Att odla neurala celler crest stamceller (NCSC) in vitro, är ett speciellt medium (NCSCM) krävs. Viktig del av NCSCM är kycklingembryo extrakt (CEE). Vi beskriver här exakta tekniker för att producera en maximal mängd av ren och hög kvalitet CEE, däribland detaljer isolering, maceration, centrifugering och filtrering.
Den neurallist beror på neuro-ektoderm under fosterutvecklingen och kvarstår bara tillfälligt. Tidiga experiment säkras redan pluripotenta stamceller som en integrerad del av neural crest 1. Fenotypiskt är neurallist stamceller (NCSC) definieras genom att samtidigt uttrycka p75 (låg-affina nervtillväxtfaktor receptorn, LNGFR) och SOX10 under sin migration från neural crest 2,3,4,5. Dessa stamceller kan differentiera till glatta muskelceller, chromaffin celler, nervceller och gliaceller, liksom melanocyter, brosk och ben 6,7,8,9. Att odla NCSC in vitro, en speciell neural crest stamceller medium (NCSCM) krävs 10. Den mest komplexa delen av NCSCM är beredningen av kycklingembryo extrakt (CEE) som representerar en viktig källa till tillväxt faktorer för NCSC liksom för andra typer av neurala explants. Andra NCSCM ingredienser bredvid CEE finns kommersiellt tillgängliga. Producera CCE använda laboratorieutrustning standardutrustning är det av stor vikt att veta om de utmanande uppgifter som isolering, maceration, centrifugering och filtrering. I detta protokoll beskriver vi exakt tekniker för att producera en maximal mängd av ren och hög kvalitet CEE.
Detta protokoll är baserad på modifieringar av förfaranden som har beskrivits tidigare 10,11. Förutom tidigare publikationer visar vi här den enskilde olika stegen i processen utvidgats. Detta stöder försöksledaren med viktiga detaljer säkerställa korrekta förfarandet och pålitliga resultat. Vidare, eftersom dissektion processen är en viktig del av CEE utvinning vi beskriver förfarandet för att ta embryon ur gulan säck i varje detalj. Det finns flera viktiga punkter att notera som diskuteras n…
The authors have nothing to disclose.
Stöd och råd av Markus Pajtler och Robert Bohrer var ovärderliga för visualisering av detta protokoll.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
11 days incubated chicken eggs | Sörries-Trockels Vermehrungszucht GmbH & Co.KG | |||
Alcoholic disinfection spray | Schülke & Mayr GmbH | |||
DMEMGlutamax | GIBCO Invitrogen | |||
Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | |||
Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One GmbH | |||
Pipet tips sterile | Starlab GmbH | |||
Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | |||
Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific AG | |||
Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One GmbH | |||
Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |