Denna artikel kommer att erbjuda en metod för att isolera och odla vaktel eller kyckling HH14<sup> -</sup> Ventil endokardiell celler och HH25 ventil kudde mesenkymala celler.
Abstract
Korrekt bildning och funktion av embryonala hjärtklaffar är avgörande för utveckling progression. Den tidiga embryonala hjärtat är ett U-format rör av endokardiet omgiven av hjärtmuskeln. Myokardiet utsöndrar hjärt gelé, en hyaluronan-rika gelatinös matris, i atrioventrikulärt (AV) korsningen och utflöde (OFT) lumen. På scenen HH14 valvulogenesis börjar när en delmängd av endokardiell celler tar emot signaler från myokardiet genomgår endokardiell till mesenkymala transformation (EMT), och invadera hjärt gelé. På scenen HH25 den valvulär kuddarna är helt mesenchymalized, och det är denna mesenkym som till slut bildar valvulär och septal apparater i hjärtat. Att förstå de mekanismer som initierar och modulera processen med EMT och celldifferentiering är viktigt på grund av deras anknytning till allvarliga medfödda hjärtfel. I denna studie presenterar vi metoder för att isolera före EMT endokardiell och efter EMT mesenkymala celler, vilka är de två olika celler fenotyper av prevalvular dynan. Pre-EMT endokardiell celler kan odlas med eller utan hjärtmuskeln. Post-EMT AV-kudde mesenkymala celler kan odlas inne mekaniskt begränsad eller stressfri kollagen geler. Dessa 3D in vitro-modeller efterlikna nyckeln valvulär morphogenic händelser och är användbara för dekonstruerar mekanismer tidiga och sena skede valvulogenesis.
Protocol
1. Förberedelser Inkubera fertila vaktlar eller ägg kyckling till stadium 14 – (ca 2 dagar) eller 25 (ca 4,5 dagar) vid 60% luftfuktighet och 37 ° C. Förbered sterila Earls Balanced Salt Solution (EBSS) Tillsätt 100 ml 10X EBSS till 600 ml 18 Mohm vatten Tillsätt 2,2 g natriumbikarbonat Justera lösningens pH till 7,2 Koka upp lösningen upp till 1000 ml Sterilisera lösningen genom att passera genom en 0,2 ìm filter <…
Discussion
Metoden för att isolera endokardiell celler från scenen HH14 – hjärtan som ursprungligen utvecklades av Runyan och Markwald ger en kontrollerad, in vitro-miljö för att studera vilka faktorer som initierar och modulera embryonala EMT 2. HH14 – endokardiell explants odlade utan att hjärtmuskeln inte genomgå EMT utan biomekaniska eller biokemiska intervention. Om hjärtmuskeln är kvar på Explantation det kommer att signalera en delmängd av endokardiell celler genomgå mes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av Hartwell Foundation, American Heart Association (Scientist utveckling Grant # 0830384N) och stiftelsen Leducq: mitralis 07CVD04.
Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (44), e2159, doi:10.3791/2159 (2010).