Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos
Summary
Neste vídeo, Nijole Jasinskiene demonstra a metodologia utilizada para gerar transgênicos mosquitos Aedes aegypti, que são vetores da dengue. As técnicas para preparar corretamente agulhas microinjeção, os embriões desidratantes, e realizando microinjeção são demonstradas.
Abstract
Neste vídeo, Nijole Jasinskiene demonstra a metodologia utilizada para gerar transgênicos mosquitos Aedes aegypti, que são vetores da dengue. As técnicas para preparar corretamente agulhas microinjeção, os embriões desidratantes, e realizando microinjeção são demonstradas.
Protocol
Preparação antes da microinjeção Mosquitos alimentam de sangue: para injeção de segunda a sexta-feira fêmeas alimentam na quinta-feira anterior. Prepare agulhas de vidro usando o programa de 3 ou 2 (ver Materiais). Deitado de tubos para os embriões é Drosophila frasco de cultura. Algodão molhado no fundo, com um disco de papel de filtro molhado cobrindo-o. Prepare lamínula de plástico furando a fita dupla face a um fim. Fita guarnição para cobrir deslizamento de mod…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1x Injection solution | Buffer | 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8 | ||
| Construct plasmid | DNA | 0.5 mg/ml. | ||
| Helper plasmid | DNA | 0.3 mg/ml | ||
| EndoFree Plasmid kit | Kit | Qiagen | ||
| Millex-GV column | SLGV RO4 NL | To clean DNA. | ||
| Glass puller | Instrument | Sutter Instrument Co | Model P-87 | Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100. Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50 |
| Quartz puller | Instrument | Sutter Instrument Co | Model P-2000 | Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
| Injection glass needles | Prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 um micropipette puller. When the needle is new, the tip is sealed and usually breaks in the first or second injection or the glass needle tip can be beveled using a Brown type micro-pipette beveller (Sutter Instrument). | |||
| Aedes aegypti | Animal | Male and female mosquitos, to obtain embryos. | ||
| Drosophila culture vial | For mosquito egg-laying. | |||
| Halocarbon oil | Reagent | Oil for desiccation: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1) | ||
| Forceps No5 | Tool | |||
| Fine paintbrush | Sable | No. 0000 | ||
| Whatman paper | Tool | |||
| Microloader | Tool | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Transjector | Tool | Eppendorf | ||
| Microscope | Leica | With moving stage and micromanipulator. | ||
| 3MM Whatman paper | ||||
| double sided tape |
Cite This Article
Jasinskiene, N., Juhn, J., James, A. A. Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes. J. Vis. Exp. (5), e219, doi:10.3791/219 (2007).