Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

משלוח ין transfection ב אדם בתאי סרטן הלבלב באמצעות גורם גדילה עוריות קולטן במיקוד לטין מבוסס Nanovectors מתוכנן

doi: 10.3791/3612 Published: January 4, 2012

Summary

סוג B ג'לטין מערכת מבוססת nanovectors מהונדסים (גנס) פותחה עבור משלוח גן transfection מערכתית בטיפול בסרטן הלבלב. על ידי שינוי עם קולטן גורם הצמיחה אפידרמיס (EGFR) פפטיד מסוים על פני השטח של nanparticles, הם יכולים למקד על הקולטן EGFR ולשחרר פלסמיד תחת צמצום הסביבה, כגון ריכוזים גבוהים גלוטתיון תאיים.

Abstract

יותר מ 32,000 חולים מאובחנים עם סרטן הלבלב בארצות הברית בשנה, המחלה קשורה עם תמותה גבוהה מאוד 1. קיים צורך דחוף לפתח קלינית לתרגום רומן אסטרטגיות טיפוליות שיכולות לשפר את הסטטיסטיקה העגומה ההישרדות של חולי סרטן הלבלב. למרות בריפוי גנטי של סרטן הראו הבטחה עצומה, האתגר העיקרי הוא בפיתוח של מערכת המסירה בטוח ויעיל, אשר יכול להוביל ביטוי transgene מתמשכת.

לטין הוא אחד biopolymer הטבע המגוונים ביותר, בשימוש נרחב במוצרי מזון ותרופות. מחקרים קודמים של המעבדה שלנו הראו כי סוג ב 'ג'לטין יכול פיזית לתמצת DNA, אשר שימרה את המבנה supercoiled של יעילות transfection פלסמיד ומשופר עם מסירת תאיים. עד thiolation של ג'לטין, הקבוצות sulfhydryl יכול להיות מוחדר פולימר והיה fהאג"ח ORM דיסולפיד בתוך חלקיקים, אשר מייצב את הקשר כל דיסולפיד מורכבים ופעם נשבר בשל נוכחותם של גלוטתיון ב cytosol, מטען ישוחרר 2-5. פולי (אתילן גליקול) (PEG), שונה גנס, כאשר ניתנת למחזור הדם מערכתית, מספק ארוכי מחזור פעמים מעדיפים מטרות מסת הגידול עקב החדירות-היפר של neovasculature על ידי חדירות משופרת אפקט שימור 6. מחקרים הראו על הביטוי של הקולטן לגורם הצמיחה אפידרמיס (EGFR) על Panc-1 אדם אדנוקרצינומה תאים בלבלב 7. על מנת פעיל היעד סרטן הלבלב קו התא, פפטידים EGFR ספציפי היה מצומדות על פני החלקיקים דרך spacer PEG. 8

רוב אנטי הגידול טיפולים גן מתמקדים הממשל של גנים מדכאי סרטן, כגון p53 wild-type (WT-p53), כדי להחזיר את תפקוד הפרו אפופטוטיים בתאי 9 10. בשנת סרטן הלבלב, רוב התאים יש מוטציות בחלבון p53 וגורם אובדן של פעילות אפופטוטיים. עם כניסתה של p53-wt, אפופטוזיס ניתן לתיקון נוסף מעורר מוות של תאים בתאי סרטן 11.

בהתבסס על הרציונל האמור לעיל, עיצבנו EGFR מיקוד פפטיד שונה חלקיקי ג'לטין thiolated למסירה WT-p53 גן ויעילות משלוח מוערכת ב transfection Panc-1 תאים.

Protocol

1. ההכנה של ה-DNA פלסמיד Encapsulated EGFR ממוקד חלקיקים לטין

  1. סינתזה של ג'לטין thiolated
    1. Thiolated ג'לטין היו מסונתז כשיטה הקודם 2-5, על ידי נטיה קוולנטיים עם 2-iminothiolane על קבוצות אמינו ראשונית של סוג ב 'ג'לטין. 1 גרם ג'לטין מומס במים היה 100 מ"ל deionized ו מודגרות עם הידרוכלוריד 20 מ"ג 2 iminothiolane בטמפרטורת החדר למשך 15 שעות.
    2. מגיב Unreacted הוסר על ידי דיאליזה נגד פתרון HCl 5 מ"מ, ואחריו פתרון 1 HCl mM במשך 3 שעות כל אחד. מטוהרים thiolated ג'לטין היה להקפיא יבשים מאוחסנים 4 ° C לשימוש נוסף.
  2. ההכנה של ה-DNA המכילים חלקיקים
    1. 200 מ"ג thiolated היה ג'לטין מומס במים ו-pH של התמיסה הותאם 7 על ידי תוספת של תמיסת 0.2 M NaOH. 1mg DNA נוספה מעורב בעדינות עם פתרון ג'לטין.
    2. אתנול מצוננים נוספה לאט לתוך התערובת תוךפתרון ערבוב במהירות גבוהה. חלקיקים שנוצרו כאשר הרכב ממס השתנה ל -75% הידרו אלכוהולי פתרון.
    3. חלקיקים היו crosslinked עוד יותר על ידי תוספת של פתרון איטי 0.1 מ"ל glyoxal 8% (v / v). ריאגנטים Unreacted היו הרווה עם 0.5 פתרון מ"ל 0.2 M גליצין.
    4. היו חלקיקים אולטרה centrifuged 16,000 סל"ד במשך 30 דקות. פתיתי נשטפו במים deionized פעמיים חלקיקים מטוהרים היו מיובשים בהקפאה ומאוחסנים ב 4 ° C.
  3. שינוי פני השטח של חלקיקים
    1. חלקיקים הושעו במאגר M 0.1 פוספט (pH 7.4) עם ריכוז של 10 מ"ג / מ"ל ​​ו מודגרות עם משקל של 2 פעמים methoxy-PEG-succinimidyl carboxy מתיל אסטר (MPEG-SCM, MW 2000 Da) או maleimide-PEG-succinimidyl carboxy methylester (MAL-PEG-SCM, MW 2000 Da) עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר עם בחישה איטית.
    2. חלקיקים PEGylated נאספו עם צנטריפוגה, אולטרה בסל"ד 16,000 דקה 30s. פתיתי נשטפו במים deionized פעמיים חלקיקים מטוהרים היו מיובשים בהקפאה ומאוחסנים ב 4 ° C.
    3. MAL-PEG-SCM חלקיקים שונה הושעו ב 0.1M פוספט חיץ (pH 6.5) עם ריכוז של 10mg/ml ו מודגרות עם משקל 10% פפטיד ספציפי EGFR (YHWYGYTPQNVI-GGGGC) במשך 6 שעות בטמפרטורת החדר עם בחישה איטית.
    4. פפטיד חלקיקים שונה נאספו עם צנטריפוגה, במיוחד בסל"ד 16,000 במשך 30 דקות. פתיתי נשטפו במים deionized פעמיים חלקיקים מטוהרים היו מיובשים בהקפאה ומאוחסנים ב 4 ° C.

2. אפיון ממוקד חלקיקים-EGFR

  1. גודל החלקיקים ומדידה פוטנציאל זטה
    חלקיקים הושעו במים עם ריכוז 1mg/ml. השעיה נותח באמצעות Zetasizer Nano (Malvern Inc). גודל החלקיקים הניתוח בוצע פיזור בזווית של 90 מעלות במהירות של 25 °הפוטנציאל זיטה ג נמדדה על פרמטרים של ברירת מחדל של המדד קבוע דיאלקטרי, השבירה ואת צמיגות המים במהירות של 25 ° C.
  2. מיקרוסקופיית אלקטרונים
    חלקיקים Lyophilized היו רכובים על הר מדגם אלומיניום גמגום מצופה עם פלדיום כדי לשפר את המוליכות ולמזער הצטברות של מטענים. דוגמאות נצפו המורפולוגיה השטח תחת פליטת Hitachi 4800 בתחום סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים על kV 3.
  3. ספקטרוסקופ אלקטרונים לניתוח כימי (ESCA)
    מיובשים בהקפאה ניסוח שליטה, חלקיקים שונה PEGylated ו פפטיד נותחו על ידי ESCA. זה היה מבוצע על ESCA הלאומי ניתוח השטח המרכז בעיות ביו (NESAC / BIO), באוניברסיטת וושינגטון (סיאטל, וושינגטון).
    1. דוגמאות הושמו ואקום ultrahigh וחשוף אנרגיה נמוכה רנטגן הקורה, אשר גרמו פליטה של ​​photoelectrons משנית מפני השטח.
    2. עד זומם מספר האלקטרונים זוהה כפונקציה של בןדינג אנרגיה, פסגות הספקטרום הנצפה חולקו כל מרכיבים כימיים.
    3. ניתוח ברזולוציה גבוהה של C1s ספקטרה בוצעה כדי לקבוע ההרכב הכימי המדויק של פחמימנים (CC או ב 285mV-CH), אתר (CO) בשעה 286.4mV), ו קרבוניל (C = O על 288.1 mV), והרכבו היחסי של כל הפונקציונליות נקבע על ידי שטח מתחת לעקומה.
  4. יציבות הפלסמיד במארז
    היציבות של ה-DNA פלסמיד במארז אושרה על ידי מפעיל את ה-DNA על חילוץ מראש יצוק ג'לים. חלקיקים היו מתעכל עם פרוטאז מ"ג / מ"ל ​​מכיל 0.2 PBS (30 דק 'ב 37 ° C) 0.2 U / ml DNAse (10min בטמפרטורת החדר) בנפרד, בו זמנית או ברצף. דוגמאות הועמסו אז בריכוז של 100ng/well בנפח 18μL לכל היטב על 1.2% agarose ג'ל (GP) (E-Gel, Invitrogen, CA). Naked הפלסמיד היה טעון כמו מלאה בג'ל היה לרוץ V 75 במשך 30 דקות. Kodak Digital X-ray (DXS) מערכת הדגימה נעשה שימוש כדי להמחיש בידיים עם transluminescence UV.
  5. קביעת העמסה פלסמיד
    חלקיקים במארז פלסמיד הושעו ב 1mg/ml ו מעוכל עם פרוטאז 0.2mg/ml על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. הפתרון היה centrifuged 13,000 סל"ד במשך 10 דקות ו supernatant נאסף ונבדק ריכוז הפלסמיד עם Picogreen assay (Invitrogen). יחס Encapsulation היה מחושב על ידי חלוקת ריכוז הפלסמיד במארז עם הטעינה הראשונית 0.5% (w / w).

3. Transfection במבחנה ב Panc-1 תאים בסרטן הלבלב

  1. תרבית תאים בתנאים
    Panc-1 ו-1 Capan אדנוקרצינומה של הלבלב שורות תאים, SKOV3 אדנוקרצינומה השחלות התא קו-NIH 3T3 קו Murine תאים פיברובלסטים התקבלו ATCC. Panc-1 ו-NIH 3T3 גדלו עם DMEM מסופק עם L-גלוטמין, עט סטרפטוקוקוס ו -10% בסרום שור העובר על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, בעוד Capan-1 נדרש DMEM סיפקה 20% בסרום שור העובר.SKOV3 היה גדל RPMI-1640 מסופק עם סרום 10% שור העובר.
  2. המערב ניתוח כתם ביטוי EGFR
    1. Lysates תא נאספו מ 2 מיליון תאים ונותחו ריכוז החלבון הכולל שימוש BCA assay (פירס). NIH-3T3 שימש שליטה שלילי SKOV3 שימש בקרה חיובית עבור ביטוי EGFR.
    2. 10 מיקרוגרם של תמצית חלבון בסך הכל היה לרוץ על נתרן מראש יצוק אלקטרופורזה dodecyl סולפט-polyacrylamide ג'ל (SDS-PAGE) מערכת ב 135V למשך 90 דקות.
    3. לאחר מכן, ג'ל הועבר על ידי מערכת PVDF קרום iBlot סופג יבש (Invitrogen).
    4. ממברנה היה חסום עם חלב ללא שומן 5% Tween המכילים טריס חיץ מלוחים (TBS-t) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
    5. ממברנה היה לחתוך מודגרות עם דילול של 1:1,000 ביתא אקטין נוגדנים העיקרי ארנב 1:1,000 דילול של נוגדנים EGFR העיקרי ארנב בנפרד ולינה 4 ° C.
    6. ממברנה נשטף לאחר מכן פעמיים עםTBS-t ו מודגרות עם 1:2,000 דילולים של תיכון נגד ארנב סוס צנון peroxidase-IgG מצומדות ב TBS-t עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
    7. לאחר שטיפה עם עודף נוגדנים TBS-t ומים, 4 מ"ל מצע ECL (פירס, רוקפורד, אילינוי, ארה"ב) נוספה מודגרות עם ממברנות במשך 5 דקות.
    8. להקות Chemiluminescent היו אז דמיינו באמצעות Kodak Digital X-ray (DXS) מערכת הדגימה.
  3. הכדאיות Cell מחקרים עם ניסוחים שונים
    1. Panc-1 התאים גדלו ב 96-היטב צלחות על 10,000 תאים לכל היטב 200μL של DMEM בתוספת לילה.
    2. בינוני הצמיחה הוחלפה תקשורת חופשית סרום המכיל ריכוזים שונים של חלקיקים עם 0, 0.5, 1, 2, 4, 6 מ"ג / מ"ל. 1mg/ml PEI, פולימר קטיוני הידוע ציטוטוקסיות, שימש בקרה חיובית.
    3. תאים שטופלו חלקיקים 200μL במשך 6 שעות ולאחר מכן החליף עם מגיב MTS 20μL ו 100μL המלאתרבות התקשורת.
    4. לאחר דגירה הודעה במשך 3 שעות ב 37 מעלות 5% CO 2, ספיגת מוצר formazan נמדדה ב 490nm עם Biotek SynergyHT צלחת הקורא (Winooski, VT).
    5. הכדאיות אחוזים של תאים התבטא כיחס בין ספיגת של תאים שטופלו פולימר יחסי שליטה שלילית (0mg/ml) כפול 100 ו זממו כפונקציה של ריכוזי פולימר.
  4. סחר Cell מחקרים
    1. Rhodamine isothiocyanate B (RBITC) שימש המצומד על ג'לטין thiolated על ידי תגובה עם קבוצת אמין. אחרי דיאליזה lyophilization, שכותרתו RBITC thiolated הג'לטין שימש להכנת חלקיקים.
    2. לפני desolvation, 25μL PicoGreen היה מעורב עם 1mg פלסמיד דקה 1 ו פלסמידים שכותרתו נוספו פתרון ג'לטין. ניסוחים שונים שנעשו בעקבות השיטה הקודמת.
    3. Panc-1 התאים גדלו ב -6 היטב צלחות זכוכית המכיל כיסוי מחליק עם 200,000 בתאי pאה כן. לאחר צמיחה לילה, 2ml של חלקיקים שכותרתו טופלו היטב לתוך כל אחד עם ריכוז 1mg/ml במדיום חופשי בסרום.
    4. אחרי נקודות זמן שונות, בין 15 דקות עד 6 שעות, בינוני הוחלף בינוני תרבות המכיל 1μg/ml של Hoest 33,342 (Invitrogen) עבור הדגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר. 2ml של פתרון paraformaldehyde 4% הוחלף לתוך הבאר כדי לתקן את כל התאים. תאים נשטפו אז עם PBS פעמיים.
    5. Coversilps היו רכוב על שקופיות הזכוכית. מיקרוסקופ לייזר סורק הקרינה confocal שימש לקחת תמונות של תאים קבוע.
  5. קביעה איכותית של יעילות transfection על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם pEGFP-N1 במארז חלקיקים
    1. pEGFP-N1 פלסמידים היו ארוזים לתוך חלקיקים המרחפים תקשורת חופשית בסרום עם ריכוז שווה פלסמידים 10μg לכל מ"ל לטיפולים נוספים.
    2. Panc-1 התאים גדלו לילה 6-גם צלחות contaiנינג זכוכית כיסוי מחליק עם 200,000 תאים לכל טוב. 2ml של pEGFP-N1 חלקיקים פלסמידים במארז טופלו היטב לתוך כל אחד. 20μg של פלסמידים היו מעורבים עם Lipofectin 20μl, מגיב קטיוני transfection שומנים בדם, והוא שימש שליטה חיובית, ואילו בתאים שלא טופלו שימשו בקרה שלילית.
    3. התאים הודגרו עם ניסוחים שונים במשך 6 שעות.
    4. בינוני הוחלף בינוני התרבות התאים היו שלאחר transfected שעות 24, 48, 72 ו - 96.
    5. לאחר transfection פוסט, בינוני הוחלף בינוני תרבות המכיל 1μg/ml של Hoest 33,342 (Invitrogen) ו מודגרות עם תאים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. Coverslips היו רכובים על גבי שקופיות זכוכית הביטוי של ה-GFP בתאים נצפתה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפרעות דיפרנציאלי בניגוד (DIC) ותמונות הקרינה רכשה באמצעות מיקרוסקופ אולימפוס BX61 ו תמונות דיגיטליות עובדו באמצעות תוכנת J תמונה.
  6. pEGFP-N1 פלסמידים היו ארוזים לתוך חלקיקים המרחפים תקשורת חופשית בסרום עם ריכוז שווה פלסמידים 10μg לכל מ"ל לטיפולים נוספים.
  7. Panc-1 התאים גדלו לילה עם 200,000 תאים לכל היטב היטב 6 צלחות. 2ml של pEGFP-N1 חלקיקים פלסמידים במארז טופלו היטב לתוך כל אחד. 20μg של פלסמידים היו מעורבים עם Lipofectin 20μl, מגיב קטיוני transfection שומנים בדם, ששימש בקרה חיוביים בתאים שלא טופלו שימשו בקרה שלילית.
  8. התאים הודגרו עם ניסוחים שונים במשך 6 שעות.
  9. בינוני הוחלף בינוני התרבות התאים היו שלאחר מודגרות שעות 24, 48, 72 ו - 96.
  10. לאחר transfection פוסט, lysates תא נאספו ונותחו כל טוב עבור ריכוז חלבון הכולל שימוש BCA assay (פירס).
  11. צלחת גם היה coaטד עם 100μl של 1:1000 דילולים של אנטי GFP נוגדנים חד שבטיים היטב כל אחד. לאחר דגירה 2 שעות, צלחת נשטף עם% 0.5-PBS (w / v) Tween-80 עבור 4 פעמים.
  12. 300μl מאגרים כפות חסימת נוספו לתוך הבאר כל מודגרות למשך 2 שעות. אז הצלחת נשטפה אז עם% 0.5-PBS (w / v) Tween-80 עבור 4 פעמים.
  13. 30μg של החלבונים של כל קבוצה נוספו לתוך הצלחת מודגרות לילה ב · 4. אז הצלחת נשטפה אז עם% 0.5-PBS (w / v) Tween-80 עבור 4 פעמים.
  14. 100μl של 1:2400 דילולים של אנטי GFP נוגדנים משני יחסית phosphatase אלקליין נוספו כל טוב מודגרות שעה 1. אז הצלחת נשטפה אז עם% 0.5-PBS (w / v) Tween-80 עבור 4 פעמים.
  15. 100μl מצעים phosphatase אלקליין נוספו כל טוב מודגרות שעה 30 דקות 1. פלייט נמדדה עם הקורא BioTek HT צלחת Synergy עבור ספיגת ב 405nm.
  16. ריכוז ה-GFP הביע היתה כפי שדווח ננוגרם milligrams של החלבון הכולל.
  • קביעה איכותית של יעילות transfection על ידי RT-PCR עם WT-p53 חלקיקים במארז פלסמיד
    1. WT-p53 פלסמידים היו ארוזים לתוך חלקיקים המרחפים תקשורת חופשית בסרום עם ריכוז שווה ערך ל מ"ל 10μg לכל פלסמיד לטיפולים נוספים.
    2. Panc-1 התאים גדלו לילה עם 200,000 תאים לכל היטב היטב 6 צלחות. 2ml של WT-p53 פלסמידים חלקיקים במארז טופלו לתוך כל טוב. 20μg של פלסמידים היו מעורבים עם Lipofectin 20μl, מגיב קטיוני transfection שומנים בדם, ששימש בקרה חיוביים בתאים שלא טופלו שימשו בקרה שלילית.
    3. התאים הודגרו עם ניסוחים שונים במשך 6 שעות.
    4. בינוני הוחלף בינוני התרבות התאים היו שלאחר מודגרות למשך 48 שעות.
    5. mRNA היו מופק היטב כל באמצעות גבוהה Pure-RNA ערכת בידוד (רוש, אינדיאנפוליס, IN) ומדד עם Nanodrop 2000 (Thermo מדעי, Wilminton, DE).
    6. RT-PCR נעשה באמצעות QIAGEN צעד אחד RT-PCR Kit (QIAGEN, ולנסיה, CA). Primers עבור p53, בקס, Bcl-2, Beta-אקטין, DR5, Apaf-1, פומה, Survivin היו מסונתז על ידי Eurofins MWG Operon (Huntsville, AL).
    7. מוצרי ה-PCR נבדקו עם ג'ל אלקטרופורזה ואת פיקסלים של להקות cDNA נותחו באמצעות תוכנת ImageJ.
  • קביעה כמותית של יעילות טיפולית עם p53-wt palsmid חלקיקים במארז
    1. WT-p53 פלסמיד היתה מקופלת לתוך חלקיקים המרחפים תקשורת חופשית בסרום עם ריכוז שווה ערך ל פלסמידים 10μg לכל מ"ל להמשך טיפול.
    2. Panc-1 התאים גדלו לילה עם 200,000 תאים לכל היטב היטב 6 צלחות. 2ml של WT-p53 פלסמידים חלקיקים במארז טופלו לתוך כל טוב. 20μg של פלסמידים היו מעורבים עם Lipofectin 20μl, מגיב קטיוני transfection שומנים בדם, ששימש בקרה חיוביים בתאים שלא טופלו היומשמש בקרה שלילית.
    3. התאים הודגרו עם ניסוחים שונים במשך 6 שעות.
    4. בינוני הוחלף בינוני התרבות התאים היו שלאחר מודגרות שעות 24, 48, 72 ו - 96.
    5. הכרומטין עיבוי / חדירות ממברנה / Cell המלח אפופטוזיס Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) שימש תווית תאים אפופטוטיים, נמקי תאים תאים לחיות עם צבעים שונים.
    6. iCys מחקר הדמיה Cytometer מ CompuCyte (ווסטווד, MA) שימש כדי לנתח ולהשוות בין רמות אפופטוזיס לאחר הטיפול. בהתבסס על תמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטי, בעוצמות של כל הצבעים הוקלט זממו לעומת ספירות ואת אחוזי עבור אוכלוסיות שונות חושבו.
    7. בהשוואה שליטה שלילית, כלומר לא היה טיפול עבור התאים, התאים אפופטוטיים שינויים לקפל חושבו החוצה המופיעים בגרף.
    8. ערכת Assay 3.8.8 Apo-ONE caspase-3 אחידים / 7 (Promega, מדיסון, WI) שימש כדי לבדוק את pro-אפופטוטיים פעילות לאחר transfection של p53-wt פלסמיד. 1mg/ml PEI שימשה כביקורת שלילית לחסל את כל פעילות אפופטוטיים. לאחר transfection פוסט, בתאים שטופלו rhodamine 110, bis-(N-CBZL-aspartyl-L-glutamyl-L-valyl-L-חומצה אספרטית אמיד; Z-DEVD-R110), המהווה מצע של caspase 3 / 7, עד 18 שעות.
    9. פלייט נמדדה עם הקורא BioTek HT צלחת Synergy עבור הקרינה ב 490/520 ננומטר. בהתבסס על עוצמת הקרינה ירוק, הפרו אפופטוטיים פעילות יכול להיות מוערך.
  • 4. נציג תוצאות

    1. סינתזה Chatacterization של חלקיקים EGFR ממוקד

    EGFR מיקוד פפטיד שונה חלקיקים היו מסונתז כמו התוכנית הראו בתרשים 1. חלקיקים שהכין desolvation התאפיינו עבור גודל החלקיקים ואת פוטנציאל זטה. תשלום ממוצע גודל השטח של חלקיקים שהוכן gelatins thiolatedעם דרגות שונות של thiolation מפורטים בטבלה 1. קוטר החלקיקים הממוצע של חלקיקים שונים היו בין 150-250 ננומטר. חלקיקים Thiolated יש גודל קטן יותר לעומת חלקיקי ג'לטין, אולי עקב היווצרות דיסולפיד גשר בתוך חלקיקים. עם שינויים משטח שונים, בגדלים של חלקיקים גדלו. הפוטנציאל זטא של ניסוחים שונים היו סביב -20 mV. עם ניתוח SEM, הגדלים, מורפולוגיה השטח צורה כדורית של חלקיקים נצפו ו המקביל לתוצאות Zetasizer. יעילות ה-DNA טוען חלקיקים חלקיקים ג'לטין ג'לטין thiolated היו גבוהות יותר מאשר 95% (טבלה 1).

    איור 1
    1. איור Scheme תגובה כימית, הממחישות שינוי פני השטח של חלקיקי ג'לטין thiolated עם צמיחה אפידרמיס פקטוr הקולטן (EGFR) פפטיד מחייב דרך spacer (אתילן גליקול) (PEG) פולי.

    אפיון של חלקיקים

    גיבוש Nanoparticle קוטר (ננומטר) זיטה פוטנציאל (mV) פלסמיד דנ"א יעילות טוען (%)
    ג'ל NP 151.4 ± 23.5 -17.1 ± 5.23 95.6 ± 2.2
    SH-Gel-NP 132.6 ± 17.9 -24.6 ± 5.16 97.0 ± 3.8
    SH-Gel-PEG 179.0 ± 30.9 -22.3 ± 9.50 95.8 ± 6.5
    SH-PEG ג'ל פפטיד 230.8 ± 41.5 -18.1 ± 4.02 94.8 ± 5.1

    טאble 1. גודל החלקיקים, מטען פני השטח, אנקפסולציה פלסמיד דנ"א היעילות של שליטה במיקוד EGFR חלקיקי ג'לטין ג'לטין ו thiolated.

    ברזולוציה גבוהה C 1S סריקות ספקטרוסקופיה של אלקטרונים לניתוח כימי (ESCA) שימש כדי לנתח רכיב פני השטח של thiolated ג'לטין (SH-Gel-NP), PEG-שונה thiolated ג'לטין (SH-Gel PEG) ו - EGFR מיקוד פפטיד שונה ג'לטין thiolated חלקיקים (SH-PEG ג'ל פפטיד). התוצאות בטבלה 2 הראה בעוצמות שיא של CH (פחמימנים), CO (אתר), ו-C = O (קרבוניל) קבוצות ב 285.0, 286.3, 288.1 ו eV, בהתאמה. האות CO האתר גדל לאחר PEG שינוי וירידה לאחר נטיה פפטיד. בעוד הרכב חנקן ירדה לאחר PEG שינוי והגדילה לאחר שינוי הפפטיד, אשר אישר את נוכחותו של פפטיד-EGFR המיקוד על חלקיקים. ניתוח ESCA אישרה עוד PEG ושינוי פני השטח פפטיד.

    אלקטרונים ספקטרוסקופיה לאנליזה כימית של הרכב פני השטח חלקיקים

    גיבוש C 1s (%) O 1s (%) N 1s (%)
    SH-Gel-NP 59.3 ± 0.8 22.9 ± 0.5 12.9 ± 0.1
    SH-Gel-PEG 58.2 ± 0.6 28.0 ± 1.2 9.5 ± 0.7
    SH-PEG ג'ל פפטיד 56.7 ± 0.8 25.9 ± 0.7 12.3 ± 0.6
    גיבוש CC (%) CO, N (%) C = O (% )
    SH-Gel-NP 51.5 26.6 21.9
    SH-Gel-PEG 17.1 63.1 19.8
    SH-PEG ג'ל פפטיד 33.1 42.8 24.1

    טבלה 2. C 1S סריקות ברזולוציה גבוהה של ספקטרוסקופית אלקטרונים עבור ניתוח כימי (ESCA)

    כדי לבחון את יציבות הפלסמיד כמוס, חלקיקים טופלו פרוטאז או DNAse בנפרד, simuntaneously או ברצף. לאחר אלקטרופורזה, התוצאות באיור 2 הראו כי ה-DNA פלסמיד הגלום בכל חלקיקים מוגנים על ידי חלקיקים ו-DNA יציב, הפלסמיד דומה עירום. אלה למד הראו כי כל חלקיקים אלה יכולים לתמצת ולשמר את המבנה הפלסמיד לאחר אנקפסולציה.

    / Files/ftp_upload/3612/3612fig2.jpg "/>
    באיור 2. היציבות של DNA פלסמיד הגלום thiolated ג'לטין, thiolated-PEG שונה ג'לטין, ו-EGFR פפטיד שונה חלקיקי ג'לטין thiolated על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose. חלקיקים טופלו 0.2 מ"ג / מ"ל ​​של פרוטאז להוכיח אנקפסולציה DNA פלסמיד בתוך המטריצה ​​nanoparticle

    2. Baseline ביטוי EGFR בתאי סרטן הלבלב

    שני אדם אדנוקרצינומה הלבלב שורות תאים (Panc-1 ו Capan-1) נותחו על ידי כתם המערבי ביטוי EGFR. השחלות אדנוקרצינומה האדם (SKOV3) ו פיברובלסטים Murine ((NIH-3T3) תאים נבחרו בקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה. Beta-אקטין נותח כמו בקרת טעינה חלבון. Panc-1 התאים הראו ביטוי EGFR גבוה לעומת Capan-1 קו זה התא היה אז בשימוש למטרות הבאות במבחנה מחקרים

    3. Cytotoxicity של בקרה Surface-Modified Thiolated חלקיקים לטין

    כדי להעריך את האינטראקציה הסלולר של חלקיקים, מבחני cytotoxicity בוצעו לאחר הטיפול עם חלקיקים. על סמך התוצאות באיור 3, הן מלאה את פני השטח שונה, חלקיקים היו בטוחים יחסית ביולוגית ב Panc-1 התאים אפילו בריכוזים גבוהים, בהשוואה עם PEI. המחקרים הבאים בוצעו עם חלקיקים 1mg/ml.

    איור 3
    באיור 3. לתא אחוז הכדאיות כפונקציה של ריכוזי ניסוח nanoparticle ב Panc-1 תאים הערכה לפי tetrazolium צבען (MTS) assay

    4. מתווכת קולטן תא ספיגה Panc-1 תאים

    כדי לאשר נגישות פני השטח של פפטיד-EGFR מיקוד קולטן בתיווך ספיגת endocytotic של חלקיקים, מערכת תוכנן על ידי תיוג כל שותףmponent עם הקרינה שונות להדמיה של ספיגת חלקיקי וסחר בתאים. עם מערכת זו תיוג, ה-DNA פלסמיד, חלקיקים לגרעין התא ניתן היה לזהות. מיקרוסקופ לייזר סורק הקרינה confocal שימש לקחת תמונות בנקודות זמן שונות, בין 15 דקות עד 6 שעות. על ידי השוואת התמונות של ניסוחים שונים, פפטיד חלקיקי ג'לטין מצומדות הראה את ספיגת מהיר לשחרר פלסמיד בתוך 30 דקות. תוצאה זו נוספת הוכיחה כי EGFR פפטיד מצומדות חלקיקים שעברו אנדוציטוזה הקלו עם אינטראקציה מהירה בין הפפטיד EGFR EGFR ספציפיים הקולטנים על פני התא, אשר היה הרבה יותר מהר, בהשוואה ל חלקיקים אחרים, אשר עברו הלא ספציפית אנדוציטוזה.

    סחר Cell מחקר

    איור 4
    איור 4. מיקרוסקופ פלואורסצנטי Confocalalysis של ספיגת-DNA במארז nanoparticle סחר ב Panc-1 תאים. (אדום = rhodamine שכותרתו חלקיקים, ירוק = PicoGreen שכותרתו DNA פלסמיד, כחול = DAPI שכותרתו גרעין). כוח לייזר היה 7 פעמים פחות ארבע דמויות האחרון של הפאנל התחתון.

