Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Micro-injectie van A. aegypti embryo's om transgene muggen verkrijgen

doi: 10.3791/219 Published: July 4, 2007

Summary

In deze video, Nijole Jasinskiene toont de methoden die gebruikt worden om transgene Aedes aegypti muggen, die vectoren voor knokkelkoorts te genereren. De technieken voor het correct opstellen van micro-injectie naalden, droogmiddelen embryo's en het uitvoeren van micro-injectie worden aangetoond.

Abstract

In deze video, Nijole Jasinskiene toont de methoden die gebruikt worden om transgene Aedes aegypti muggen, die vectoren voor knokkelkoorts te genereren. De technieken voor het correct opstellen van micro-injectie naalden, droogmiddelen embryo's en het uitvoeren van micro-injectie worden aangetoond.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Voorbereiding van de micro-injectie

  1. Bloed te voeden muggen: voor injectie van maandag tot vrijdag voeden vrouwen op de vorige donderdag.
  2. Bereid glas naalden met behulp van het programma 3 of 2 (zie ook Materiaal).
  3. Leggen buis voor de embryo's is Drosophila cultuur flacon. Natte watten in de bodem, met een natte schijf van filtreerpapier te bedekken.
  4. Bereid plastic dekglas door steken dubbelzijdig tape om het ene uiteinde. Trim tape om dekglas, zodat het eindigt aan de rand van het dekglas.
  5. Bereid olie voor uitdroging (zie ook Materiaal)
  6. 150 ml plastic beker met een nat watje in de bodem, bedekt met een natte schijf van filtreerpapier (Whatman 80mm) om embryo's te houden na de injectie.

Opzetten van gedwongen leggen

  1. Verzamel 60-10 bloed gevoed vrouwtjes met het gebruik van een afzuiger en overbrengen naar het Drosophila cultuur flacon met natte katoen en filtreerpapier.
  2. Leg de muggen in insectory omstandigheden in het donker, en laat om eieren te leggen voor 1 uur en 15min.
  3. Laat volwassenen vliegen in de kooi en verwijder het filter papier schijf met embryo's.
  4. Om line-up eieren, doe dit dan onder ontleden scope. Met behulp van fijne tang nr. 5 of een geldboete penseel, plukken grijs tot darkish-grijs embryo's en schik in lijn op plein van 3MM Whatman papier doorweekt met water. Alle embryo's moeten in dezelfde richting, als injectie moet worden op de achterste paal. Het voorste einde van het embryo is iets breder dan de achterste. Droog het filter papier met embryo's door te drukken op droog filter papier om het (natte dingen zullen niet houden aan tape). De eieren overdracht, draai de schuif met de dubbelzijdige tape en druk voorzichtig op ten opzichte van de eieren. Het achterste einde van de eieren moeten heel dicht bij de rand van de dubbelzijdige tape.
  5. Uitdrogen van de embryo ongeveer 1 minuut. bij kamertemperatuur. Ze beginnen te licht kuiltje als ze droog.
  6. Bedek gedroogde embryo's met halogene olie om verdere uitdroging te voorkomen.

Micro-injectie van de embryo's

  1. Het belangrijkste aspect van een goede injectie is de kwaliteit van de naald (zie Materials).
  2. Vul een naald met de DNA-oplossing te worden geïnjecteerd met behulp van een microloader. Zeer weinig injectie oplossing is nodig: 1 tot 2 pi.
  3. Sluit de naald naar de Transjector, die de injectie tijd (Manu) en druk (600) regelt, en de tegendruk (250). Micro-injectie wordt uitgevoerd met behulp van een microscoop met een bewegend podium (Leica) op 10 x vergroting en micromanipulator. Indien nodig kan een verhoogd microscoop stadium voor te bereiden door het stapelen 4-5 microscoop dia's. Plaats het deksel slip dragen van de embryo's op verhoogd podium. Horizontaal injecteren embryo's om te voorkomen dat het scheuren van de endochorion; penetratie moet op de achterste paal. Voor injectie, ik houd de naald stil en verplaats het stadium van de microscoop.
  4. Injecteer 0,2-0,5 nl van de oplossing, overeenkomend met circa 1-5% van het embryo volume. Regel het injectievolume door het aanpassen van de injectie druk en tijd. De licht gebogen, uitgedroogd embryo's moeten weer hun gezwollen uiterlijk na de injectie.
  5. Kies embryo's van de dekking slip met fijne pincet of een fijn penseel, en leg ze in een plastic beker met natte katoen en nat filtreerpapier. Bedek bekerglas met tissue papier. Zijn plaats te houden met elastische band rond de velg en terug te keren naar insectary voorwaarden voor 4 dagen.

Post-injectie

  1. Vier dagen na, plaatst u voorzichtig embryo papier, embryo-kant naar beneden, op het water in grote plastic doos met een kleine hoeveelheid voedsel. Embryo's luik over een zeer lange periode: niet weg te gooien van de cultuur tot ten minste 4-5 weken na de injectie.

Opmerkingen

DNA voor injectie

Plasmide DNA-oplossing voor injectie werd geïsoleerd met behulp van EndoFree plasmide kit. Construct en Helper plasmide Meng in de juiste concentratie, neergeslagen met izopropanol. De pellet werd gewassen met 70% ethanol voor resuspenderen in injectie buffer. Vóór injectie schoon met behulp van DNA Millex-GV kolom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
1x Injection solution Buffer 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Construct plasmid DNA 0.5 mg/ml.
Helper plasmid DNA 0.3 mg/ml
EndoFree Plasmid kit Kit Qiagen
Millex-GV column SLGV RO4 NL To clean DNA.
Glass puller Instrument Sutter Instrument Co. Model P-87 Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100.Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50
Quartz puller Instrument Sutter Instrument Co. Model P-2000 Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
Injection glass needles Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument).
Aedes aegypti Animal Male and female mosquitos, to obtain embryos.
Drosophila culture vial For mosquito egg-laying.
Halocarbon oil Reagent Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1)
Forceps No5 Tool
Fine paintbrush Kolinsky Sable No. 0000
Whatman paper Tool
Microloader Tool Eppendorf 5242 956.003
Transjector Tool Eppendorf
Microscope Leica Microsystems With moving stage and micromanipulator.
3MM Whatman paper
double sided tape

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Micro-injectie van A. aegypti embryo's om transgene muggen verkrijgen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes. J. Vis. Exp. (5), e219, doi:10.3791/219 (2007).More

Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes. J. Vis. Exp. (5), e219, doi:10.3791/219 (2007).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter