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Bioengineering

표피 성장 인자를 사용하여 인간의 췌장 암 세포의 유전자 전달 및 Transfection은 다행 기반 엔지니어링된 Nanovectors를 수용체 타겟

doi: 10.3791/3612 Published: January 4, 2012

Summary

B 타입 젤라틴 기반 공학 nanovectors 시스템 (GENS)은 췌장암의 치료 체계 유전자 전달 및 transfection을 위해 개발되었습니다. 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) nanparticles의 표면에 특정 펩타이드와 수정함으로써, 그들은 EGFR 수용체에서 대상 수와 같은 높은 세포내 글루타티온의 농도로, 환경을 감소 밑에 플라스미드 놓습니다.

Abstract

32,000 명 이상의 환자가 매년 미국에서 췌장암 진단을하고 있으며이 질병은 매우 높은 사망률 1 연결되어 있습니다. 긴급 필요 췌장암 환자의 음침한 생존 통계에 향상시킬 수있는 소설 임상 - 번역 치료 전략을 개발하기 위해 존재합니다. 암의 유전자 치료는 엄청난 약속을 보여주었다 있지만, 가장 큰 문제는 지속적인 transgene 발현으로 이어질 수있는 안전하고 효과적인 전달 시스템의 개발에 있습니다.

젤라틴은 널리 음식과 의약품에 사용되는 가장 다용도 천연 생체 고분자 중 하나입니다. 저희 연구실에서 이전 연구는 B 타입 젤라틴 실제 세포내 전달시 플라스미드 향상된 transfection 효율의 supercoiled 구조를 보존 DNA를 캡슐 수있는 것으로 나타났습니다. 젤라틴의 thiolation으로 sulfhydryl 그룹은 고분자에 도입 F 것이 될 수전체 복잡하고 한번 이황화 결합을 안정화 nanoparticles 이내 orm의 이황화 결합은 cytosol에서 글루타티온의 존재로 인해 고장, 페이로드는 2-5 출시 것입니다. 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) - 수정 GENS, 체계 유통 관리, 긴 순환 시간을 제공하며 우선적으로 향상된 투자율 및 유지 효과 6 neovasculature의 하이퍼 투자율에 의한 종양 미사를 대상으로하고 있습니다. 연구 Panc - 1 인간의 췌장 선암 세포 7 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 표현을 통해 보여주었다. 적극적으로 췌장암 세포주를 대상으로하기 위해서는 EGFR 특정 펩타이드가 PEG 스페이서를 통해 입자 표면에 복합되었습니다 8.

대부분의 안티 종양 유전자 요법은 9 세포에서 프로 apoptotic 기능을 복원하는 등 야생 유형 p53의 (wt - p53의)와 같은 종양 억제 유전자,의 관리에 초점을 맞추고있다 10 p53의 메커니즘 기능. 췌장암에서 대부분의 세포가 apoptotic 활동의 손실을 초래하는 p53 단백질에 돌연변이 있습니다. wt - p53의 도입과 함께, apoptosis는 수리 수 있으며 추가로 암 세포를 11 세포 죽음을 트리거합니다.

위의 근거를 바탕으로, 우리는 EGFR이 wt - p53의 유전자 전달 및 Panc - 1 세포에서 평가 배달 효율성 및 transfection을위한 펩타이드 - 수정 thiolated 젤라틴 nanoparticles을 대상으로 설계했습니다.