    5. איכותית וכמותית ב transfection חוץ גופית עם חלבון גרין משופר פלורסנט

    ELISA באיור 5 ניתוח מיקרוסקופי הקרינה באיור 6 שימשו למדידת איכותית וכמותית tranfection יעילות ה-GFP ב Panc-1 תאים על ניהול ללא שינוי, PEG-EGFR שונה ו פפטיד שונה חלקיקי ג'לטין thiolated. פלסמידים נמסר על ידי EGFR במיקוד חלקיקים הביא הרמה הגבוהה ביותר של הביטוי GFP לאחר 48 שעות ביחס פקדים אחרים, כולל ה-DNA Lipofectin-ומורכבת.

    איור 5
    איור 5. ביטוי של GFPnalyzed ידי ELISA זממו כפונקציה של הזמן שלאחר הממשל של DNA פלסמיד בשליטה EGFR במיקוד חלקיקים.

    Fluoresence ניתוח מיקרוסקופיים עבור transfection GFP

    איור 6
    איור 6. ניתוח איכותי של ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק ב Panc-1 תאים על ידי מיקרוסקופיה epifluoresence לאחר 24, 48, 72 ו - 96 שעות שלאחר transfection עם EGFP-N1. Lipofectin-DNA מורכב שימשה כביקורת חיובית.

    6. Tranfection חוץ גופית ב-p53 עם wild-type פלסמיד ב Panc-1 תאים

    Wild-type פלסמידים p53 pORF-hp53, עם מקדם EF-1α / HTLV היברידית היו מופק E. coli ו מקופלת לתוך חלקיקים כדי לחקור את האפקט הטיפולי אפופטוטיים. Panc-1 תאים שטופלו חלקיקים במשך 6 שעות שלאחר transfected עבור 24 נוספות, 48, 72, ו 96 שעות.

    מאז p53 יכול להשרות אפופטוזיס בתאי ועל מנת להשיג את התפקיד הזה, רבים גורמי תעתוק הזרם יהיה מעורב בפיקוח ישיר על ידי ביטוי של p53-WT. ביניהם, בקס, caspase-3, caspase-9, DR5, פומה ו Apaf-1 יהיה למעלה מוסדר על ידי ביטוי של p53 ובעוד Bcl-2, survivin יהיה למטה מוסדר. כדי לבחון את רמות אלה גורמי שעתוק, mRNA היה שחולצו מן Panc-1 תאים לאחר 48 שעות שלאחר transfection ושימשו RT-PCR. המוצרים נבדקו עם ג'ל אלקטרופורזה להקות נותחו עם ImageJ. על סמך התוצאות הראו באיור 7, survivin ירד משמעותית עם הטיפול של EGFR חלקיקים ממוקדת ג'לטין thiolated לעומת טיפולים אחרים, לא חל שינוי ברור היה לראות Bcl-2, Bax וביטוי של caspase-3, caspase-9, DR5, PUMA ו-Apaf 1increased עם טיפול חלקיקים ממוקדת.

    les/ftp_upload/3612/3612fig7.jpg "/>
    איור 7. רמות ה-mRNA של גורמים במורד הביטוי wt-p53 הושוו על ידי RT-PCR לאחר 48 שעות שלאחר transfection.

    לאחר transfection WT-p53, עיבוי הכרומטין / חדירות ממברנה / המלח אפופטוזיס ערכת Cell שימש להבדיל תאים אפופטוטיים, נמקי תאים תאים לחיות עם צבעים שונים. iCys מחקר הדמיה Cytometer מ CompuCyte (ווסטווד, MA) שימש כדי לנתח ולהשוות בין רמות אפופטוזיס לאחר הטיפול. בהשוואה שליטה שלילי, תאים אפופטוטיים שינויים לקפל חושבו החוצה המפורטים באיור 8. EGFR nanopaticles ממוקד ג'לטין thiolated הראו את האוכלוסייה הגבוה תא אפופטוטיים לאחר transfection פוסט. ניתוח של caspase 3 / 7 פעילות הראו גם כי EGFR במיקוד חלקיקים היה הפנמה מהירה הרמה הגבוהה ביותר של פעילות אפופטוטיים ב Panc-1 תאים.

    איור 8 איור 8. ניתוח Cytometric הפעילות הפרו אפופטוטיים בשליטה WT-p53 transfected Panc-1 תאים באמצעות iCys ° הדמיה Cytometer

    Discussion

    בקרה EGFR חלקיקים ממוקדת ג'לטין thiolated היו מוכנים עם אנקפסולציה DNA יציבות יעילה. גודל החלקיקים של כל המערכות הללו היו בטווח של 150-250 ננומטר בקוטר. פוטנציאל זטה הוכיח כי מערכת זו היא מערכת שלילי במקצת. עם ניתוח SEM, בגדלים של חלקיקים היו זהים עם תוצאה Zetasizer. ניתוח ESCA יכול לאשר PEG ושינוי פני הפפטיד.

    ניתוח כתם המערבי הראו כי Panc-1 התאים לו ביטוי ברמות גבוהות EGFR וזה קו תא שימש במבחנה. הן מלאה את פני השטח שונה, חלקיקים היו יחסית ציטוטוקסיות פחות Panc-1 תאים לעומת PEI.

    מחקרים הראו סחר Cell ספיגת מהירה לשחרר פלסמיד של EGFR במיקוד חלקיקים Panc-1 תאים. משלוח של ה-DNA כתב פלסמידים עם המבטא EGFR במיקוד חלקיקים הביא לרמות הגבוהות ביותר שלGFP יחסית פקדים אחרים, כולל ה-DNA Lipofectin-ומורכבת הביטוי. עם אותה מערכת, transfection עם WT-p53 פלסמיד שהפעילה את מסלול אפופטוטיים במורד הזרם ו אפופטוזיס מהיר המושרה Panc-1 תאים.

