Summary
Cet article montre la dissection et l'incubation de la rétine de lapin et médiation par des particules de transfert de gènes de plasmides codant pour la GFP ou une variété de marqueurs subcellulaires dans les cellules ganglionnaires de la rétine.
Abstract
Systèmes de culture organotypiques de tissus nerveux fonctionnels sont des outils importants dans la recherche neurobiologique. Idéalement, un tel système devrait être compatible avec les techniques d'imagerie, les manipulations génétiques, et l'enregistrement électrophysiologiques. Nous présentons ici un système d'interphase simples de culture de tissu pour la rétine de lapin adulte qui ne requiert aucun équipement spécialisé et très peu d'entretien. Nous démontrons la dissection et l'incubation de la rétine de lapin et médiation par des particules de transfert de gènes de plasmides codant pour la GFP ou une variété de marqueurs subcellulaires dans les cellules ganglionnaires de la rétine. Rétines de lapin cultivés de cette manière peut être gardé en vie pendant 6 jours avec très peu de changements de la structure anatomique globale ou la morphologie de l'individu ganglionnaires et cellules amacrines.
Protocol
Faire des balles pistolet à gènes (OR)
- Faire 100X PVP (0.5mg/ml) dans EtOH 100%.
- Peser 30 mg de 1,6 Micron d'or BioRad microporteur et le placer dans un tube eppendorf de 1,5 ml.
- Calculer la quantité de plasmide nécessaire pour donner une concentration de 0,5-3 mg d'or plasmidique / mg, et le lieu du plasmide dans le tube avec les microporteurs or. Combinez plusieurs plasmides, si nécessaire.
- Amener le volume de plasmide à 100 ul avec de l'eau distillée.
- Ajouter 100 ul de la spermidine 0,05 M dans le tube. Vortex 30 secondes.
- Vortex 1 minute à pleine vitesse. Soniquer pendant 3-5 minutes ..
- Sec d'une longueur appropriée de tuyau Tefzel dans un appareil Biorad PDS-1000/He pendant 15 minutes.
- Après sonication, vortex pendant 1-2 minutes à pleine vitesse. Réduire la vitesse lente pour permettre au tube d'être ouvert alors que vortex.
- Ajouter 100 ul de 1 M de CaCl2 lentement à la chute de tube de sages tandis vortex.
- Laisser le tube à température ambiante pendant 10 minutes.
- Faire filtre 5 microns.
- Prenez deux seringues 5ml sans aiguilles.
- Retirer le piston, et de détacher les chapeaux noirs. Prendre de petits ciseaux, couper une partie de la calotte noire pour donner un anneau. Répéter l'opération sur l'autre plongeur au filet deux anneaux.
- Sandwich un filtre de 5 microns (petites pièces, Inc filtre en nylon, ½ pouces de diamètre) entre les deux anneaux, et poussez le sandwich dans la pointe de la seringue.
- Seringue Dangle plus un flacon de 50 ml conique.
- Après 10 minutes, le tube de vortex pendant 30 secondes.
- Centrifuger le tube pendant 30 secondes et sauver le culot.
- Ajouter 1 ml d'EtOH 100% à granulés. Utilisez la pointe de pipette pour briser le culot, et le vortex 30 secondes. Spin 30 secondes et retirer EtOH. Répétez 2 fois plus.
- Ajouter 1 ml d'EtOH à 100% au culot (rompre avec le pourboire). Placez ce dans le filtre 5 microns et laisser circuler à travers par gravité dans le tube 50ml conique. Utilisez plus EtOH que nécessaire pour laver le tube ou aider à les traverser.
- Spin le tube 50ml 2000rpm dans la centrifugeuse pendant 5-10 minutes. Retirer le surnageant, sauf à granulés.
- Selon la densité désirée de microporteurs nécessaire, ajouter 800μl-1.5ml 100% EtOH et correspondant 8 ul-15 ul solution de PVP.
- Swirl et se rendre immédiatement à l'appareil PDS-1000/He Biorad.
- Biorad PDS-1000/He appareil
- Débrancher le tube reliant le réservoir de gaz N2 sur le tube de séchage
- Sortez de séchage tuyau Tefzel de la machine
- Insérez une extrémité dans le tube 50ml conique, et joindre une seringue à l'autre extrémité du tube. Suce boue brune dans le milieu du tube.
- Insérez retour tube dans la machine.
- Attendre (sans rotation) pendant 4 minutes
- Après 4 minutes, sucer EtOH lentement et soigneusement, en veillant à ne pas perturber microporteurs.
- Tournez le tube pendant 1 minute.
- Après 1 minute, relier le tuyau reliant le réservoir de gaz N 2 au tube de séchage et de laisser tube sécher pendant 15 minutes.
- Après 15 minutes, couper le tuyau à la taille de balle pour être utilisé immédiatement ou stocké à 4 ° C dans un dessicateur. Les balles peuvent être stockées jusqu'à 3 mois.
Préparation d'un gène-gun
- Placez des balles dans une cartouche. Chaque pièce de la rétine peut être tiré avec des balles 1-3.
- Insérez la cartouche dans le gène-gun et joindre le pistolet à une source d'hélium. Régler la pression à 110 psi.
Préparation des supports
- Dissection moyennes
1 bouteille d'Ames solution (Sigma, 8,8 g) 1,9 g bicarbonate de sodium 10 ml stylo 1% / strep / L-Glutamine (1:100) (Gibco / Invitrogen) 990 ml d'eau distillée à 1L ------------------------------- 1 Litre - Filtrer les moyennes de dissection à l'aide d'un filtre de 0,22 um.
- Milieu d'incubation (500ml)
485 ml de milieu de dissection filtrée 5 ml de supplément de N2 à 1% (Gibco / Invitrogen) 10ml cheval de 1% de sérum (Sigma) 500 ul de rouge de phénol -------------------------------------------------- - 0,5 L - Filtrer le milieu d'incubation en utilisant un filtre de 0,22 um.
- Bubble O 2 dans le milieu de la dissection pendant 15 minutes avant le début du protocole de récolte rétine.
Préparation des chambres d'incubation de la rétine
- Sous une hotte, remplir plusieurs plats de 60 mm de profondeur (chambres d'incubation, Nunc) avec 25 ml de milieu d'incubation. Le nombre de plats en fonction du nombre de retInAs nécessaire.
- Placer un stand filtre dans chaque plat profond. Seules les extrémités de la barre ne doit pas être submergé.
- Placez tous les plats en profondeur dans l'incubateur jusqu'à ce que les rétines sont prêts.
- Remplir deux 100 mm boîtes de Pétri et mettre au banc de la dissection.
Préparation de la rétine de lapin
- Sacrifice d'un lapin selon des protocoles établis. Ce qui suit n'a pas à être effectuée sous une hotte.
- Avec des ciseaux à angle, l'insérer derrière l'œil dans l'orbite de l'œil du lapin, couper les membranes et les nerfs optiques qui sont attachés à l'œil.
- Soulevez doucement sur l'oeil et le laver avec les médias de dissection oxygénée.
- Placer l'œil (cornée vers le haut) dans le puits d'une trancheuse des yeux et fermez le couvercle.
- Placez la lame à l'horizontale juste sous le couvercle. Dans un mouvement fluide, tirer la lame sur l'oeil pour couper la cornée, en laissant une tasse de l'œil.
- En utilisant une pince, retirer la rétine de l'œil bien trancheuse et placez-le sur un papier filtre.
- Enlever le vitré et le cristallin par serrage une zone près du nerf optique et rompu tirant vers l'arrière sur un papier filtre. Répétez plusieurs fois jusqu'à ce que presque tous les corps vitré est retiré et la coupe oeil regarde dégonflé.
- Œilleton Placer dans une boîte de Pétri avec les médias de dissection à laver.
- Couper la tasse oeil dans le nombre souhaité de pièces (5 au maximum de pièces).
- Prenez un morceau de la Coupe des yeux et de le placer sous le microscope.
- Clamp la sclérotique et la choroïde légèrement ensemble sur le bord de la rétine à l'aide des pinces. Avec l'autre main, utilisez un pinceau pour brosser à droite entre la choroïde et la rétine.
- Utiliser court, mouvements doux, taquiner la rétine de la choroïde off jusqu'à ce qu'elle se détache.
- Coupez 1 pouce hors d'une pipette de transfert stérile. Utilisez cette option pour sucer la rétine et le placer dans une boîte de Pétri de milieu d'incubation à laver.
- En utilisant une autre pipette de transfert stérile avec 1 pouce coupé, transférer soigneusement la rétine sur un 0,4 um Millicell filtre (Millipore, Cat No: PICMORG50).
- Utilisez une brosse à orienter la rétine avec les cellules ganglionnaires latérales vers le haut.
- Aplatir la rétine en brossant légèrement sur les bords de la rétine. Minimiser toucher la couche de cellules ganglionnaires avec la brosse, autant que possible.
- Retirer l'excès sur le support de filtre avec une pipette de transfert.
- En utilisant des pinces, transférer le filtre sur un suctioner modifié. Dessiner sur l'suctioner 2-3 fois pour enlever toutes les moyennes d'incubation du filtre.
Gunning Gene et d'incubation de la rétine
- Sous une hotte, placer chacun de la rétine contenant des filtres sur les stands de filtre dans les plats de 60 mm de profondeur (chambres d'incubation).
- S'assurer que le support est en contact avec le dessous du filtre et que le milieu ne se répercutent pas sur les côtés du filtre sur la rétine. Le filtre doit agir comme une interface entre la rétine et moyennes entreprises.
- Tirez sur chaque morceau de la rétine avec deux balles. Placez pistolet à gènes directement au-dessus du tissu, à environ 3-4 cm de là.
- Placez toutes les chambres d'incubation sur un agitateur dans les 35 - 37 ° C incubateur.
- Remplacez-le par milieu d'incubation tous les jours. La rétine peut être incubé pendant une durée maximale de 6 jours.
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Discussion
1. Que puis-je faire avec cette méthode?
- Voir la morphologie cellulaire clairement.
- Cellules Label pour enregistrer à partir d'eux.
- Surexpriment les protéines, comme PSD95, mais également d'autres protéines qui modulent la réponse de la cellule, par exemple, les canaux ioniques, les récepteurs.
- Express ARN inhibiteurs.
2. Combien de temps puis-je conserver la rétine adulte?
- 4 jours n'est pas un problème pour le lapin adulte. Après six jours les cellules semblent «malades», c'est à dire les axones se rétracter, vous voyez un gonflement des dendrites et l'enregistrement des réponses lumière devient non fiable (seulement ~ 50% des cellules ont été trouvés à la lumière de réponses après cette date.
- Nous avons gardé la souris rétines pendant 2 jours. Les souris sont plus difficiles, parce que les rétines sont vascularisés, et aussi épais que la rétine de lapin.
3. Comment puis-je vous assurer que votre rétine est en bonne santé après cette période?
- L'étalon-or est l'enregistrement de leur part. Cellules ganglionnaires doit encore réagir à la lumière. Vous devez protéger votre tissu de la lumière pendant l'incubation pour éviter le blanchiment de l'photopigment, parce que vous avez pour disséquer la rétine hors de l'épithélium pigmentaire pour l'incubation.
- Nous aussi parfois utilisé l'enregistrement matrice de microélectrodes pour tester nos rétines.
4. Pourquoi voulez-vous de manipuler seulement quelques cellules de la rétine à la fois?
- Certaines questions ne peuvent être abordées autrement. Prenons par exemple pour les récepteurs GABA sur une cellule ganglionnaire. Vous pourriez utiliser bloquants GABA, mais vous auriez inhiber toutes la transmission GABAergique dans la rétine, et pas seulement l'entrée de la cellule que vous êtes intéressé po Il peut être très difficile de distinguer entre un effet sur cette cellule en particulier, et l'ensemble des effets de réseau " "sur la rétine entière.
- Si vous voulez voir la morphologie clairement, vous ne pouvez pas l'étiquette de toutes les cellules, sinon vous obtenez juste un gâchis.
5. Est-ce méthode appropriée comme une population tache?
- Gunning Gene n ° est une procédure aléatoire. Vous aurez de nombreuses cellules ganglionnaires, de nombreuses cellules amacrines déplacées, certaines cellules de Müller, et beaucoup moins de tous les autres types cellulaires.
6. Y at-il des "trucs" que je dois savoir pour le faire fonctionner?
- Pas vraiment. Mais il est important que vous fassiez la dissection de la rétine relativement rapidement, alors vous avez vos morceaux sur le filtre en moins de 30 minutes. Les pièces ne doivent pas être trop petite, environ un centimètre carré est ok. Attendez-vous des morceaux de 3-4 un œil de lapin.
- Gardez vos outils de dissection strictement loin de tout ce qui vient en contact avec des fixatifs et autres produits chimiques agressifs.
- Essayez de régler votre incubateur à 35 ° C plutôt que 37, donc la rétine n'est jamais trop chaud.
- Vous n'avez pas besoin d'ajouter des facteurs de croissance tels que le BDNF à votre support, au moins nous ne le faisons pas systématiquement, mais vous devez utiliser complément N2, sérum de cheval à 1%, et des antibiotiques. Nous fournissons une liste de toutes les choses que vous et aurez besoin d'un dossier complémentaire à cette documentation.
7. Pourriez-vous gène-gun autres choses, plutôt que de plasmides?
- Oui, nous avons utilisé colorant conjugué dextranes ou DII et Dio. Mais vous pouvez utiliser le calcium-indicateur colorants, ou à peu près tout ce que vous pouvez manteau sur balles d'or ou de tungstène.
8. Quelles sont les limites?
- Tout d'abord, le temps. Vous avez à couper le nerf optique, ce qui signifie que les cellules ganglionnaires finira dégénérer. Ce n'est pas un problème pour un maximum de 6 jours, mais après que nous n'allions pas faire confiance aux rétines plus. Maintenant, si vous voulez juste pour exprimer la GFP ou un autre cellule de remplissage marqueur, une incubation de 2-3 jours est suffisant, mais dans certains cas, comme lorsque vous voulez exprimer des ARN inhibiteurs, l'effet peut prendre 4 jours ou plus pour spectacle. Ici, vous devez garder à l'esprit le calendrier.
9. Quels sont les travaux d'autres chercheurs doit-on être au courant?
- Dans le domaine de la rétine, sans doute en laboratoire Rachel Wong à la Washington University. Il ya aussi beaucoup de travail les gens ont fait dans d'autres systèmes, comme la préparation des tranches hippocampe. Nous ne prétendons pas être en mesure de fournir une étude complète de la littérature, mais il faut vérifier les papiers dans la liste des références.
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References
- Landreth,, Agranoff, B. W. Explant culture of adult goldfish retina: a model for the study of CNS regeneration. Brain Res. 161, 39-55 (1979).
- Smalheiser, N. R., Crain, S. M., Bornstein, M. B. Development of ganglion cells and their axons in organized cultures of fetal mouse retinal explants. Brain Res. 204, 159-178 (1981).
- Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5, 27-39 (1982).
- Rehm, H., Schafer, T., Betz, H. Beta-bungarotoxin-induced cell-death of neurons in chick retina. Brain Res. 250, 309-319 (1982).
- Kim, S. U., Takahashi, H. Tissue culture study of adult human retina neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 29, 1372-1379 (1988).
- Caffe, A. R., Soderpalm, A., van Veen, T. Photoreceptor-specific protein expression of mouse retina in organ culture and retardation of rd degeneration in vitro by a combination of basic fibroblast and nerve growth factors. Curr Eye Res. 12, 719-726 (1993).
- Wong, H. C., Thompson, S., Yu, D. Y., Cringle, S. J., Alder, V. A., Taylor, S. J. Comparison of growth rates of bovine retinal and brain microvascular pericytes in different oxygen concentrations in vitro. Aust N Z J Ophthalmol. 23, 299-308 (1995).
- Seigel, G. M. The golden age of retinal cell culture. Mol Vis. 5, 4 (1999).
- Caffe, A. R., Ahuja, P., Holmqvist, B., Azadi, S., Forsell, J., Holmqvist, I., et al. Mouse retina explants after long-term culture in serum free medium. J Chem Neuroanat. 22, 263-273 (2001).
- Hatakeyama, J., Kageyama, R. Retrovirus-mediated gene transfer to retinal explants. Methods. 28, 387-395 (2002).
- Zhang, S. S., Fu, X. Y., Barnstable, C. J. issue culture studies of retinal development. Methods. 28, 439-447 (2002).
- Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
- Inoue, T., Hojo, M., Bessho, Y., Tano, Y., Lee, J., Kageyama, R. Math3 and NeuroD regulate amacrine cell fate specification in the retina. Development. 129, 831-842 (2002).
- Kretz, A., Hermening , S. H., Isenmann , S. A novel primary culture technique for adult retina allows for evaluation of CNS axon regeneration in rodents. J Neurosci Methods. 136, 207-219 (2004).
- Liljekvist-Larsson, I., Johansson, K. Retinal neurospheres prepared as tissue for transplantation. Brain Res Dev Brain Res. 160, 194-202 (2005).
- Reidel, B., Orisme, W., Goldmann, T., Smith, W. C., Wolfrum, U. Photoreceptor vitality in organotypic cultures of mature vertebrate retinas validated by light-dependent molecular movements. Vision Res. 46, 4464-4471 (2006).
- Xin, H., Yannazzo, J. A., Duncan, R. S., Gregg, E. V., Singh, M., Koulen, P. A novel organotypic culture model of the postnatal mouse retina allows the study of glutamate-mediated excitotoxicity. J Neurosci Methods. 159, 35-42 (2007).
- Johnston, S. A., Tang, D. C. The use of microparticle injection to introduce genes into animal cells in vitro and in vivo. Genet Eng (N Y). 15, 225-236 (1993).
- Lo, D. C., McAllister, A. K., LC, K. atz Neuronal transfection in brain slices using particle-mediated gene transfer. Neuron. 13, 1263-1268 (1994).
- Rajagopalan, L. E., Malter, J. S. Turnover and translation of in vitro synthesized messenger RNAs in transfected, normal cells. J Biol Chem. 271, 19871-19876 (1996).
- McAllister, A. K.
- Gan, W. -B., Grutzendler, J., Wong, W., Wong, R., Lichtman, J. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Sato, H., Hattori, S., Kawamoto, S., Kudoh, I., Hayashi, A., Yamamoto, I., et al. In vivo gene gun-mediated DNA delivery into rodent brain tissue. Biochem Biophys Res Commun. 270, 163-170 (2000).
- Zhang, G., Selzer, M. E. In vivo transfection of lamprey brain neurons by gene gun delivery of DNA. Exp Neurol. 167, 304-311 (2001).
- Sohn, R. L., Murray, M. T., Schwarz, K., Nyitray, J., Purray, P., Franko, A. P., et al. In-vivo particle mediated delivery of mRNA to mammalian tissues: ballistic and biologic effects. Wound Repair Regeneration. 209, 287-296 (2001).
- O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Klimaschewski, L., Nindl, W., Pimpl, M., Waltinger, P., Pfaller, K. Biolistic transfection and morphological analysis of cultured sympathetic neurons. J Neurosci Methods. 113, 63-71 (2002).
- Kettunen, P., Demas, J., Lohmann, C., Kasthuri, N., Gong, Y., Wong, R. O., et al. Imaging calcium dynamics in the nervous system by means of ballistic delivery of indicators. J Neurosci Methods. 11, 37-43 (2002).
- Gamper, N., Shapiro, M. S. Calmodulin mediates Ca2+-dependent modulation of M-type K+ channels. J Gen Physiol. 122, 17-31 (2003).
- Wirth, M. J., Wahle, P. Biolistic transfection of organotypic cultures of rat visual cortex using a handheld device. J Neurosci Methods. 125, 45-54 (2003).
- O'Brien, J., Lummis, S. C. Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells. Methods. 33, 121-125 (2004).
- Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 141, 41-53 (2005).
- Chow, L., Levine, E. M., Reh, T. A. The nuclear receptor transcription factor, retinoid-related orphan receptor beta, regulates retinal progenitor proliferation. Mech Dev. 77, 149-164 (1998).
- Rockhill, R. L., Daly, F. J., MacNeil, M. A., Brown, S. P., Masland, R. H. The diversity of ganglion cells in a mammalian retina. J Neurosci. 22, 3831-3843 (2002).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. J Comp Neurol. 451, 115-126 (2002).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morophological survey of rat retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 2019, 483-493 (2002).
- Stacy, R. C., Wong, R. O. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. J Comp Neurol. 456, 154-166 (2003).
- Strettoi, E., Pignatelli, V., Rossi, C., Porciatti, V., Falsini, B. Remodeling of second-order neurons in the retina of rd/rd mutant mice. Vision Res. 43, 867-877 (2003).
- Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. J Comp Neurol. 476, 254-266 (2004).
- Connaughton, V. P., Graham, D., Nelson, R. Identification and morphological classification of horizontal, bipolar, and amacrine cells within the zebrafish retina. J Comp Neurol. 477, 371-385 (2004).
- Edqvist, P. H., Hallbook, F. Newborn horizontal cells migrate bi-directionally across the neuroepithelium during retinal development. Development. 131, 1343-1351 (2004).
- Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J Cell Biol. 171, 313-325 (2005).
- Qin, Y., Xu, G., Wang, W. Dendritic abnormalities in retinal ganglion cells of three-month diabetic rats. Curr Eye Res. 31, 967-974 (2006).
- Roizenblatt, R., Weiland, J. D., Carcieri, S., Qiu, G., Behrend, M., Humayun, M. S. Nanobiolistic delivery of indicators to the living mouse retina. J Neurosci Methods. 153, 154-161 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult Mammalian retinas. PLoS ONE. 2, e221 (2007).
