Antenne planteorganer er beskyttet af overhuden, en supramolekylær biopolyester-voks samling. Vi præsenterer protokoller til at overvåge selektiv fjernelse af epi-og intracuticular voks fra tomatfrugt neglebånd på molekylære og mikro skalaer af solid-state NMR og atomic force mikroskopi, henholdsvis, og at vurdere krydsbinding kapacitet manipuleret kutikulære biopolyesters.
Kutikula, et hydrofobt beskyttende lag på de overjordiske dele af landplanter, fungerer som en alsidig beskyttende barriere til forskellige biotiske og abiotisk stress og også regulerer vandstrømmen fra det ydre miljø. 1. En biopolyester (cutin) og langkædede fedtsyrer voksarter) danner den primære strukturelle netværk af kutikula, funktionelle integritet kutikulære lag afhænger den ydre "epicuticular 'lag såvel som blanding bestående af cutin biopolymer og' intracuticular har voks 2 heri, beskriver vi et omfattende protokol. at udvinde voks udtømmende fra kommercielle tomat (Solanum lycopersicum) frugt neglebånd eller fjerne epicuticular og intracuticular voks sekventielt og selektivt fra neglebånd komposit. Den metode rensedysen og Schäffer (2001) blev tilpasset til den trinvise ekstraktion af epicuticular og intracuticular voks fra frugt hårstrået. 3,4 At overvågeproces med sekventiel voks fjernelse, solid-state krydspolarisation magic-vinkel-spinning (CPMAS) 13 C-NMR-spektroskopi blev anvendt parallelt med atomic force mikroskopi (AFM), der giver molekylær-niveau strukturelle profiler af bulk materialer suppleret med oplysninger om mikroskala topografi og ruheden af de kutikulære overflader. At evaluere tværbindende kapacitet afvoksede cuticula fra dyrkede vildtype-og enkelt-genet mutante tomater, blev MAS 13C-NMR anvendes til at sammenligne de relative andele af oxygeneret alifatiske (CHO og CH2O) kemiske dele.
Udtømmende afvoksning ved trinvis Soxhlet-ekstraktion med et panel af opløsningsmidler med varierende polaritet tilvejebringer et effektivt middel til at isolere voks dele baseret på hydrofobe egenskaber deres alifatiske og aromatiske bestanddele, samtidig med at den kemiske struktur af cutin biopolyester. Den mekaniske ekstraktion af epicuticular voksarter og Selective fjernelse af intracuticular voks, når de overvåges af komplementære fysiske metoder, giver en hidtil uset mulighed for at undersøge neglebånd forsamlingen: denne tilgang afslører den supramolekylære organisering og strukturelle integration af forskellige typer af voks, at arkitektur cutin-voks matrix, og den kemiske Sammensætningen af hver bestanddel. Desuden viser faststof 13C-NMR forskelle i de relative antal af CHO-og CH2O kemiske dele til vildtype-og mutant røde modne tomater. NMR-teknikker giver særlige værktøjer til fingeraftrykket den molekylære struktur af kutikulære materialer, der er uopløselig amorf og kemisk uensartede. Som en noninvasiv overflade-selektiv imaging teknik, afgiver AFM en effektiv og direkte måde til at undersøge den strukturelle organisering af kutikulære samling på nm-um længdeskala.
De her beskrevne protokoller muliggør detaljerede molekylære og mikro karakterisering af et kompleks umedgørlig plantemateriale uden behov for destruktiv kemisk nedbrydning. For at undersøge blanding af cutin biopolyester med forskellige lipider (voks), der kontrollerer den strukturelle organisering af kutikulære forsamling, 10 har vi gennemført og overvåget procedurer for selektiv fjernelse af epicuticular og intracuticular voks fra den heterogene kutikulære blanding. Faststof-13C NMR blev anvendt til at måle ekstraktion af voks molekylære bestanddele, og atomic force-mikroskopi tjente til at undersøge samtidige ændringer i overfladeruhed. 6,11 at sammenligne de tværbindende kapacitet indkobling fra dyrkede vildtype og enkelt-genet mutante tomater blev faststof 13C-NMR også anvendt til at estimere det relative antal af CHO-og CH2O kemiske dele.
En række af design-funktions af denne protokol er bemærkelsesværdige. Som voksmaterialer omfatter en lang række lipider, behandling af frugt kutikula med en række opløsningsmidler med forskellige polariteter er afgørende for at opnå fuldstændig afvoksning. Desuden kan afvoksning variere fra 8 til 24 timer afhængigt af arten af de kutikula prøver. For at udtrække epicuticular voks konsekvent fra intakte frugt hårstrået, er det bydende nødvendigt at anvende klæbemiddelbelægningen ensartet på overfladen.
