ؛ Xyl الزيلوز ؛ مان مانوز ؛ غال الغالاكتوز ؛ GLC الجلوكوز ؛ القياسية اينوزيتول الداخلية.

Discussion

الأساليب المذكورة تمكين التقييم السريع الكمي لتكوين الكتلة الحيوية النباتية lignocellulosic. الأسلوب يسمح بتحديد تركيبة هذه المواد بما في ذلك تكوين السكر من السكريات وهي مصفوفة hemicelluloses ، ومحتوى السليلوز البلورية. الإنتاجية من أساليب تحليلية مختلفة للشخص الواحد يختلف. باستخدام البروتوكولات وصفها هنا ، يمكن معالجة 20 عينة للتركيبات السكاريد مصفوفة و 30 للمحتوى السليلوز البلورية. نظرا لطبيعة كمية من المواد الوسيطة المحاصيل البيانات الأمثل ، يمكن تقييم أو المورثات متنوعة من حيث ملاءمتها لإنتاج الوقود الحيوي.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Trifluoroacetic acid		Sigma-Aldrich	T6508
myo-Inositol		Sigma-Aldrich	I5125
Sodium Borohydride		Sigma-Aldrich	213462
Pyridine		J.T. Baker	3348-01
Acetic Anhydride		Sigma-Aldrich	320102
Spectromax Plus 384		Molecular Devices	Plus384
GC-MS		Agilent	7890A GC/5975C MSD
5.5mm Stainless Steel Balls		Salem Ball Company	(N/A)
96 well plate heat spreader		Biocision	Coolsink 96F
Retsch Mill		Qiagen	TissueLyser II
Heating block		Techne	Dri-block DB-3D
Sample concentrator		Techne	FSC400D