Protocol

1. 플라스미드 DNA의 준비는 EGFR 타겟 다행 Nanoparticles를 캡슐

  1. thiolated 젤라틴의 합성
    1. Thiolated 젤라틴은 유형 B 젤라틴의 주요 아미노 그룹에 2 iminothiolane와 공유 결합 활용하여 이전 방법 2-5로 합성되었다. 젤라틴의 1g 100 ML 탈이온수에 녹아있는 15 시간 동안 실내 온도 20 MG 2 iminothiolane 하이드로 클로라이드와 incubated했다.
    2. Unreacted 시약 3 시간마다 1 ㎜ HCL 솔루션에 이어 5 MM HCL 솔루션에 대한 투석에 의해 제거되었다. 정화 thiolated 젤라틴은 4 ° C 이상 사용을위한 건조 및 저장 동결했다.
  2. DNA 함유 nanoparticles의 준비
    1. 200 MG thiolated 젤라틴은 물과 솔루션의 산도에 해산되었다는 0.2 M NaOH 용액의 추가에 의해 7 조정되었습니다. 1mg의 DNA는 젤라틴 솔루션을 추가하고 부드럽게 혼합되었다.
    2. 냉장 에탄올은 혼합물에 천천히 추가 동안고속 감동 솔루션입니다. 용매 조성물은 하이드로 - 알코올 용액 75 % 변경될 때 Nanoparticles이 형성되었다.
    3. Nanoparticles은 추가 0.1 ML 8% (V / V) glyoxal 솔루션의 속도가 느린뿐만 아니라에 의해 가교되었습니​​다. Unreacted 시약은 0.5 ML 0.2 M 글리신 솔루션 침묵했다.
    4. Nanoparticles는 30 분 동안 16,000 rpm으로 울트라 centrifuged되었습니다. 알약은 두 번 탈이온수와 세탁 및 정화 nanoparticles는 동결 건조 및 4 저장된했다 ° C.
  3. nanoparticles의 표면 수정
    1. Nanoparticles 10 밀리그램 / ML의 농도와 0.1 M 인산 완충액 (산도 7.4)에서 일시 중지 및 메톡시 - PEG - succinimidyl 카르복시 메틸 에스테르 (MPEG - SCM, MW 2000 다) 또는 maleimide - PEG - succinimidyl 카르복시 2 배 무게로 incubated되었습니다 천천히 저어로 실온에서 2 시간 methylester (말 - PEG - SCM, MW 2000 다).
    2. PEGylated nanoparticles 30 분간 16,000 rpm으로 원심 분리와 울트라 수집되었습니다S. 알약은 두 번 탈이온수와 세탁 및 정화 nanoparticles는 동결 건조 및 4 저장된했다 ° C.
    3. 말 - PEG - SCM 수정된 nanoparticles는 10mg/ml의 농도로 0.1M 인산 버퍼 (산도 6.5)에 정지하고 천천히 저어과 함께 실온에서 6 시간 동안 EGFR 특정 펩타이드 (YHWYGYTPQNVI - GGGGC)의 10 % 무게 incubated되었습니다.
    4. 펩타이드 수정된 nanoparticles는 30 분 16,000 rpm으로 원심 분리와 울트라 수집했다. 알약은 두 번 탈이온수와 세탁 및 정화 nanoparticles는 동결 건조 및 4 저장된했다 ° C.

2. EGFR 타겟 Nanoparticles의 특성화

  1. 입자 크기와 제타 전위 측정
    Nanoparticles은 1mg/ml의 농도로 물에 중단되었습니다. 정지 Zetasizer 나노 (Malvern Inc의)를 사용하여 분석되었다. 입자 크기 분석은 25 90 정도의 산란 각도로 진행되었습니다 °C. 제타 전위가 25 유전체 상수, 굴절률 및 물의 점도의 기본 매개 변수에서 측정되었습니다 ° C.
  2. 전자 현미경을 스캐닝
    동결 건조된 nanoparticles는 알루미늄 샘플 마운트에 장착된과 전도성을 개선하고 비용 상승을 최소화하기 위해 팔라듐과 스퍼터 코팅되었습니다. 샘플은 3 kV에서 전자 현미경을 검색 히타치 4800 전계 방출에 따라 표면 형태에 대한 관찰되었다.
  3. 화학 분석을위한 전자 분광기 (ESCA)
    컨트롤의 동결 건조 제제, PEGylated 및 펩타이드 수정 nanoparticles은 ESCA로 분석되었다. 그것은 국가 ESCA 및 바이오 메디컬 문제에 대한 표면 분석 센터 (NESAC / BIO), 워싱턴 대학 (시애틀, WA)에서 수행되었다.
    1. 샘플은 ultrahigh 진공에 배치하고 표면에서 보조 photoelectrons의 방출을 유도 낮은 에너지 X - 선 빔,에 노출되었습니다.
    2. 빈의 함수로 감지 전자의 개수를 계획하여땡 에너지, 관찰 스펙트럼 봉우리는 각각의 화학 구성 요소에 할당되었습니다.
    3. C1s 스펙트럼의 고해상도 분석 정확한 화학 탄화 수소의 구성 (285mV에서 CC 또는 CH), 286.4mV에서 에테르 (CO)) 및 카보닐 (288.1 뮤직 비디오에서 C = O), 그리고 각 기능의 상대적 구성을 결정하기 위해 수행되었다 곡선 아래의 영역에 의해 결정되었다.
  4. 캡슐 플라스미드의 안정성
    캡슐 플라스미드 DNA의 안정성은 사전 캐스트 젤에서 추출한 DNA를 실행하여 확인되었다. nanoparticles는 동시에 또는 순차적으로, 별도로 PBS (37 ° C에서 30 분)와 0.2 U / ML DNAse을 (실온에서 10 분)이있는 0.2 밀리그램 / ML 단백 분해 효소와 소화했다. 샘플은 다음 잘 당 18μL 볼륨 100ng/well의 농도에서 1.2 % 아가로 오스 겔 (GP) (E - 젤, Invitrogen, CA)에로드되었습니다. 플라스미드 알몸이 컨트롤로로드되어 겔은 30 분 75 V에서 실행되었다. 코닥 디지털 X - 선 표본 (DXS) 시스템은 B를 시각화하는 데 사용된UV transluminescence 함께 ands.
  5. 플라스미드 로딩의 결정
    플라스미드 캡슐 nanoparticles는 ° C 30 분 1mg/ml에서 정학과 37 0.2mg/ml 단백 분해 효소와 소화했다. 솔루션은 10 분 13,000 rpm으로 centrifuged했고 뜨는는 Picogreen 분석 (Invitrogen)와 플라스미드 농도에 대한 수집 및 테스트되었습니다. 캡슐화 비율은 초기 로딩 0.5 % (w / w)로 캡슐 플라스미드 농도를 나누어 계산했습니다.