    אלה תוצאות ראשוניות מצביעות על כך EGFR במיקוד חלקיקי ג'לטין thiolated יכול לשמש מערכת יעיל ובטוח DNA מסירה עבור ריפוי גנטי לטיפול בסרטן הלבלב.

    Disclosures

    אין ניגודי אינטרסים הכריז.

    Acknowledgments

    מחקר זה נתמך על ידי בנות הברית הסרטן של המכון הלאומי ננוטכנולוגיה עבור מרכז הסרטן הסרטן ננוטכנולוגיה אקסלנס (CCNE) מענק U54-CA151881.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Type B gelatin, Bloom 225 Sigma-Aldrich G9391
    2-iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256
    pEGFP-N1 plasmid Elim Biopharm N/A
    pORF-hp53 E. coli Invitrogen porf-hp53
    Glyoxal solution (40wt. % in H2O) Sigma-Aldrich 128465
    Glycine Sigma-Aldrich 410225-250G
    QIA filter Plasmid Mega kit Qiagen 12281
    Beckman LE 80K Ultracentrifuge Beckman Coulter Inc. N/A
    FreeZone 6 Liter Console Freeze Dry Systems Labconco Corp. 7753020
    mPEG-SCM, MW 2,000 Da Laysan Bio Inc. mPEG-SCM-2K-1g
    MAL-PEG-SCM, MW 2,000 Da Jenkem Technology A5001-1
    Zetasizer Nano Malvern Instruments Zetasizer Nano ZS
    Hitachi 4800 field emission scanning electron microscope Hitachi S-4800 UHR FE-SEM
    Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits Invitrogen P7589
    Lipofectin Transfection Reagent Invitrogen 18292011
    DMEM Mediatech, Inc. 10 013 CM
    RPMI Mediatech, Inc. 50 020 PB
    Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23225
    iBlot Dry Blotting System Invitrogen IB1001
    XCellSureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark Invitrogen EI0002
    Pierce ECL Western Blotting Substrate Thermo Fisher Scientific, Inc. 32109
    Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) System Kodak N/A
    CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega Corp. G3580
    BioTek SynergyHT plate reader BioTek N/A
    Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific, Inc. N/A
    One-step RT-PCR kit Qiagen 210212
    Chromatin Condensation/Membrane Permeability/Dead Cell Apoptosis Kit Invitrogen V23201
    Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay kit Promega Corp. G7790
    Hybaid PCR Sprint Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific, Inc. N/A
    EGF Receptor Antibody Cell Signaling Technology 2232
    β-Actin Antibody Cell Signaling Technology 4967
    Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074
    Mouse Monoclonal GFP Antibody Novus Biologicals NB600-597
    Goat Polyclonal GFP antibody (Alkaline Phosphatase) Novus Biologicals NB600-1502
    Phosphatase Substrate Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 37620

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Vimalachandran, D. Genetics and prevention of pancreatic cancer. Cancer. Control. 11, 6-14 (2004).
    2. Kommareddy, S., Amiji, M. Preparation and evaluation of thiol-modified gelatin nanoparticles for intracellular DNA delivery in response to glutathione. Bioconjug. Chem. 16, 1423-1432 (2005).
    3. Kommareddy, S., Amiji, M. Poly(ethylene glycol)-modified thiolated gelatin nanoparticles for glutathione-responsive intracellular DNA delivery. Nanomedicine. 3, 32-42 (2007).
    4. Kommareddy, S., Amiji, M. Antiangiogenic gene therapy with systemically administered sFlt-1 plasmid DNA in engineered gelatin-based nanovectors. Cancer. Gene. Ther. 14, 488-498 (2007).
    5. Kommareddy, S., Amiji, M. Biodistribution and pharmacokinetic analysis of long-circulating thiolated gelatin nanoparticles following systemic administration in breast cancer-bearing mice. J. Pharm. Sci. 96, 397-407 (2007).
    6. Kaul, G., Amiji, M. Tumor-targeted gene delivery using poly(ethylene glycol)-modified gelatin nanoparticles: in vitro and in vivo studies. Pharm. Res. 22, 951-961 (2005).
    7. Bardeesy, N., DePinho, R. A. Pancreatic cancer biology and genetics. Nat. Rev. Cancer. 2, 897-909 (2002).
    8. Li, Z. Identification and characterization of a novel peptide ligand of epidermal growth factor receptor for targeted delivery of therapeutics. FASEB. J. 19, 1978-1985 (2005).
    9. McCormick, F. Cancer gene therapy: fringe or cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 1, 130-141 (2001).
    10. Green, D. R., Kroemer, G. Cytoplasmic functions of the tumour suppressor p53. Nature. 458, 1127-1130 (2009).
    11. Barton, C. M. Abnormalities of the p53 tumour suppressor gene in human pancreatic cancer. Br. J. Cancer. 64, 1076-1082 (1991).
    משלוח ין transfection ב אדם בתאי סרטן הלבלב באמצעות גורם גדילה עוריות קולטן במיקוד לטין מבוסס Nanovectors מתוכנן
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Xu, J., Amiji, M. Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles. J. Vis. Exp. (59), e3612, doi:10.3791/3612 (2012).More

    Xu, J., Amiji, M. Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles. J. Vis. Exp. (59), e3612, doi:10.3791/3612 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter