I denna artikel beskriver vi en enkel metod för skörd av enstaka celler från råtta primära neuronala kulturer och efterföljande transkriptom analys med ARNA förstärkning. Detta tillvägagångssätt är generaliserbara till alla celltyper.
Många genuttrycksanalys tekniker förlitar sig på material som isoleras från heterogena populationer av celler från vävnader homogenat eller celler i kultur. 1,2,3 Vid hjärnan, regioner, såsom hippocampus innehåller ett komplext arrangemang av olika celltyper, alla med distinkta mRNA profiler. Förmågan att skörda enskilda celler möjliggör en mer djupgående undersökning av de molekylära skillnaderna mellan och inom cellpopulationer. Vi beskriver en enkel och snabb metod för att skörda celler för vidare bearbetning. Pipetter som ofta används i elektrofysiologi används för att isolera (med aspiration) en cell av intresse och bekvämt sätta in den i ett Eppendorf-rör för ytterligare behandling med valfritt antal av molekylärbiologisk teknik. Våra protokoll kan modifieras för skörd av dendriter från cell kultur eller till och med enskilda celler från akut skivor.
Vi beskriver också den ARNA förstärkning metoden som en stor nedströms tillämpning av en enda cell isolering. Denna metod har utvecklats tidigare av vårt labb som ett alternativ till andra analyser genuttryck tekniker som omvänd transkription eller realtid polymeraskedjereaktion (PCR). 4,5,6,7,8 Denna teknik ger linjär amplifiering av polyadenylated RNA börjar med bara femtograms av material och resulterar i mikrogram mängder av antisense-RNA. Den linjärt förstärks materialet ger en mer exakt bedömning än PCR-exponentiell amplifiering av den relativa förekomsten av komponenter i transkriptom av de isolerade cell. Den grundläggande proceduren består av två rundor av förstärkning. Kortfattat är en T7 RNA-polymeras promotor sajt införlivas dubbelsträngad cDNA skapas från mRNA transkript. En övernattning för in vitro transkription (IVT) reaktion utförs därefter som T7 RNA-polymeras producerar många antisense avskrifter från strandade dubbla cDNA. Den andra omgången upprepar detta förlopp men med vissa tekniska skillnader eftersom utgångsmaterialet är antisense-RNA. Det är standard att upprepa den andra omgången, vilket resulterade i tre rundor av förstärkning. Ofta är den tredje rundan för in vitro transkription reaktion utförs med hjälp biotinylerad nukleosid trifosfater så att antisense-RNA produceras kan hybridiseras och upptäcks på en microarray. 7,8
Anteckningar och felsökning
Allmänna tips om molekylärbiologiska tekniker
Allmän beskrivning av ARNA arbetsordningen
Figur 4A visar den första rundan av ARNA förfarande. I den första delen reaktionen väljer poly-T delen av T7-oligo (DT) primer för mRNA-arter (långa vita rektangeln) genom att binda till Polya svansar. Vissa mikroRNA också polyadenylated och kommer att fångas av detta förfarande. Ännu viktigare är dock den vanligast förekommande RNA i cellen, ribosomala RNA, kommer inte. Detta oligo fungerar som en primer för omvänt transkriptas att syntetisera en kompletterande delen av cDNA (lång grå rektangel) med mRNA som mall. Den T7 delen av T7-oligo (DT) primer innefattar T7 RNA-polymeras promotor i ramen med sekvensen antisense till start mRNA. Detta används senare i in vitro transkription reaktion.
Därefter är det mRNA i mRNA / DNA-hybrid skapade i föregående steg delvis hydrolyserad genom RNase H skapa RNA "primer" (små vita rektanglar) liknande den Okazaki fragment som skapas i eftersläpande del DNA-syntesen. DNA-polymeras Jag använder RNA-fragment till bästa DNA-syntesen genom att använda DNA komplement till mRNA som mall. När den når nästa RNA fragmentet, dess 5 'till 3' nukleas aktivitet tar bort ribonucleotides och ersätter dem med deoxyribonucleotides. DNA-ligas läggs till ligate några trådar där utbyte av de ledande tråd är inte komplett. T4 DNA-polymeras tillsätts för att fylla i de områden där RNA-fragment tjänade som första primer till DNA-polymeras jag skapar en trubbig slutade dubbelsträngad cDNA som sedan renas innan du utför IVT reaktion.
I IVT reaktion binder T7 RNA-polymeras till T7 promotorn införlivas i dubbelsträngad cDNA och syntetiserar antisense-RNA-molekyler (långa svarta rektanglar) med hjälp av sense-strängen som mall. Detta fungerar som amplifieringssteg där tusentals antisense-RNA-molekyler produceras från varje dubbelsträngad cDNA molekyl (Figur 4A).
Den andra omgången, som avbildas i figur 4B, börjar med en omvänd transkription reaktion som skiljer sig något från den första omgången eftersom grundbeloppet RNA antisense (solid svart rektangel) och saknar polyadenylated svansen som var målgruppen för T7-oligo (DT) primer i första omgången. Därför är denna reaktion primas med slumpmässiga primers (små grå rektanglar) och RNA senare denatureras. Den andra delen reaktionen sedan grundmålas med T7-oligo (DT) primer, som binder till poly-En sekvens på 3 "i slutet av den meningen RNA som skapats i föregående omvänd transkription reaktion. En annan IVT Reaktionen utförs på samma sätt som i den första omgången. Denna andra runda är oftast upprepas minst en gång för att uppnå tre rundor av förstärkning från en enda cell.
Applikationer
De tekniker som vi har presenteras i denna artikel kan översättas till ett stort antal ansökningar. Den enda cell isolering protokoll kan modifieras för att användas i akuta skivor. 14 Även tekniskt mer utmanande, samma principer gäller i den här alternativa beredning. Dessutom, om storleken på pipetten är något justerad, kan inspelningar av fysiologi cellerna göras innan skörden möjliggör en väl kontrollerad undersökning av molekylära mekanismerna bakom fysiologiska utgångar. En annan liten ändring är att isolera processer från cellen soma. 15 För denna tillämpning samla cell kroppar med en pipett och sedan gå tillbaka med en fräsch pipett och samla 100-300 identifierade dendrites eller axoner per provröret. 16
När cellerna har skördats, jämförelser av mRNA abundances och kompositioner kan göras mellan olika och även inom samma cell populationer. Införliva biotinylerad-UTP i den tredje omgången ARNA möjliggör microarray analys för att fastställa dessa relativa mRNA abundances. Sammansättningen av den ursprungliga mRNA befolkningen kan också bestämmas efter ARNA proceduren med nästa generations sekvensering. Det förstärkta ARNA kan också användas för att bekräfta cellförsök fenotyp omvandling där en fullständig uppsättning mRNA från en cell typ transfekterade till en annan celltyp i syfte att förmå övergång fenotyp av den senare celltyp liksom i den förra, ett förfarande som utvecklats av labbet och kallas TIPeR. 17 Dessa studier är särskilt användbara för att studera sjukdomen stater och fenotyper cell och sådana studier pågår för närvarande i labbet. RT-PCR eller realtids-PCR kan utföras på det förstärkta materialet för att bekräfta ett uttryck för cell-specifika gener. Dessutom kan utvärderingar av effektiviteten i transfektion eller transduktion göras på enskild cellnivå.
Fördelar och begränsningar
Som framgår av abstrakt, eliminerar isolering av enskilda celler för analys i genomsnitt effekter setts med analys av heterogena cellpopulationer. Dessa genomsnitt effekter förvränga mRNA abundances i en enda cell med över-som representerar rikligt avskrifter och i genomsnitt ut och förhindra upptäckt av många låg-överflöd avskrifter. Flödescytometri kan användas för att sortera enskilda celler, men denna metod kräver kunskap om cellens specifika markörer och dyr utrustning. 18 Laser fånga microdissection antingen med UV-eller IR laser fånga microdissection system möjliggör enskild cell och även subcellulära fånga men kräver celler av intresse för placeras på ytan av mycket tunna sektioner. 19 Liknande flödescytometri kräver laser fånga microdissection också dyr utrustning.
En av de stora fördelarna med elektroden baserade samlingen teknik som beskrivs ovan är att värdefull elektrofysiologiska data kan erhållas från cellen av intresse före skörd, vilket möjliggör funktionell och transkriptom analys som ska utföras på en och samma cell. 20 En nackdel med vår teknik är att det kräver erfarenhet av att använda micromanipulators. Utredarna känner micromanipulators finner denna teknik mycket intuitivt, men kommer personer utan sådan erfarenhet måste bli bekväm med erforderlig fina rörelser.
Naturlig del av varje förstärkningsteknik skall förmånssystemet förstärkning av vissa avskrifter baserade på storlek och nukleotid sammansättning. 4,6,7 polymeraskedjereaktion (PCR) tekniker som omvänd transkription polymeraskedjereaktion (RT-PCR) och snabb förstärkning av cDNA ändar (RACE) resultera i exponentiell amplifiering av avskrifter, medan ARNA amplifieringsförfarande resulterar i linjär förstärkning. Således ligger en av de stora fördelarna med ARNA förfarandet i sin förmåga att bättre bevara den relativa förekomsten av mRNA transkript med endast linjärt förstärka eventuella fel eller fördomar som inträffar i amplifieringsprocessen i motsats till exponentiellt förstärka sa fel och fördomar.
Det ARNA förfarande i kombination med microarray analys möjliggör jämförelser av mRNA abundances mellan enskilda celler av liknande eller olika morfologi, behandlade eller obehandlade. Dessutom kan förstärkas material lämnas för nästa generations sekvensering. 5,8 bör dock vara försiktig i sådana analyser sedan, i motsats till användningen av slumpmässiga grundfärg för förfarande, oligo-dT primas förfarande som beskrivs ovan fördomar amplifiering av 3 'änden av mRNA och leder i allmänhet liten förkortning av efterföljande förstärkt material med varje runda. Försiktighet bör iakttas vid analys av microarray resultat med standardiserade metoder som några falska frånvarande samtal kan uppstå kortas något förstärkt material. Dessutom kommer samtidigt sekvensering resultat att ge de fulla 5 "sekvens av de flesta av de ursprungliga mRNA, den 5" kan sekvenser av vissa mRNA missas. Av dessa skäl bör antalet omgångar av kompletteringar vara begränsad.
The authors have nothing to disclose.
Tack till Kevin Miyashiro för plätering och underhålla cellkulturer, till Dr Terri Schochet för att tillhandahålla cellkulturer för de bilder som ingår i detta dokument. Dessutom, tack till Kevin Miyashiro, Dr Peter Buckley, och Tiina Pertiz för inmatning på ARNA förfarande. Finansieringen av detta arbete var från National Institute on Aging, National Institute för psykisk hälsa och Human Resources Fakta medel Finder från Commonwealth of Pennsylvania.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Spiegelgas coverslips | Carolina Biological | 63-3029 | ||
Nunc 35×10 mm culture dishes | Fisher | 12-565-90 | ||
Water for cell culture | Lonza | 17-724Q | For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips | |
Poly-D-Lysine MW70-150K | Sigma | 6407 | ||
Laminin, ultrapure | BD Bioscience | 354239 | ||
Boric acid | Sigma | B0252 | ||
MEM with Earle’s salts and glutamax | Invitrogen | 41090-101 | For plating cells | |
D-glucose | Sigma | G8769 | ||
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
Horse serum | Invitrogen | 16050 | ||
Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma | C1768 | ||
MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Invitrogen | 11095-098 | For growing cells | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | ||
Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length) | Kimble Chase | 34500 99 | Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. | |
HBSS | Invitrogen | 14175 | Any solution will work as long as the components won’t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+) | |
1ml syringe | BD | 309628 | ||
Needle | BD | Gauge depends on the diameter of the pipettes | ||
dNTP mix | Amersham | 28-4065-51 | ||
dt-T7 oligo | Custom | Midland Certified | ||
Second strand buffer (5x) | Invitrogen | Y01129 | ||
DTT | Supplied with second strand buffer | |||
E.coli DNA Ligase | Invitrogen | 100002324 | ||
DNA polymerase I | Invitrogen | 100004926 | ||
Rnase H | Invitrogen | 18021-071 | ||
Megascript T7 kit | Ambion | AM1334 | ||
Random primers | BMB | 11034731001 | ||
Superscript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 56575 | in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT | |
MEGAclear Kit | Ambion | 1908 | ||
MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28206 | ||
T4 DNA polymerase | Invitrogen | 100004994 | ||
Rnasin | Promega | N251B | ||
Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit | Ambion | AMIL1791 | ||
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-87 | Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook | |
Micromanipulator | Olympus | Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models | ||
Pipette Holder | Warner Instruments | MP-S15A | Will vary with micromanipulator and pipette O.D. | |
Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 |