1. Zellwand isoliert schleifen etwa 60-70mg von Luft-oder gefriergetrocknet Pflanzenmaterial mit 5,5 mm Edelstahl-Kugeln in einem 2ml Sarstedt Schraubverschluss Röhrchen mit einem retschmill (1 min, 25 Hz). Eine Alternative ist die Verwendung eines High-Throughput-Mahlen und Abfüllen Roboter bezeichnet iWall in Teil I 3 beschrieben. Entfernen Sie die Stahlkugeln, bevor Sie mit der Zellwand isoliert Verfahren Das detaillierte Protokoll der Vorbereitung der Zellwand Material wird in Teil I 3 dargestellt. Der Vollständigkeit halber hier die schriftliche Schritte des Protokolls. 1,5 ml 70% wässrigem Ethanol und gründlich vortexen Zentrifuge bei 10.000 rpm für 10 min zur Pelletierung der Alkohol unlösliche Rückstand Absaugen oder Dekantieren des Überstandes 1,5 ml Chloroform / Methanol (1:1 v / v) Lösung des Rückstandes und schütteln Rohr gründlich, um das Pellet resuspendieren Zentrifuge bei 10.000 rpm für 10 min und Verwerfen des Überstandes Pellet in 500 ul Aceton verdampft das Lösungsmittel mit einem Luftstrom bei 35 ° C bis trocken Bei Bedarf getrockneten Proben können bei Raumtemperatur bis zur weiteren Verarbeitung gespeichert werden. Um die Entfernung von Stärke aus der Probe resuspendieren Sie das Pellet in 1,5 ml einer 0,1 M Natriumacetat-Puffer pH 5,0 zu initiieren. Kappe der Sarstedtröhrchen und Wärme für 20 min. bei 80 ° C in einem Heizblock. Kühlen der Suspension auf Eis fügen Sie die folgenden Substanzen, um das Pellet: 35 ul von 0,01% Natriumazid (NaN 3), 35 ul Amylase (50 μg/1mL H 2 O, von Bacillus-Arten, SIGMA), 17 ul Pullulanase (18,7 Einheiten aus Bacillus acidopullulyticus; SIGMA) . Cap der Röhre und gründlich vortexen. Die Suspension wird über Nacht bei 37 ° C in den Shaker. Die Ausrichtung der Rohre horizontal Helfer eine bessere Durchmischung. Wärme Suspension bei 100 ° C für 10 min in einem Heizblock, um die Verdauung zu kündigen. Zentrifuge (10.000 rpm, 10 min) und Überstand verwerfen, die solubilisierten Stärke Waschen Sie die verbleibende Pellet dreimal durch Zugabe von 1,5 ml Wasser, Vortex, centriguation und Dekantieren des Waschwassers. Pellet in 500 ul Aceton verdampft das Lösungsmittel mit einem Luftstrom bei 35 ° C, bis es trocken. Es kann notwendig sein auch zu brechen das Material in der Röhre mit einem Spatel für eine bessere Trocknung. Das getrocknete Material präsentiert isoliert Zellwand (Lignocellulose). Bei Bedarf getrockneten Proben können bei Raumtemperatur bis zur weiteren Verarbeitung gespeichert werden. 2. Matrix Polysaccharidzusammensetzung Diese Methode ist im wesentlichen eine Modifikation des Verfahrens von Albersheim 1 veröffentlicht. Zur Bestimmung der Monosaccharid-Zusammensetzung des Wandmaterials wiegen 2 mg Zellwand Material in 2ml starstedt Rohre entweder von Hand oder in einem hohem Durchsatz Weise mit dem iWall, ein Roboter-Schleif-und einem Gewicht von Roboter. Fügen Sie 20 uL einer Inositol-Lösung (5mg/ml) als interner Standard. Für eine 2 mg Zellwand Probe empfehlen wir 100 ug hinzuzufügen. Spülen Rohrwandungen mit 250 ul Aceton an die Zellwand Material auf den Boden des Röhrchens zu sammeln und verdampft das Aceton sehr sanft unter Luftstrom. Für die Schwachen saure Hydrolyse add 250 ul 2M Trifluoressigsäure (TFA) zu jeder Probe. Add TFA sorgfältig, um sicherzustellen, kein Material bis auf das Rohr Wände spritzte. Kappe dicht und Inkubation für 90 min bei 121 ° C in einem Heizblock. kühlen die Heizblöcke und Proben auf Eis. zentrifugieren bei 10.000 rpm für 10 min. Transfer 100 ul der sauren Überstand, der die Matrix Polysaccharid abgeleitet Monosaccharid, ein Glas Schraubverschluss Fläschchen macht sicher nicht für die Pellet-Material zu stören. Das Pellet kann für die kristalline Cellulose-Assay unter verwendet werden (siehe 3). verdampft das TFA in das Glasrohr unter einem leichten Luftstrom in eine Verdampfungseinrichtung. add 300 pl 2-Propanol, Wirbel und verdampfen bei 25 ° C (Wiederholung für insgesamt dreimal) Der erste Schritt der Alditolacetat Derivatisierung Verfahrens ist es, eine Reduktion der Monosaccharide in ihre entsprechenden Alditolen durchzuführen. Zu diesem Zweck fügen Sie 200 ul einer Natriumborhydrid-Lösung in jede getrocknete Probe. Bereiten Sie eine neue Lösung jedes Mal mit 10 mg Natriumborhydrid pro 1 ml 1M Ammoniumhydroxid. verlassen Glasflasche bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden neutralisieren die Lösung durch Zugabe von 150 ul Eisessig Wirbel und bei 25 ° C verdampft. add 250 ul Essigsäure / Methanol (1:9, v / v), Vortex-und verdampfen bei 25 ˚ C add 250 ul Methanol und dampft unter Luftstrom (Wiederholung für insgesamt drei mal) Für die Acetylierung der Alditole add 50 ul Essigsäureanhydrid und 50 ul Pyridine, Wirbel und Inkubation für 20 min bei 121 ° C in einem Heizblock. kühlen Proben in den Block mit Eis, während für Temp. Rückgang warten, bis etwa Raumtemperatur. verdunsten die Reagenzien unter einem leichten Luftstrom bei Raumtemperatur. Seien Sie vorsichtig: Alditolacetaten sehr volatil sind. mit 200 ul Toluol und an der Luft verdampfen (x3) In den letzten Schritten der Alditolacetaten extrahiert werden. Fügen Sie zuerst 500 ul Ethylacetat und Drall leicht. 2 ml Wasser, cap Rohre und Wirbel. Zentrifugenröhrchen bei 2.000 RPM für 5 min zu klar getrennten Schichten (Ethylacetat auf, Wasser auf der Unterseite) zu erhalten Je 50 ul der Ethylacetatschicht in GC / MS Fläschchen mit Einsätzen. verdünnt durch Zugabe von 100 ul Aceton auf die GC-Fläschchen und Mütze. Das Probenvolumen und Verdünnungsmengen können angepasst werden, um eine Überlastung der GC / MS, wenn die Konzentration der Probe ist zu hoch. Die GC-Fläschchen können bei 4 ° C, wenn der GC / MS-Analyse nicht sofort gehen gelagert werden Die Proben werden in ein GC, der mit einem Quadrupol-MS ausgestattet injiziert wird, sondern ein Flammenionisationsdetektor ist ebenfalls geeignet. Ein Supelco SP-2380 (30mm x 0,25 x 0,25 um Filmdicke)-Spalte mit einer 4min Lösungsmittel Verzögerung und einer Durchflussrate von 1.5ml/min verwendet wird. Injected Proben werden auf die folgenden Temperaturprogramm unterworfen: Initial halten bei 160 ° C für 2 min; 20 ° C / min Rampe bis 200 ° C und für 5 min halten, ein 20 ° C / min Rampe bis 245 ° C und halten 12 min; spike bis 270 ° C und für 5 min halten vor dem Abkühlen auf die anfängliche Temperatur von 160 ° C 2,26) Peaks Masse Profile und / oder Retentionszeiten von Standards identifiziert werden.. Monosaccharide basieren auf Standard-Kurven quantifiziert. 3. Kristalliner Cellulose Inhalt Diese Methode wird im Wesentlichen durch Updegraf 8 beschrieben. Es gibt eine Reihe von Ausgangsmaterialien für dieses Verfahren: Isolierte Zellwandmaterial (siehe 1) oder an der Wand Material, das bereits mit 2M TFA (siehe 2.8) entweder die verbleibende Pellet sofort nach der Säurebehandlung (siehe 2.8) oder eine TFA behandelt worden Pellet, das mit 2-Propanol und getrocknet worden ist, gewaschen. Hinzufügen, um die TFA Pellet in die Schraube verschlossen Glasrohr 1 ml Updegraff Reagenz (Essigsäure: Salpetersäure: Wasser, 8.01.02 v / v). Cap Röhrchen fest, Wirbel, und Wärme in einem Heizblock bei 100 ° C für 30 min. Als Ergebnis dieser Behandlung nur kristalline Cellulose bleibt unlöslich im Pellet. Coole Proben in den Block auf dem Eis zu Raumtemperatur oder kälter Zentrifuge Proben bei 10.000 rpm für 15 min Überstand sicherzustellen, dass die Pellets nicht gestört wird und kein Material aus dem Pellet entfernt wird. Zu diesem Zweck verlassen ca.. 150 ul des Überstandes in die Röhre. 1,5 ml Wasser, schütteln, zentrifugieren und Überstand verwerfen wie oben beschrieben einstellen wiederholen Waschvorgang 3 weitere Male mit 1,5 ml Aceton Der Luft trocknen lassen Pellet sehr vorsichtig mit Luft, oder lassen Sie auf der Bank über Nacht trocknen das Pellet (kristalline Cellulose) ist nun vollständig hydrolysiert in Glukose durch eine sogenannte Saeman Hydrolyse. Zu diesem Zweck fügen Sie 175 ul 72% Schwefelsäure zu der Sarstedt Röhre Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min, Wirbel und Inkubation für weitere 15 min add 825 ul Wasser und Wirbel Zentrifuge Proben bei 10.000 rpm für 5 min. Es mag einige braune unlösliche Material, Lignin, noch in der Röhre. Die Glucose-Gehalt des Überstandes wird unter Verwendung der kolorimetrischen Anthron-Test. Dieser Test wird in einer 96-Well-Polystyrol-Mikrotiterplatte durchgeführt. Für die Standardkurve verwenden 1mg/ml Glukose Lager (gelagert bei 0 ° C) und erstellen Sie doppelte 0, 2, 4, 6, 8 und 10 ug Standards durch Pipettieren 0, 2, 4, 6, 8 und 10 ul in getrennte geeignete gut. Füllen Sie jede Vertiefung bis zu 100 ul mit Wasser. add 10 ul jeder Probe Überstand und 90 ml Wasser in separate Zellen, sondern auf der gleichen Mikrotiterplatte als Standard. mit 200 ul frisch zubereitet Anthron-Reagenz (Anthron in konzentrierter Schwefelsäure, 2 mg Anthron / ml Schwefelsäure gelöst) Heizplatte für 30 min bei 80 ° C in einem Ofen (Aluminium Heatspreader). Glucose Proben wiederum von Gelb in Blau-Grün. lassen Sie den Teller abkühlen lassen, um bei Raumtemperatur und schütteln. Lesen Absorption der Platte bei 625 mm mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät. Glucose (und damit kristalline Cellulose-Gehalt) wird basierend auf der Absorption im Vergleich zu den Standard-Kurve auf der gleichen Platte etabliert berechnet. 4. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für eine Wand-Analyse ist in Abbildung 2 dargestellt. In diesem Fall Pappel Stamm (Holz) wurde durch die verschiedenen Verfahren in das Protokoll Abschnitt beschrieben analysiert. Die Matrix polysaccharide Zusammensetzung wird durch ein Beispiel Chromatogramm Identifizierung der typischen Zucker in pflanzlichen Zellwänden hervorgehoben, Fucose, Rhamnose, Xylose, Arabinose, Galaktose, Mannose und Glucose (und der interne Standard Inosit). Die wichtigsten Hemicellulose Bestandteil der Pappel ist Xylan als durch die hohe Xylosegehalt demonstriert. Allerdings wird die Fülle dieser Zucker je nach Ausgangsmaterial Gebraucht4. Die Glukose in dieser Analyse ist aus der Hemizellulose Xyloglucan und amorpher Cellulose abgeleitet. Aufgrund der Analyse der Daten kann als mol% oder ug / mg Wandmaterial (oder Trockengewicht) vorgestellt werden. Für den Inhalt der kristalliner Cellulose ist selbsterklärend, kann man Werte zwischen 20-50% der Wand Trockengewicht erwarten. Basierend auf den hier vorgestellten Ergebnisse und in Teil I3 des lignocellulosischen Zusammensetzung aus Pappelholz ist 21% Lignin, 30% Hemicellulosen und 41% kristalline Cellulose. Der Rest würde Asche. Abbildung 1:. Übersicht von Lignocellulose-Analyse Zellwände (Lignocellulose) werden aus Rohöl getrocknetes Pflanzenmaterial isoliert. Die Wand wird anschließend in Aliquots gewichtet und unterteilt für die verschiedenen Tests. Matrix Polysaccharidzusammensetzung ist nach der Behandlung das Wandmaterial mit einer schwachen Säure (2M TFA), Derivatisierung der daraus resultierenden solubilisierten Monosaccharide, ihre Alditolacetaten und Analyse mittels GC-MS etabliert. Der Rückstand der schwachen Säure-Behandlung wird mit der sogenannten Updegraff Reagenz bleibt nur unlösliche Cellulose crystlline hinter gewaschen. Die Cellulose wird durch Schwefelsäure gelöst und quantifiziert durch einen kolorimetrischen Test Bestimmung der Glucose-Gehalt. Parallel dazu kann der Inhalt und die Zusammensetzung von Lignin bestimmt, wie in Teil I 3 beschrieben werden. Abbildung 2:. Umfassende lignocellulosischen Analyse von Pappelholz Hackschnitzel aus Pappel (Populus tremoloides) wurden zu den beschriebenen Protokoll unterzogen. Oben links: Matrix Polysaccharidzusammensetzung; Fuc Fucose; Rha Rhamnose; Ara Arabinose; Xyl Xylose; Man Mannose, Galaktose Gal; Glc Glucose; Inositol interner Standard.
