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Summary
Una técnica quirúrgica para la implantación de los transmisores de telemetría disponible comercialmente utilizados para la medición continua de biopotencial (un ECG), frecuencia cardiaca, temperatura corporal y la actividad locomotora en ratones libres de movimiento se muestra. Recomendaciones y protocolos para la atención post-operatoria y el alivio del dolor, mejorar la recuperación, el bienestar y la tasa de supervivencia se presentan también.
Abstract
El ratón de laboratorio es la especie animal de elección para la mayoría de la investigación biomédica, tanto en el ámbito académico y la industria farmacéutica. Los ratones son de un tamaño manejable y relativamente fácil en casa. Estos factores, junto con la disponibilidad de una gran cantidad de mutantes espontáneos e inducidos experimentalmente, que los ratones de laboratorio ideal para una amplia variedad de áreas de investigación.
En la investigación cardiovascular, farmacológicos y toxicológicos, la medición precisa de los parámetros relacionados con el sistema circulatorio de animales de laboratorio a menudo se requiere. Determinación de la frecuencia cardiaca, la variabilidad del ritmo cardíaco, y la duración de los intervalos QT y PQ se basan en el electrocardiograma (ECG). Sin embargo, la obtención de curvas de ECG fiables, así como los datos fisiológicos tales como la temperatura corporal en ratones puede ser difícil con las técnicas convencionales de medición, que requieren la conexión de sensores y cables atados a un restringido, o incluso unaaesthetized animales. Los datos obtenidos de esta manera deben ser interpretados con cautela, ya que es bien sabido que la restricción y la anestesia puede tener una gran influencia de artefactos en los parámetros fisiológicos de 1, 2.
Radiotelemetría permite que los datos se recogerán de animales conscientes y sin ataduras. Las medidas pueden llevarse a cabo incluso en los animales se mueven libremente, y sin que el investigador como en la proximidad de los animales. Por lo tanto, las fuentes conocidas de artefactos pueden ser evitados, y las mediciones precisas y confiables son seguros. Esta metodología también se reduce la variabilidad interanimal, reduciendo así el número de animales utilizados, lo que hace esta tecnología es el método más humano de monitoreo de parámetros fisiológicos en animales de laboratorio, 3, 4. Los avances constantes en la tecnología de adquisición de datos y la miniaturización implante significa que ahora es posible grabar los parámetros fisiológicos y la actividad locomotora de forma continua y en tiempo real a más largo periods tales como las horas, días o incluso semanas 3, 5.
Aquí se describe una técnica quirúrgica para la implantación de un transmisor de telemetría disponible comercialmente utilizados para la medición continua de la temperatura corporal, la actividad locomotora y biopotencial (es decir, onelead ECG), de los cuales la frecuencia cardiaca, la variabilidad del ritmo cardíaco, y PQ y los intervalos QT puede ser establecido en ratones freeroaming, sin ataduras. También se presentan antes de la operación procedimientos y protocolos para el post-operatorio de cuidados intensivos y el tratamiento del dolor para mejorar la recuperación, el bienestar y la supervivencia en ratones implantados 5, 6.
Protocol
La experimentación animal ha sido aprobado por la Oficina Cantonal de Veterinaria (Zurich, Suiza). La vivienda y los procedimientos experimentales fueron de acuerdo con la ley suiza de Protección Animal y se ajustan a la Directiva europea sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos (Directiva 2010/63/EU DEL PARLAMENTO EUROPEO Y DEL CONSEJO de 22 de septiembre de 2010).
1. Pre-operatorio consideraciones
1.1 Los ratones: las necesidades de vivienda, estado general y vigilancia de la salud
Se recomienda que los ratones entrega de los proveedores o transferidos de colonias de roedores externa debe llegar a las instalaciones de la vivienda al menos dos semanas antes de la cirugía. Este período debe permitir que los animales para adaptarse al nuevo entorno y las instalaciones específicas de las condiciones de vivienda. Los ratones, los animales que viven social, deben ser alojados en grupos compatibles durante este período de adaptación. Para la supervisión de una persona delos alimentos y el consumo de agua, cada ratón se encuentra separado de 3 días antes de la cirugía hasta 10 días después de la implantación quirúrgica del transmisor. La línea de tiempo para el establecimiento de telemetría de soporte transmisor-ratones se muestra en la Figura 1. Es crucial que los animales proceden de la cirugía de buena salud y condición. Por lo tanto, antes de la cirugía, los animales deben ser controlados una vez al día durante 2-3 días respecto a la condición general (apariencia, postura, comportamiento espontáneo), así como por el peso corporal, consumo de alimentos y agua. Estos datos están documentadas en un registro médico (estado general de salud y la hoja de control de datos, Tabla 1) para establecer los niveles individuales de referencia de la condición general y la salud general y bienestar. Todos los animales que presenten síntomas de enfermedad o deterioro de las condiciones generales antes de la cirugía debe ser excluido de la prueba.
1.2 Cabello recorte de un día antes de la cirugía
El día antes de la implantación, con el fin de afeitar el animals de la cirugía, los ratones son anestesiados brevemente en un pequeño (8x8x8cm) cámara de plexiglás con sevoflurano (8%) o el isoflurano (5%) con oxígeno puro (600 ml / min). Después de la pérdida del reflejo de enderezamiento, el ratón se saca de la cámara anterior y el pelo del cuello y el abdomen se recorta con el animal tumbado en posición de yacer dorsal, la anestesia se mantiene durante aproximadamente 5 minutos con una máscara nasal con sevoflurano 3-4% o isoflurano 1,5-3% de oxígeno puro con un caudal de 600 ml / min. Después de cortar el pelo, los animales se les permite despertar y entonces se trajo de vuelta a su jaula.
2. Implantación
2.1 Entorno de funcionamiento, preparación del transmisor de telemetría
En el día de la implantación, todos los procedimientos relativos a la preparación del transmisor y la cirugía se lleva a cabo en un banco de trabajo con una campana de flujo laminar equipada con un microscopio quirúrgico. Condiciones asépticas están asegurados por el uso de instrum autoclavelos padres y los materiales esterilizados y desinfectar el banco de trabajo 7. Antes de la implantación, los transmisores de telemetría (ETA-F10, Data Sciences International, St. Paul, MN, EE.UU.) se prepara en primer lugar. Después de quitar de su paquete estéril, los cables del transmisor se acortan a una longitud apropiada para el tamaño del ratón para ser implantados. En la mayoría de los ratones adultos en reproducción o líneas consanguíneas, el electrodo rojo se puede reducir a aproximadamente 42 mm y el electrodo blanco / incoloro a una longitud de aproximadamente 55 mm. Tubo de aislamiento se retira de la parte distal (sensorial) parte de los conductores: aproximadamente 20 mm de tubo se retira el electrodo de color rojo, de aproximadamente 10 mm de tubo se retira el electrodo blanco / incoloro. La parte distal de cada electrodo (que ahora es sin tubo) se forma en un bucle fijando el extremo con suturas de seda fina (PERMA-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt, Alemania). Después de la preparación de los electrodos, el transmisor se coloca en wade solución salina estéril rm listo para ser implantado cuando el animal está anestesiado y preparado quirúrgicamente.
2.2 Anestesia
En 5-10 minutos antes de la inducción de la anestesia por inhalación, una mezcla de midazolam (4 mg / kg) y fentanilo (0,04 mg / kg) se administra por vía subcutánea como premedicación, proporcionando así la sedación y la analgesia preventiva. General de la anestesia por inhalación se induce mediante la colocación de los animales en la cámara de inducción y la introducción del agente anestésico volátil (sevoflurano 8% o 5% de isoflurano en oxígeno puro 600 ml / min). Cuando el animal muestra una pérdida del reflejo de enderezamiento se transfiere al banco de trabajo bajo la campana de flujo laminar, y se coloca en posición de yacer dorsal sobre una placa de metal especialmente diseñado, provisto de una máscara nasal y los tubos del aparato de anestesia. La anestesia se mantiene la respiración espontánea (3-4% de sevoflurano o isoflurano 1,5-3% de oxígeno puro a una velocidad de flujo de 600 ml / min). Durante la anestesia, el ojo del animals están protegidos con un ungüento (vitamina A, Baush & Lomb, Steinhausen, Suiza). Mientras está acostado en la placa de metal que el animal es calentado por la superficie del baño de agua caliente (39 ° C + / -1) de la mesa de trabajo.
2.3 Cirugía
La piel de la región anterior del cuello y el abdomen se desinfecta con alcohol al 70%. A 1 - incisión de 1,5 cm de largo en la piel se hace desde el tórax inferior a lo largo de la línea media del abdomen. El negativo (blanco / incoloro) no está tunelizado subcutáneamente desde el tórax hasta el cuello, donde se hace una pequeña incisión (≤ 0,5 cm) en la dirección longitudinal. La piel y los tejidos están preparados para hacer espacio para la fijación del asa de alambre del electrodo. El lazo de alambre se fija entre los músculos situados a la derecha de la tráquea, con dos suturas de seda fina (PERMA-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt, Alemania). La herida en el cuello se cierra con suturas absorbibles (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Alemania), en capas. La pared abdominal se abrió en la línea alba y el cuerpo del transmisor de telemetría se coloca en la cavidad abdominal de los ratones. El lazo de alambre de lo positivo (rojo) se sutura a la apófisis xifoides con suturas de seda de tal manera que se sitúa entre el hígado y el diafragma en la región abdominal superior izquierda (Figura 2). Luego, las capas musculares de la región abdominal se cierra con suturas absorbibles (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Alemania). Antes de finalmente cerrar la pared abdominal, una mezcla de Sulfadoxin y Trimetoprim [(30 mg / kg y 6 mg / kg, respectivamente; disuelto en 1 ml de solución salina (0,9%) y en la temperatura corporal de aproximadamente (38 a 39 ° C)] se inyecta en la cavidad abdominal a los efectos de la profilaxis anti-infecciosos y para apoyar la homeostasis de fluidos. Finalmente, la piel de la región abdominal se restaura con grapas (precisión, 3 Cuidado de la Salud M, St. Paul, MN, EE.UU.).
3. Cuidados post-operatorios
Tras la finalización de la cirugía y la anestesia, 0,1 mg / kg de buprenorfina (Temgesic, Essex Chemie AG, Lucerna, Suiza) y 5 mg / kg de meloxicam (Metacam, Boehringer Ingelheim, Basilea, Suiza) se administra por vía subcutánea para el tratamiento del dolor, y la los animales se dejan en el agua tibia (39 ° C + / -1) la superficie de la mesa de trabajo para recuperar aproximadamente 2 horas. Junto con el alivio del dolor (dos veces al día: la buprenorfina, 0,1 mg / kg y meloxicam 5 mg / kg), la terapia de apoyo consiste en 300 l de glucosa (5%) y 300 l de solución salina (0,9%) calentado a la temperatura corporal, se aplica por vía subcutánea dos veces al día durante 4 días. Para apoyar la recuperación de más, vale la pena ofrecer a los animales con una botella de bebida que contiene más del 15% de solución de glucosa. Durante el período de recuperación de 40-10 días, se recomienda que los animales se mantienen calientes. Por lo tanto, en nuestro caso, los ratones se encuentran en un gabinete de calentamiento (30 ° C + / - 1). Vigilancia de las condiciones generales y el peso corporal, comoasí como el consumo de alimentos y agua, se realiza una vez al día según el estado general y vigilancia de la salud hoja de datos (Tabla 1) durante 10 días después de la operación. Criterios de valoración humana, es decir, el sacrificio de un animal para evitar el sufrimiento innecesario y el dolor si la progresión de la recuperación es satisfactoria, se realizan bajo las siguientes condiciones:
- En caso de mal estado general, es decir, el animal es bastante apáticos (no hay movimiento después de haber sido tocado / difusión) y la superficie del cuerpo se siente frío a pesar del calentamiento, el animal debe ser sometido a la eutanasia de inmediato.
- Si, el día 4 después de la implantación del transmisor, el animal muestra signos claros de la apatía, es muy agresivo o no muestra la ingesta de alimentos, se debe practicar la eutanasia de inmediato.
- El día 8 después de la implantación del transmisor, el animal tiene que mostrar un claro aumento en el peso corporal en comparación con el anterior post-operatorio días. Además, se ha de consumir en lEste 80% de la ingesta de alimentos antes de la operación diaria. Si una de estas condiciones no se cumple, el animal debe ser sometido a la eutanasia de inmediato.
A los 10 días después de la implantación, el animal se traslada de nuevo a la sala de animales en condiciones de alojamiento estándar. Los ratones deben ser alojados en grupos compatibles para permitir la interacción social y para prevenir los efectos adversos de largo plazo de viviendas individuales, que pueden tener un impacto sustancial en la lectura de los experimentos posteriores 8, 9. Los ratones deben tener un período de al menos 4 semanas de convalecencia después de la implantación del transmisor antes de que el primer experimento se lleva a cabo y se inicia la adquisición de datos.
4. De adquisición de datos
La recolección de datos se inicia al tocar al animal con un imán, con lo cual el transmisor está encendido. Dataquest ART Software (Data Sciences International, St. Paul, MN, EE.UU.), coordina la detección, recopilación, análisis y graphical presentación (en forma de formas de onda) de las señales de uno o más animales. El programa de adquisición de datos recoge las señales enviadas a la computadora de los convertidores y los receptores a través de una matriz de intercambio de datos (Data Sciences International). Este programa puede recopilar datos para un periodo específico de tiempo a intervalos regulares o de la muestra de forma continua y guardar los datos en el disco duro del ordenador. Dado que la gama y la calidad de la señal emitida depende fuertemente de la composición material de la jaula y equipo a su alrededor (por ejemplo, metal vs plástico), se sugiere que la placa de receptor se coloca lo más cerca a los animales como sea posible, por ejemplo, bajo la jaula de los animales o por encima de la zona experimental de banco, por ejemplo, de laboratorio o en cinta. Se recomienda que la configuración correcta del sistema de transmisión de grabación y los datos se comprueba al hacer un breve examen de las mediciones en tiempo real en modo de muestreo continuo. Después de que los datos han sido recogidos y almacenados, se pueden trazarTed, que se enumeran y analizan para una variedad de diferentes parámetros mediante el programa de análisis. Los detalles de la configuración del sistema de registro (por ejemplo, la definición del modus muestreo), y software de análisis (por ejemplo, para los parámetros de variabilidad del ritmo cardíaco, PQ intervalo y el intervalo QT establecido a partir de biopotencial / ECG curvas) se pueden encontrar en los manuales del fabricante. Pistas valiosas para la planificación biométricos y los métodos estadísticos útiles para la adquisición de datos telemétricos y la interpretación son publicados en otros lugares 3.
5. Los resultados representativos:
Un esquema general del procedimiento descrito se muestra en la Figura 1. La posición del transmisor implantado, incluyendo la localización de los electrodos para la obtención de biopotenciales del corazón (un ECG) se muestra en la Figura 2. Ejemplos de datos en bruto a corto plazo, las curvas de biopotencial (un ECG), y de largo plazo de la frecuencia cardíaca, temperatura central del cuerpo y las grabaciones de la actividad locomotora de los distintoslos ratones se dan en las Figuras 3 y 4, respectivamente. La Figura 5 muestra un ejemplo de los datos publicados a partir de mediciones a largo plazo en grupos de ratones después de un experimento. Otros parámetros se pueden establecer a partir de las curvas de biopotenciales. Ejemplos para la presentación de los parámetros de variabilidad del ritmo cardíaco 5, el intervalo QT y PQ intervalo de 10, 11 se han publicado en otros lugares.
Tabla 1. Estado general de salud y la hoja de control de datos. Haga clic aquí para descargar la hoja. Esta plantilla facilita el seguimiento del estado general un ratón individual y la salud. Examen inicial de la apariencia de un animal, la postura y el comportamiento espontáneo, así como la determinación del peso corporal y consumo de alimentos y el agua debe ser establecida antes de la cirugía de implantación una vez al día durante 3 días. La comparación de las determinaciones basales con los obtenidosdía durante 10 días después de la cirugía sirve para evaluar la progresión de la recuperación post-operatoria. Además, el post-operatorio de atención y tratamiento del dolor están bien documentados en la forma de un expediente médico. Las instrucciones sobre criterios de valoración humana se dan con el fin de facilitar las decisiones sobre si un ratón debe ser sacrificado para evitar el dolor y el sufrimiento innecesarios si el animal no cumple los criterios para una recuperación rápida después de la implantación.
Figura 1. Lista para el establecimiento de telemetría de soporte transmisor de los ratones. Orden cronológico de los procedimientos relativos a la implantación de un transmisor que muestra los momentos en los que puede ser un ratón utilizados para experimentación y adquisición de datos.
Figura 2. Radiografía / croquis ubicación de la muestra Telemet implantadory transmisor. El cuerpo del transmisor se coloca en la cavidad abdominal. El cable positivo se transforma en un lazo de alambre y se fija a la apófisis xifoides con puntos de sutura. El polo negativo es un túnel subcutáneo desde el tórax hasta el cuello y se fija como un asa de alambre entre los músculos al lado de la tráquea. La radiografía se toma a partir de la publicación de los autores anteriores en 9 animales de laboratorio.
Figura 3. Biopotencial curvas. Impresión de una prima de plomo curvas de ECG de un ratón y consciente del mismo animal bajo anestesia inhalatoria con sevoflurano. La frecuencia cardíaca se calcula de forma automática por el sistema de telemetría. La secuencia de 3 segundos grabados bajo anestesia indica una frecuencia cardíaca de 440 latidos por minuto. La curva registrada en el ratón consciente muestra una frecuencia cardíaca de 660 latidos por minuto, lo que cae dentro del rango esperado para la frecuencia cardíaca durante el modo detasa de actividades físicas tales como el aseo o comer. De las curvas de ECG biopotencial / un plomo, los parámetros de variabilidad del ritmo cardíaco, intervalo entre latidos, y PQ y los intervalos QT se puede establecer con el uso de software del fabricante.
Figura 4. Datos en bruto a partir de mediciones a largo plazo en ratones sanos y enfermos. La frecuencia cardíaca (latidos por minuto), la temperatura corporal central (° C) y la actividad locomotora (cuentas) se mide cuando los ratones son alojados individualmente en su jaula sin ningún tipo de alteración de los procedimientos de hombre o experimental. La frecuencia cardíaca se registraron durante 30 segundos cada 5 minutos (frecuencia de muestreo de 1000 Hz). La temperatura central del cuerpo se muestra durante 10 segundos cada 5 minutos. La actividad locomotora se graba continuamente y se almacena en intervalos de 5 minutos. Cinco minutos de los puntos de datos se remontan a 6,5 días. Las mediciones de telemetría se registran de tres ratones con diferentescondiciones corporales. El ratón sano muestra un ritmo circadiano claro con un aumento en los valores normales fisiológicas y de comportamiento la actividad locomotora en la oscuridad (noche) de fase. Por el contrario, después de una cirugía mayor, la frecuencia cardíaca aumenta, sobre todo en la fase de luz del día, y la actividad locomotora está deprimido. El ratón tercio sufría de la enfermedad crónica de su tumor, el ritmo circadiano de la frecuencia cardíaca y temperatura corporal central un aspecto aplanado, y la actividad locomotora disminuye. Datos representativos de las mediciones de la frecuencia cardiaca (los valores normales y después de una cirugía mayor) se han tomado de la publicación de los autores anteriores en Altex 12.
Figura 5. Ejemplo de presentación de los resultados de las mediciones de telemetría a largo plazo después de un experimento. La cifra es tomada de la publicación de los autores anteriores en un animales de laboratorio. Como un experimento ejemplar, un isofl de 50 minutosanestesia urane o sevoflurano se llevó a cabo. El impacto a largo plazo de los anestésicos sobre la frecuencia cardiaca, temperatura corporal y la actividad locomotora de los animales estaban despiertos se comparó. El uso de 16 transmisores implantados los ratones, los datos de telemetría se registraron en ocho ratones por anestesia, mientras que los animales fueron alojados individualmente y se les permite vagar libremente en sus jaulas. Para el análisis de los efectos a largo plazo postanestésica, se tuvo en cuenta que los valores varían en gran medida durante un ciclo de 24 horas ya que los ratones son activos principalmente durante la noche. Por lo tanto, los medios de los valores de telemetría para cada animal se calcularon por separado para la noche (12 h oscuridad) y el día (12 horas de luz) fases. Los valores normales de un individuo se establecieron mediante el cálculo de los medios de los tres días previos a la anestesia. Por cada día después de la anestesia, la media de la fase de oscuridad y la luz se comparó con los valores normales del individuo, resultando en valores delta. Por lo tanto, los valores delta representan la desviación de los valores normales (establecido antesa la anestesia) en el correspondiente 12 días y horas de la noche. Las columnas representan la media de ocho ratones, barras indican la desviación estándar. Los asteriscos indican significación de p ≤ 0,05 (Una forma de análisis de la varianza para la comparación de medias de los grupos en cada uno de los cuatro días después de la anestesia con los valores normales).
Discussion
Radiotelemetría es una poderosa alternativa a los métodos convencionales de medición de parámetros fisiológicos en la investigación biomédica. De alta calidad los sistemas de telemetría que consiste en implantable transmisores, receptores y de adquisición de datos y el hardware y software de análisis están disponibles en el mercado, incluso para animales tan pequeños como los ratones. Telemetría representa la única técnica disponible para la recolección de datos de restricciones, los ratones se mueven libremente. Al usar este método, ahora es posible obtener datos de forma continua y / o por períodos más largos de tiempo de los animales que residen en su propio entorno familiar, lo que reduce el estrés de los animales y la consiguiente artefactos experimentales. La forma y posición de los cables ha sido optimizado para obtener las señales, incluso durante los movimientos rápidos (por ejemplo, luchando, corriendo, luchando) o en una postura vertical 9. Por lo tanto, las mediciones precisas se pueden obtener durante los experimentos, por ejemplo, durante la anestesia, el estrés enproducción, mientras que correr en una cinta, durante los experimentos conductuales, en experimentos de infección, y muchas otras situaciones experimentales.
Sin embargo, con el fin de obtener datos fiables, reproducibles y libres de artefactos, es crucial para excluir a las influencias ambientales, y prestar especial atención a la importancia de las condiciones estandarizadas. Se recomienda que la sala está aislada del ruido electrónico y acústico, incluyendo sonido ultrasónico, a la que los ratones son especialmente sensibles. Además, no se producen problemas, como visitantes o no con los procedimientos experimentales, se debe permitir la hora de realizar las mediciones. Para evitar la interferencia influencias (particularmente en el caso de las mediciones de jaula), todos los procedimientos de cría necesaria debe ser completada en el cuarto antes de comenzar cada medición. Además, la vivienda de los ratones machos, sobre todo si se utilizan en grupos o individualmente, pueden tener un impacto en las mediciones y deben ser considerados cuando se plaexperimentos nning 9. Además, los ratones deben ser sanos y libres de patógenos murinos, ya que las infecciones latentes o manifiestos, así como las enfermedades o daños a la salud, pueden tener una influencia considerable en los parámetros fisiológicos y el comportamiento de la actividad. En consecuencia, los ratones que se recuperan totalmente después de la implantación y disponer de tiempo suficiente para adaptarse a que lleva el transmisor antes de comenzar cualquier experimento.
La recolección de datos por radio telemetría en ratones requiere la implantación previa quirúrgica del transmisor de telemetría. Esto debe ser realizado únicamente por personal capacitado con habilidades quirúrgicas con el fin de minimizar el trauma tisular y el dolor y la angustia posterior. Para los experimentadores la celebración de las habilidades quirúrgicas básicas o avanzadas, incluso (micro-), se recomienda llevar a cabo los primeros ensayos en cadáveres frescos del ratón usando implantes de formación (es decir, muñecos, proporcionado por el fabricante) para establecer los procedimientos y familiarizarse con los detalles de este tipode la cirugía. Después de esta formación, la mayoría de los experimentadores sería capaz de implantar este tipo de transmisores con éxito y llegue a un dominio útil después de una pocas implantaciones.
Condiciones de asepsia debe mantenerse durante la cirugía para reducir la carga microbiológica y el riesgo de infecciones de bajo. Sin embargo, la esterilidad completa no puede ser proporcionada debido a algunas condiciones de esterilidad específicas, en conflicto en los ratones (por ejemplo, efecto de enfriamiento de recoger el cabello extensa y desinfección, falta de sentido práctico de vendajes para proteger las heridas). Por lo tanto, profilaxis contra la infección se administra durante la implantación. Diseñados a la medida de tratamiento analgésico y un plan de monitoreo claramente definidos, así como adecuada atención post-operatoria desempeñan un papel crucial en el resultado satisfactorio de la experiencia.
En general, la implantación quirúrgica de un transmisor de telemetría en ratones será estresante para el animal. En particular, si la modificación genética en las especificacioneslíneas IFIC ratón influye en el fenotipo y menoscaba la condición de los animales del cuerpo, complicaciones en el período peri-operatorio y el aumento de las tasas de mortalidad después de la implantación podría ser un riesgo. Para evitar el sufrimiento innecesario, los individuos que exhiben recuperación insatisfactoria o convalecencia prolongada debe ser puesto en el experimento y se sacrificó antes de llegar a una fase moribunda. Para este propósito, una hoja de datos (Tabla 1: estado general de salud y la hoja de control de datos) para facilitar el seguimiento sistemático de los síntomas críticos y el asesoramiento en los puntos finales humana ha sido establecida. Por lo tanto, la recuperación está documentado en el estilo de una historia clínica o un diario de laboratorio, lo que hace que la realización de esta metodología (es decir, procedimiento de implantación y recuperación post-operatoria) transparente a las autoridades competentes y organismos responsables del bienestar animal para la experimentación animal (por ejemplo, IACUC).
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Charles River Alemania para proporcionar ratones CD-1. También queremos agradecer a Robin Schneider y el personal del laboratorio central de apoyo biológico en ratones de la vivienda. Rogamos gracias Nicholls flora por su excelente asistencia técnica y el profesor Kurt Burki para ofrecer generosamente las instalaciones de investigación y recursos.
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Medicina Número 57 telemetría ratón ratones la implantación del transmisor punto final humano cuidados post-operatorios cuidados intensivos reanimación cirugíaErratum
Formal Correction: Erratum: Implantation of Radiotelemetry Transmitters Yielding Data on ECG, Heart Rate, Core Body Temperature and Activity in Free-moving Laboratory Mice
Posted by JoVE Editors on 10/09/2016.
Citeable Link.
Corrections in the Protocol and Discussion sections have been made to: Implantation of Radiotelemetry Transmitters Yielding Data on ECG, Heart Rate, Core Body Temperature and Activity in Free-moving Laboratory Mice
Step 1.2 in the Protocol has been updated from:
1.2 Hair clipping at one day prior to surgery
The day prior to implantation, in order to shave the animals for surgery, mice are anesthetized briefly in a small (8x8x8cm) Perspex chamber using sevoflurane (8%) or isoflurane (5%) in pure oxygen (600 mL/min). After loss of the righting reflex, the mouse is taken out of the chamber and the anterior neck and abdominal hair is clipped with the animal lying in dorsal recumbence; anesthesia is maintained for approximately 5 minutes with a nose mask with sevoflurane 3-4% or isoflurane 1.5-3% in pure oxygen at a flow rate of 600 mL/min. After clipping the hair, the animals are allowed to awaken and are then brought back to their home cage.
to:
After the last health check or directly prior surgery, in order to shave the animals for surgery, mice are anesthetized briefly in a small (8x8x8cm) Perspex chamber using sevoflurane (8%) or isoflurane (5%) in pure oxygen (600 mL/min). Shaving the animals one day before surgery prevents hair stubbles in the operating field. After loss of the righting reflex, the mouse is taken out of the chamber and the anterior neck and abdominal hair is clipped with the animal lying in dorsal recumbence; anesthesia is maintained for approximately 5 minutes with a nose mask with sevoflurane 3-4% or isoflurane 1.5-3% in pure oxygen at a flow rate of 600 mL/min. After clipping the hair, the animals are allowed to awaken and are then brought back to their home cage.
Step 2.3 in the Protocol has been updated from:
2.3 Surgery
The skin of the anterior neck and abdominal region is disinfected with 70% ethanol. A 1- to 1.5-cm-long incision in the skin is made from the lower thorax along the midline to the abdomen. The negative (white/colourless) lead is tunnelled subcutaneously from the thorax to the neck, where a small incision (≤0.5 cm) is made in the longitudinal direction. The skin and underlying tissues are prepared to make space for the fixation of the wire loop of the electrode. The wire loop is fixed between the muscles located to the right of the trachea, using two thin silk sutures (PERMA-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt, Germany). The wound in the neck is then closed with absorbable sutures (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Germany) in layers. The abdominal wall is then opened at the linea alba and the body of the telemetric transmitter is placed into the abdominal cavity of the mouse. The wire loop of the positive (red) electrode is sutured to the xiphoid process with silk sutures in such a way that it lies between the liver and the diaphragm in the left upper abdominal region (Figure 2). Then, the muscle layers of the abdominal region are closed with absorbable sutures (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Germany). Before finally closing the abdominal wall, a mixture of Sulfadoxin and Trimethoprim [(30 mg/kg and 6 mg/kg, respectively; dissolved in 1 mL of saline (0.9%) and at approximately body temperature (38-39°C)] is injected into the abdominal cavity for the purposes of anti-infective prophylaxis and to support fluid homeostasis. Finally, the skin of the abdominal region is restored with staples (Precise, 3 M Health Care, St. Paul, MN, USA).
to:
2.3 Surgery
The skin of the anterior neck and abdominal region is disinfected for 5 minutes with 70% ethanol, chlorhexidine or iodine using a soaked cotton swap. A 1- to 1.5-cm-long incision in the skin is made from the lower thorax along the midline to the abdomen. The negative (white/colourless) lead is tunnelled subcutaneously from the thorax to the neck, where a small incision (≤0.5 cm) is made in the longitudinal direction. The skin and underlying tissues are prepared to make space for the fixation of the wire loop of the electrode. The wire loop is fixed between the muscles located to the right of the trachea, using two thin silk sutures (PERMA-Handseide, 6-0, Ethicon, Norderstedt, Germany). The wound in the neck is then closed with absorbable sutures (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Germany) in layers. The abdominal wall is then opened at the linea alba and the body of the telemetric transmitter is placed into the abdominal cavity of the mouse. The wire loop of the positive (red) electrode is sutured to the xiphoid process with silk sutures in such a way that it lies between the liver and the diaphragm in the left upper abdominal region (Figure 2). Then, the muscle layers of the abdominal
region are closed with absorbable sutures (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Germany). Before finally closing the abdominal wall, a mixture of Sulfadoxin and Trimethoprim [(30 mg/kg and 6 mg/kg, respectively; dissolved in 1 mL of saline (0.9%) and at approximately body temperature (38-39°C)] is injected into the abdominal cavity for the purposes of anti-infective prophylaxis and to support fluid homeostasis. Finally, the skin of the abdominal region is restored with staples (Precise, 3 M Health Care, St. Paul, MN, USA) or intracutaneous, running, absorbable sutures (VICRYL 6-0, Ethicon, Norderstedt, Germany).
Step 3 in the Protocol has been updated from:
3. Post-operative care
After completion of surgery and anesthesia, 0.1 mg/kg of buprenorphine (Temgesic, Essex Chemie AG, Lucerne, Switzerland) and 5 mg/kg of meloxicam (Metacam, Boehringer Ingelheim, Basel, Switzerland) is administered subcutaneously for pain treatment, and the animals are left on the warm (39°C +/-1) surface of the work bench to recover for approximately 2h. Together with pain relief (twice daily: buprenorphine, 0.1 mg/kg and meloxicam 5 mg/kg), supportive therapy consisting of 300 μL glucose (5%) and 300 μL saline (0.9%) warmed to body temperature, is applied subcutaneously twice daily for 4 days. For further recovery support, it is worthwhile providing the animals with an additional drinking bottle containing 15% glucose solution During the recovery period of 4-10 days, it is recommended that the animals are kept warm. Therefore, in our case, the mice are housed in a warming cabinet (30°C +/- 1). Monitoring of general condition and body weight, as well as food and water consumption, is performed once daily according to the general condition and health monitoring data sheet (Table 1) for 10 days post-operatively. Humane endpoints, i.e. the sacrifice of an animal to avoid unnecessary suffering and pain if progression of recovery is unsatisfactory, are realised under the following conditions:
i. If in poor general condition, i.e. the animal is substantially apathetic (no movement after being touched/pushed) and its body surface feels cold despite warming, the animal should be euthanatized immediately
ii. If, on day 4 after transmitter implantation, the animal shows clear signs of apathy, is extremely aggressive or does not show any food intake, it should be euthanatized immediately.
iii. On day 8 after transmitter implantation, the animal has to display a clear increase in body weight in comparison to the preceding post-operative days. Moreover, it has to consume at least 80% of the pre-operative daily food intake. If one of these conditions is not met, the animal should be euthanatized immediately.
At 10 days after implantation, the animal is transferred back to the animal room under standard housing conditions. Mice should be housed in compatible groups to allow social interaction and to prevent the adverse effects of long-term individual housing, which can have substantial impacts on the read-out of subsequent experiments8, 9. Mice should have a period of at least 4 weeks convalescence after transmitter implantation before the first experiment is conducted and data acquisition begins.
to:
After completion of surgery and anesthesia, 0.1 mg/kg of buprenorphine (Temgesic, Essex Chemie AG, Lucerne, Switzerland) and 5 mg/kg of meloxicam (Metacam, Boehringer Ingelheim, Basel, Switzerland) is administered subcutaneously for pain treatment, and the animals are left on the warm (39°C +/-1) surface of the work bench to recover for approximately 2h. Together with pain relief (twice daily: buprenorphine, 0.1 mg/kg and meloxicam 5 mg/kg), supportive therapy consisting of 300 μL glucose (5%) and 300 μL saline (0.9%) warmed to body temperature, is injected subcutaneously twice daily for 4 days. For further recovery support, it is worthwhile providing the animals with an additional drinking bottle containing 15% glucose solution During the recovery period of 4-10 days, it is recommended that the animals are kept warm. Therefore, in our case, the mice are housed in a warming cabinet (30°C +/- 1). Monitoring of general condition and body weight, as well as food and water consumption, is performed once daily according to the general condition and health monitoring data sheet (Table 1) for 10 days post-operatively. Humane endpoints, i.e. the sacrifice of an animal to avoid unnecessary suffering and pain if progression of recovery is unsatisfactory, are realised under the following conditions:
i. If in poor general condition, i.e. the animal is substantially apathetic (no movement after being touched/pushed) and its body surface feels cold despite warming, the animal should be euthanatized immediately
ii. If, on day 4 after transmitter implantation, the animal shows clear signs of apathy, is extremely aggressive or does not show any food intake, it should be euthanatized immediately.
iii. On day 8 after transmitter implantation, the animal has to display a clear increase in body weight in comparison to the preceding post-operative days. Moreover, it has to consume at least 80% of the pre-operative daily food intake. If one of these conditions is not met, the animal should be euthanatized immediately.
At 10 days after implantation, the animal is transferred back to the animal room under standard housing conditions. In case staples have been used, these should be removed 7-10 days after surgery; absorbable sutures have not to be removed. Mice should be housed in compatible groups to allow social interaction and to prevent the adverse effects of long-term individual housing, which can have substantial impacts on the read-out of subsequent experiments8, 9. Mice should have a period of at least 4 weeks convalescence after transmitter implantation before the first experiment is conducted and data acquisition begins.
The 4th paragraph in the Discussion has been updated from:
Aseptic conditions should be maintained during surgery to keep the microbiological burden and the risk of infections low. However, complete sterility cannot be provided because of some specific, sterility conflicting conditions in mice (e.g., cooling effect of extensive hair clipping and disinfection, impracticality of bandages to protect the wounds). Thus, anti-infective prophylaxis is administered during the implantation. Well tailored analgesic treatment and a clearly defined monitoring plan as well as adequate post-operative care play a crucial role in the satisfactory outcome of the experiment.
to:
Aseptic conditions should be maintained during surgery to keep the microbiological burden and the risk of infections low. However, if there are doubts that asepsis was breached because of some specific, sterility conflicting conditions in mice (e.g., cooling effect of extensive hair clipping and disinfection, impracticality of bandages to protect the wounds). Anti-infective prophylaxis should be administered during the implantation. Well-tailored analgesic treatment and a clearly defined monitoring plan as well as adequate post-operative care play a crucial role in the satisfactory outcome of the experiment.