Solid-state-CPMAS 13C NMR 12 er en hurtig kvalitativ metode til identifikation af forskellige strukturelle komponenter af meget heterogene og uopløselige vegetabilske biopolymerer samtidig bevare deres oprindelige fysiske karakteristika 13 traditionelle løsning-NMR kan også anvendes til at karakterisere de ekstraherede voks blandinger. Hvis kvantitativ vurdering af funktionelle grupper er ønsket for intakte planteceller polymerer, 5 hi-fi direkte polarisationsniveauer magic-angle spinning (DPMAS) 13C NMR 5,14 bør anvendes som en supplerende metode. Nøjagtig kvantificering af de funktionelle grupper kræver omhyggelig optimering af recirkulations gange, excitations pulslængder, og styrken af heteronukleær afkobling. 15. heteronukleær afkobling kan indstilles til en 1H feltstyrke i området fra 50 kHz til 185 kHz ved anvendelse af TPPM 16 eller Spinal 7 metoder. Ud over disse parametre afhænger af følsomheden af CPMAS målinger på spin-lock tid og Hartmann-Hahn matchende tilstand. 15 i stedet for traditionelle CPMAS, kan en skrå-amplitude CP (RAMP-CP) teknik anvendes for at maksimere tværs polarisationsretning effektivitet ved at variere 1H amplitude lineært (~ 20-50%) eller tangentielt samtidig med amplituden af 13C feltstyrke konstant under spin-lock periode (eller omvendt). 17,18 Gennemførelse af CPMAS målinger på mindst to forskellige roTor-spinning frekvenser er vigtigt at skelne spinning sidebånd fra de vigtigste spektrale toppe.
Samtidige AFM målinger foretaget i kontakt tilstand sætte direkte billeder af neglebånd overfladen tilstand med høje scanningshastigheder og høj opløsning, 19 for eksempel under sekventiel fjernelse af voksagtige bestanddele. Opererer AFM i tappe (ikke-kontakt) tilstand, kan anvendes som et alternativ til overfladen karakterisering af fine "bløde" plantematerialer, undgå mulig beskadigelse på grund af laterale (forskydning) kræfter og skrabning af prøveoverfladen. 5,20 I begge tilfælde , sekventiel erhvervelse af flere billeder af det samme sted på overfladen tjener til at identificere en overflade beskadigelse som følge af "probe-overflade interaktioner 'i AFM målinger. 6,21 For optimal reproducerbarhed bør AFM prober med fjederkonstanter er egnede til bløde kutikulære overflader være anvendes, og konstant temperatur og fugtighed skal opretholdes. 6,15,20 </sop> betragtninger solid-state NMR tilbyder en molekylær profil ensemble gennemsnit (bulk) ejendomme i tomat frugt neglebånd, atomic force billedbehandling giver en komplementær noninvasiv sonde 22,23 til sporing overflade topografi af disse udsøgt komplekse makromolekylære forsamlinger. 1,2
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af US National Science Foundation tilskud # MCB-0741914 og MCB-0843627; yderligere infrastruktur blev ydet støtte på City College i New York af National Institutes of Health 2 G12 RR03060-26 fra National Center for Research Resources. Vi takker for JKC Rose gruppe i Cornell University Plantebiologi Institut for at give M82 (vildtype) og CM15 (mutant) tomat neglebånd. Vi takker Dr. Spyros Monastiriotis fra CCNY Kemiteknik gruppe af professor Alexander Couzis for hans generøse hjælp med AFM eksperimenter. Vi takker Ms Lauren Gohara for grafisk design support.
Name of the reagent | Company | Catalog no. | Comments |
Sodium acetate trihydrate | Sigma-Aldrich | S8625-500G | |
Pectinase | TCI America | P0026 | EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator |
Cellulase | Sigma-Aldrich | C1184-100KU | EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator |
Glacial Acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Extremely hazardous |
Incubator/shaker | New Brunswick Scientific Co. | Model No.G24 | MFG No.M1036-000G |
Vacuum Oven | Precision Scientific | 31566 | |
Variac Controller | |||
Sintered glass thimble (85 mm/25mm) | VWR | 89056 | |
Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm) | VWR | 28320 | |
Methanol | VWR | EMD-MX0485-7 | |
Glass wool | VWR | RK20789 | |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-100 | |
Tweezers | VWR | 82027-452 | |
Chloroform | VWR | EM-CX1050-1 | |
Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
Nitrogen gas | |||
Parafilm | VWR | 52858 | |
Paper towels | VWR | 89002-984 | |
Kim wipes | VWR | 21905-026 | |
Gum arabic | Sigma | G9752 | |
1.6 mm fastMAS zirconia rotor | Varian (Agilent) | ||
NMR spectrometer | Varian 600 NMRS | standard bore magnet | |
Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | Model compound for CPMAS |
Glutamine | Sigma-Aldrich | 49419 | Model compound for CPMAS |
Adamantane | Sigma-Aldrich | 100277 | To calibrate 90° pulse in NMR |
Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA) | Digital Instruments (Bruker AXS) | ||
Nanoscope software | Digital Instruments (Bruker AXS) | Version 5.30r3sr3 (2005) | |
AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip) | Veeco (Bruker AXS) | Model NP-20 | |
Light microscope | Digital Instruments | ||
Magnetic puck | Digital Instruments | ||
Double sided tape | VWR | ||
Fruit Peeler | |||
Büchner funnel | VWR | 89038 |