Cet article propose une méthode pour isoler et cultiver la caille ou de poulet HH14<sup> -</sup> Soupape de cellules endocardiques et HH25 cellules mésenchymateuses coussin de soupape.
Abstract
Bonne formation et la fonction des valves cardiaques embryonnaires humaines est indispensable à la progression du développement. Le coeur embryonnaire précoce est un tube en U de l'endocarde entouré par myocarde. Le myocarde sécrète cardiaques gelée, une matrice riche en acide hyaluronique gélatineux, dans le auriculo-ventriculaire (AV) de jonction et des voies d'écoulement (OFT) lumen. Au stade HH14 valvulogenesis commence quand un sous-ensemble de cellules endocardiques recevoir des signaux du myocarde, l'endocarde subissent à la transformation mésenchymateuse (TEM), et envahissent la cardiaques gelée. Au stade HH25 les coussins valvulaires sont entièrement mesenchymalized, et c'est ce mésenchyme qui forme éventuellement l'appareil valvulaire et septale du cœur. Comprendre les mécanismes qui déclenchent et modulent les processus de différenciation cellulaire et l'EMT sont importantes en raison de leur connexion à de graves malformations cardiaques congénitales. Dans cette étude, nous présentons les méthodes pour isoler pré-EMT endocardique et post-EMT cellules mésenchymateuses, qui sont les deux phénotypes cellulaires différents du coussin prevalvular. Pré-EMT cellules endocardiques peuvent être cultivées avec ou sans le myocarde. Post-EMT cellules mésenchymateuses coussin AV peuvent être cultivées à l'intérieur des gels de collagène mécaniquement contraint ou sans stress. Ces 3D dans des modèles in vitro imitent les principaux événements morphogéniques valvulaire et sont utiles pour déconstruire les mécanismes de valvulogenesis stade précoce et tardive.
Protocol
1. Préparation Incuber cailles fertiles ou des oeufs de poule au stade 14 – (environ 2 jours) ou 25 (environ 4,5 jours) à 60% d'humidité et 37 ° C. Préparer la solution stérile de Earl saline équilibrée (EBSS) Ajouter 100 ml EBSS 10X à 600 ml d'eau 18 MQ Ajouter 2,2 g de bicarbonate de sodium Ajuster le pH de la solution à 7,2 Porter la solution jusqu'à 1000 ml Stériliser la solution en passant par un filtre de 0,2 u…
Discussion
La méthode pour isoler les cellules endocardiques du stade HH14 – coeurs initialement développé par Runyan et Markwald fournit un environnement contrôlé, dans un environnement in vitro pour étudier les facteurs qui déclenchent et modulent embryonnaire EMT 2. HH14 – explants endocardique cultivées sans myocarde ne subira pas d'EMT sans intervention biomécaniques ou biochimiques. Si le myocarde est à gauche sur l'explant il signalera un sous-ensemble de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche est soutenue par la Fondation Hartwell, l'American Heart Association (Scientist Development Grant # 0830384N) et la Fondation Leducq: 07CVD04 mitrale.
Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (44), e2159, doi:10.3791/2159 (2010).