3. Panc - 1 췌장암의 세포 체외의 Transfection 연구에서

  1. 세포 배양 조건
    Panc - 1과 Capan - 1 췌장 선암 세포 라인, SKOV3 난소 선암 세포주 및 NIH - 3T3 murine fibroblast 세포 라인은 ATCC에서 얻은했다. Panc - 1 및 NIH - 3T3는 DMEM, 37에서 L - 글루타민, 펜 - strep와 10 % 태아 소 혈청과 함께 제공된 ° C와 5퍼센트 Capan - 1 필수 DMEM 20 % 태아 소 혈청을 공급하면서 CO 2.와 함께 성장했다SKOV3는 10% 태아 소 혈청과 함께 제공된 RPMI - 1640에서 재배되었다.
  2. EGFR 발현을위한 서양 얼룩 분석
    1. 세포 lysates은 2,000,000 세포에서 수집 BCA 분석 (피어스)를 사용하여 총 단백질 농도에 대한 분석했다. NIH - 3T3는 부정적인 제어 및 SKOV3가 EGFR 발현에 대한 긍정적인 제어로 사용되었다로 사용되었다.
    2. 총 단백질 추출물의 10 μg은 90 분간 135V의 프리 캐스트 나트륨 dodecyl 황산염 - polyacrylamide 겔 전기 영동 (SDS - PAGE) 시스템에서 실행되었습니다.
    3. 그 후, 젤은 iBlot 드라이 Blotting 시스템 (Invitrogen)에 의해 PVDF 멤브레인로 전송되었습니다.
    4. 막은 상온에서 1 시간 동안 십대 초반 함유 트리스 버퍼 염분 (TBS - T)에 5퍼센트 아닌 지방 우유로 차단되었습니다.
    5. 막은 4 별도 하룻밤 기본 토끼 베타 굴지 항체의 1:1,000 희석 및 기본 토끼 EGFR 항체의 1:1,000 희석로 잘라 incubated되었습니다 ° C.
    6. 막 그런 다음 함께 두 번 졌죠TBS - T와 실온에서 1 시간 TBS - T에 보조 안티 - 토끼 말이 무 퍼옥시데이즈 - 복합 IgG의 1:2,000 dilutions와 incubated.
    7. TBS - T와 물로 초과 항체를 rinsing 후, 4 ML ECL 기판은 (피어스, 록퍼드, IL, 미국)에 추가되었습니다 5 분 세포막과 incubated.
    8. Chemiluminescent 밴드는 다음 코닥 디지털 X - 선 표본 (DXS) 시스템을 사용하여 시각되었습니다.
  3. 다른 공법과 세포 생존 능력 연구
    1. Panc - 1 세포는 밤새 보충 DMEM의 200μL에 잘 10,000 세포에서 96 - 웰 플레이트에서 성장했다.
    2. 성장 매체는 0 nanoparticles의 다른 농도를 포함하는 혈청 무료 미디어, 0.5, 1, 2, 4, 6, MG / ML로 대체되었습니다. 1mg/ml PEI, 알려진 세포 독성 양이온 중합체는 긍정적인 제어로 사용되었다.
    3. 전지는 6 시간 동안 200μL nanoparticles로 치료 후 20μL MTS 시약과 완벽한 100μL로 교체되었습니다문화 미디어.
    4. 37 3 시간 동안 게시물 보육 후에 ° C 5 % CO 2가, formazan 제품의 흡광도가 Biotek SynergyHT 플레이트 리더 (Winooski, VT)로 490nm에서 측정되었다.
    5. 세포의 퍼센트의 가능성 100 곱한 대조군 (0mg/ml)에 상대 폴리머 처리 세포의 흡광도의 비율로 표현하고 고분자 농도의 함수로 꾸몄다되었습니다.
  4. 세포 밀매 연구
    1. Rhodamine B의 isothiocyanate (RBITC)는 아민 그룹과 반응하여 thiolated 젤라틴에 활용하는 데 사용되었다. 투석과 lyophilization 후 RBITC는 thiolated 젤라틴이 nanoparticles 준비를 위해 사용되었습니다 표시.
    2. desolvation 전에 25μL PicoGreen은 1 분 플라스미드 1mg과 혼합되어 표시 plasmids은 젤라틴 솔루션에 추가되었습니다. 다른 공법은 이전 방법 다음되었다.
    3. Panc - 1 세포는 P에게 200,000 개 셀로 유리 커버 - 전표를 포함하는 6 자 접시에서 성장했다잘 어. 하룻밤 성장 후, 레이블 nanoparticles의 2ml는 혈청 무료 매체 1mg/ml의 농도와 각각 잘으로 취급되었다.
    4. 다른 시간 포인트 후 15 분 ~ 6 시​​간, 중간은 상온에서 15 분 보육에 대한 Hoest 33,342 (Invitrogen)의 1μg/ml를 포함하는 배지로 대체되었습니다. 4 % paraformaldehyde 솔루션 2ml는 세포를 해결하기 위해 각 자로 교체되었습니다. 전지는 다음 두 번 PBS로 씻어되었습니다.
    5. Coversilps는 유리 슬라이드에 장착했다. 레이저 스캐닝 공촛점 형광 현미경은 고정 세포의 이미지를 위해 사용되었다.
  5. pEGFP - N1 캡슐과 형광 현미경으로 transfection 효율의 질적 결정은 nanoparticles
    1. pEGFP - N1의 plasmids은 nanoparticles로 캡슐 및 추가 치료에 대한 ML 당 10μg plasmids에 해당하는 농도와 혈청 무료 미디어에 중단되었습니다.
    2. Panc - 1 세포는 6 - 잘 접시 contai에서 야간 재배되었다물론 당 200,000 개 셀로 유리 커버 - 전표를 닝. pEGFP - N1 plasmids 캡슐의 nanoparticles의 2ml 각 우물에 대우되었다. plasmids의 20μg은 20μl Lipofectin, 양이온 지질 transfection 시약과 혼합되었고, 치료 세포를 대조군으로 사용하는 동안 그것은 긍정적인 제어로 사용되었다.
    3. 전지는 6 시간 동안 다른 공법과 incubated되었습니다.
    4. 매체는 24, 48, 72 96시간에 대한 사후 transfected되었다 배지와 세포로 대체되었습니다.
    5. 포스트 transfection 후, 매체 Hoest 33,342 (Invitrogen)의 1μg/ml를 포함하는 배지로 교체되었고 실온에서 15 분 동안 전지 incubated.
    6. Coverslips는 유리 슬라이드에 탑재되었으며 세포에 GFP의 형광 현미경 표현식에 의해 관찰되었다. 차동 간섭 대비 (DIC) 및 형광 이미지는 이미지 J 소프트웨어로 처리되었습니다 올림푸스 BX61 현미경 및 디지털 이미지를 사용하여 인수했다.
  6. pEGFP - N1의 plasmids은 nanoparticles로 캡슐 및 추가 치료에 대한 ML 당 10μg plasmids에 해당하는 농도와 혈청 무료 미디어에 중단되었습니다.
  7. Panc - 1 세포가 잘 인당 200,000 개 셀로 6 - 잘 접시에서 하룻밤 성장했다. pEGFP - N1 plasmids 캡슐의 nanoparticles의 2ml 각 우물에 대우되었다. plasmids의 20μg은 대조군으로 사용되었다 긍정적인 제어 및 치료 세포로 사용되었다 20μl Lipofectin, 양이온 지질 transfection 시약과 함께 혼합했다.
  8. 전지는 6 시간 동안 다른 공법과 incubated되었습니다.
  9. 매체는 24, 48, 72 96시간에 대한 사후 incubated되었습니다 배지와 세포로 대체되었습니다.
  10. 포스트 transfection 후, 세포 lysates은 각 우물에서 수집되었으며 BCA 분석 (피어스)를 사용하여 총 단백질 농도에 대한 분석.
  11. 물론 플레이트는 COA되었습니다각 우물에 단클론 항 - GFP 항체의 1:1000 dilutions의 100μl와 테드. 2 시간 부화 후 판은 PBS - 0.5 % (W / V) 4 번 십대 초반 - 80과 함께 세탁했다.
  12. 300μl TBS 차단 버퍼는 각 우물에 추가하고 2 시간 동안 incubated되었습니다. 다음 판은 다음 PBS - 0.5 % (W / V) 4 번 십대 초반 - 80과 함께 세탁했다.
  13. 각 그룹의 단백질 30μg는 접시에 추가하고 4 명이 하룻밤에 incubated했다. 다음 판은 다음 PBS - 0.5 % (W / V) 4 번 십대 초반 - 80과 함께 세탁했다.
  14. 알칼리성 인산 가수 분해 효소에 상대적으로 보조 반 GFP 항체의 1:2400 dilutions의 100μl은 각 잘 추가 1 시간 동안 incubated되었습니다. 다음 판은 다음 PBS - 0.5 % (W / V) 4 번 십대 초반 - 80과 함께 세탁했다.
  15. 100μl 알칼리성 인산 가수 분해 효소 기판은 각 잘 추가 30 분 1 시간 incubated했다. 플레이트는 405nm에서 흡광도를위한 BioTek 시너지 HT 플레이트 리더로 ​​측정되었다.
  16. 표현 GFP 농도는 MI 당 나노 그램으로보고되었다총 단백질의 lligrams.
  • wt - p53의 플라스미드 캡슐 nanoparticles와 RT - PCR에 의해 transfection 효율의 질적 결정
    1. Wt - p53의의 plasmids은 nanoparticles로 캡슐 및 추가 치료에 대한 10μg 플라스미드 당 ML에 농도와 혈청 동등한 자유 언론에서 중단되었습니다.
    2. Panc - 1 세포가 잘 인당 200,000 개 셀로 6 - 잘 접시에서 하룻밤 성장했다. wt - p53의의 plasmids 캡슐 nanoparticles의 2ml 각 우물에 대우되었다. plasmids의 20μg은 대조군으로 사용되었다 긍정적인 제어 및 치료 세포로 사용되었다 20μl Lipofectin, 양이온 지질 transfection 시약과 함께 혼합했다.
    3. 전지는 6 시간 동안 다른 공법과 incubated되었습니다.
    4. 매체는 48 시간 후 incubated되었습니다 배지와 세포로 대체되었습니다.
    5. mRNA는 (T 높은 순수 RNA 격리 키트 (Roche는 IN, 인디애나,)를 사용하여 각각의 우물에서 추출 Nanodrop 2000 측정되었다hermo 과학, Wilminton, DE).
    6. RT - PCR은 QIAGEN을 사용하여 수행되었습니다 한 단계 RT - PCR 키트 (QIAGEN, 발렌시아, CA). p53의에 대한 Primers, 백스, BCL - 2, 베타 - 굴지, DR5, Apaf - 1, 푸마, Survivin은 Eurofins MWG 오 페론 (헌츠빌, AL)에 의해 합성되었다.
    7. PCR 제품은 겔 전기 영동과 평가되었으며 cDNA 밴드의 픽셀은 ImageJ 소프트웨어로 분석했다.
  • wt - p53의와 치료 효율의 양적 결정은 캡슐 nanoparticles를 palsmid
    1. Wt - p53의 플라스미드는 nanoparticles로 캡슐 및 추가 치료 ML 당 10μg plasmids에 농도와 혈청 동등한 자유 언론에서 중단되었습니다.
    2. Panc - 1 세포가 잘 인당 200,000 개 셀로 6 - 잘 접시에서 하룻밤 성장했다. wt - p53의의 plasmids 캡슐 nanoparticles의 2ml 각 우물에 대우되었다. plasmids의 20μg은 긍정적인 제어와 세포 치료 것처럼 사용되었습니다 20μl Lipofectin, 양이온 지질 transfection 시약과 함께 혼합했다대조군으로 사용.
    3. 전지는 6 시간 동안 다른 공법과 incubated되었습니다.
    4. 매체는 24, 48, 72 96시간에 대한 사후 incubated되었습니다 배지와 세포로 대체되었습니다.
    5. 염색질의 응축 / 분리막 투과율 / 죽은 세포 Apoptosis 키트는 (Invitrogen, Carlsbad, CA) apoptotic 세포 괴사 세포 및 다른 염료 살 세포를 분류하는 데 사용되었다.
    6. CompuCyte에서 iCys 연구 이미징 Cytometer (웨스트 우드, MA)은 치료 후 apoptosis 수준을 분석하고 비교하는 데 사용되었다. 형광 현미경 이미지에 따라 모든 색상의 농도가 기록되었으며 다른 인구가 계산되었습니다위한 카운트하고 비율 비교 꾸몄다.
    7. 세포에 대한 치료가없는 뜻 대조군에 비해 배 변경 apoptotic 세포 밖으로 계산하고 그래프에 표시되었습니다.
    8. 3.8.8 APO - ONE 동차 Caspase - 7분의 3 분석 키트 (Promega, 매디슨, 위스콘신)은 P를 검사하는 데 사용되었다플라스미드 wt - p53의의 transfection 후 RO - apoptotic 활동. 1mg/ml PEI는 모든 apoptotic 활동을 제거하기 위해 대조군으로 사용되었다. 포스트 transfection 후, 세포가 rhodamine 110 대우되었다, 비스 - (N - CBZL - aspartyl - L - 글루 타밀 - L - valyl - L - aspartic 산 아미드, Z - DEVD - R110), 이는 caspase의 기판입니다 3 / 7, 18까지 시간 동안.
    9. 플레이트는 520분의 490 NM에서 형광을 위해 BioTek 시너지 HT 플레이트 리더로 ​​측정되었다. 녹색 형광의 강도에 따라, 프로 - apoptotic 활동은 평가 수 있습니다.
  • 4. 대표 결과

    1. EGFR 타겟 Nanoparticles의 합성 및 Chatacterization

    스키마는 그림 1에서 보여준대로 EGFR 타겟팅 펩타이드 - 수정 nanoparticles가 합성되었다. desolvation에 의해 준비 nanoparticles는 입자 크기와 제타 전위에 대한 특성화했다. 입자의 평균 크기와 표면 요금은 thiolated gelatins에서 준비thiolation의 다른 정도는 표 1에 나열되어 함께. 다른 nanoparticles의 의미 입자 직경이 150-250 nm의 사이에 있었다. Thiolated nanoparticles는 젤라틴 nanoparticles에 비해 작은 크기를 가지고 있습니다 인해 입자 내부의 이황화 다리 형성합니다. 다른 표면 수정, nanoparticles의 크기가 증가하고있다. 다른 공법의 제타의 잠재력은 -20 MV 주변했다. SEM 분석, 크기, 표면 형태 및 nanoparticles의 구면 형상 관찰 및 Zetasizer 결과에 해당했다. 젤라틴 nanoparticles와 thiolated 젤라틴 nanoparticles의 DNA로드 효율성은 95 % (표 1)보다 높은되었습니다.

    그림 1
    표피 성장상의와 thiolated 젤라틴 nanoparticles의 그림 1. 화학 반응 제도, 보여주는 표면 수정R 수용체 (EGFR) 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG) 스페이서를 통해 바인딩 펩타이드.

    Nanoparticles의 특성화

    공식화 Nanoparticle의 직경 (NM) 제타의 잠재력 (MV) 플라스미드 DNA의 로딩 효율 (%)
    젤 NP 151.4 ± 23.5 -17.1 ± 5.23 95.6 ± 2.2
    SH - 겔 NP 132.6 ± 17.9 -24.6 ± 5.16 97.0 ± 3.8
    SH - 젤 - PEG 179.0 ± 30.9 -22.3 ± 9.50 95.8 ± 6.5
    SH - 겔 PEG 펩타이드 230.8 ± 41.5 -18.1 ± 4.02 94.8 ± 5.1

    고마워경 1. 컨트롤과 EGFR 타겟 젤라틴과 젤라틴 thiolated nanoparticles의 입자 크기, 표면 요금 및 플라스미드 DNA를 캡슐 효율성.

    고해상도 C 1S 화학 분석을위한 전자 분광법 (ESCA)의 검사는 펩타이드 - 수정 thiolated 젤라틴 대상 thiolated 젤라틴 (SH - 젤 NP), PEG - 수정할 thiolated 젤라틴 (SH - 젤 PEG)와 EGFR의 표면 구성 요소를 분석하는 데 사용되었다 nanoparticles (SH - 젤 PEG 펩타이드). 표 2의 결과는 정상 285.0에서 CH (탄화 수소), CO (에테르), 그리고 C = O (카보닐) 그룹의 농도, 286.3 및 288.1 EV, 각각을 보여주었다. 에테르의 CO 신호 PEG 수정 후 증가와 펩타이드 결합 후 감소했다. 질소 성분은 PEG 수정 후 감소하고 nanoparticles에서 EGFR 타겟팅 펩타이드의 존재를 확인 펩타이드의 수정, 이후 증가했다 있지만. ESCA 분석 추가 PEG와 펩타이드 표면 수정을 확인했습니다.

    Nanoparticles의 표면 조성의 화학 분석을위한 전자 분광학

    공식화 C 1s (%) O 1s (%) N 1s (%)
    SH - 겔 NP 59.3 ± 0.8 22.9 ± 0.5 12.9 ± 0.1
    SH - 젤 - PEG 58.2 ± 0.6 28.0 ± 1.2 9.5 ± 0.7
    SH - 겔 PEG 펩타이드 56.7 ± 0.8 25.9 ± 0.7 12.3 ± 0.6
    공식화 CC (%) CO, N (%) C = O (% )
    SH - 겔 NP 51.5 26.6 21.9
    SH - 젤 - PEG 17.1 63.1 19.8
    SH - 겔 PEG 펩타이드 33.1 42.8 24.1

    표 2. C 1S 고해상도 전자 분광법의 스캔 화학 분석 (ESCA)에 대한

    캡슐 플라스미드의 안정성을 검토하기 위해, nanoparticles은 simuntaneously 또는 순차적으로, 프로 테아제 또는 DNAse 별도로 취급했다. 전기 영동 후, 그림 2의 결과는 모두 nanoparticles에 캡슐 플라스미드 DNA가 nanoparticles 안정, 알몸 비교 플라스미드 DNA에 의해 보호되는 것으로 나타났습니다. 공부 이들은 이러한 모든 nanoparticles는 캡슐과 캡슐 후 플라스미드 구조를 보존 수있는 것으로 나타났습니다.

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    그림 2. thiolated 젤라틴 캡슐에 플라스미드 DNA의 안정성, PEG - 수정된 젤라틴 thiolated와 EGFR은 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 thiolated 젤라틴 nanoparticles을 펩타이드 - 수정. nanoparticles은 nanoparticle 매트릭스 내에 플라스미드 DNA의 캡슐을 증명하는 프로 테아제의 0.2 MG / ML로 치료했다

    2. 췌장암 전지 기준 EGFR의 표현

    두 사람의 췌장 선암 세포 라인 (Panc - 1과 Capan - 1) EGFR 발현을위한 서양 얼룩에 의해 분석되었다. 인간 난소 선암 (SKOV3)와 murine fibroblast ((NIH - 3T3) 전지는 각각 양극과 음극을 컨트롤로 선정되었습니다. 베타 굴지은 단백질 로딩 컨트롤로 분석되었다. Panc - 1 세포는 Capan - 1에 비해 높은 EGFR 발현을 보였습니다 이 세포 라인은 다음 체외 연구에서 다음을 위해 사용되었다

    3. 제어 및 Surfa의 세포 독성CE - 수정된 다행 Nanoparticles를 Thiolated

    nanoparticles의 세포 상호 작용을 평가하기 위해, 세포 독성의 assays는 nanoparticles 치료 후에 진행되었다. 제어 및 표면 수정 nanoparticles은 PEI 비교와 함께, 심지어는 높은 농도에서 Panc - 1 세포에서 상대적으로 안전하고 biocompatible 있었다 모두 그림 3에 그 결과를 바탕으로. 다음과 같은 연구 1mg/ml nanoparticles와 함께 진행되었다.

    그림 3
    3. Panc - 1 세포에서 nanoparticle 제제의 농도의 함수로 비율 세포 생존 능력은 tetrazolium 염료 (MTS) 분석에 의해 그림을 평가

    4. Panc - 1 세포 수용체 중재 셀 이해

    EGFR 타겟팅 펩타이드와 nanoparticles의 수용체 - 매개 endocytotic 이해의 표면 접근을 확인하려면, 시스템은 각 공동 상표에 의해 설계되었습니다세포의 nanoparticles의 이해와 인신 매매의 시각화에 대해 서로 다른 형광과 mponent. 이 라벨 시스템, 플라스미드 DNA, nanoparticles와 세포 핵은 식별 수 있습니다. 레이저 스캐닝 공촛점 형광 현미경은 6 시간 15 분 거리에 다른 시간 지점에 이미지를 데리고 사용되었습니다. 다른 공법의 이미지를 비교하여, 펩타이드 복합 젤라틴 nanoparticles는 30 분 이내의 빠른 이해와 플라스미드 릴리스를 보여주었다. 이 결과는 더욱 EGFR 펩타이드 - 복합 nanoparticles가 아닌 특정 endocytosis를 받았습니다 다른 nanoparticles에 비해 훨씬 빨랐어요 세포 표면에있는 특정 펩타이드 EGFR과 EGFR 수용체 간의 상호 작용과 빠르고 용이 endocytosis를 받았습니다는 것을 증명.

    세포 인신 연구

    그림 4
    그림 4. 공촛점 형광 현미경Panc - 1 세포에서 DNA - 캡슐 nanoparticle의 이해와 인신 매매의 alysis. (빨간색 = rhodamine - 라벨 nanoparticles, 녹색 = 플라스미드 DNA PicoGreen - 라벨, 파랑 = DAPI - 표시 핵). 레이저의 파워가 낮은 패널의 마지막 네 숫자에 7 번 덜되었다.

    5. 향상된 녹색 형광 단백질과 질적 및 체외의 Transfection에서 양적

    그림 5와 그림 6에서 형광 현미경 분석 엘리사는 수정되지 않은, PEG - 수정 및 EGFR 펩타이드 - 수정 thiolated 젤라틴 nanoparticles의 관리에 따라 Panc - 1 세포의 질적 및 양적 GFP의 tranfection 효율성을 측정하는 데 사용되었습니다. EGFR 타겟 nanoparticles에 의해 전달 Plasmids는 Lipofectin - complexed DNA 등 다른 컨트롤에 상대 48시간 후, GFP의 표현의 높은 수준의 결과.

    그림 5
    그림 5. GFP 표현엘리사에 의해 nalyzed 시간 제어 및 EGFR 타겟 nanoparticles의 플라스미드 DNA의 사후 관리의 기능으로 꾸몄다.

    GFP의 transfection에 대한 Fluoresence 미세 분석

    그림 6
    그림 6. EGFP - N1 24, 48, 72 96시간 후 transfection 후 epifluoresence 현미경에 의해 Panc - 1 세포에서 녹색 형광 단백질 표현의 질적 분석. Lipofectin - DNA 복합은 긍정적인 제어로 사용되었다.

    Panc - 1 세포 6. 야생 형 p53의와 함께 체외에 Tranfection에서 플라스미드

    EF - 1α / HTLV 하이브리드 모터와 야생 타입의 p53의 plasmids pORF - hp53는 E.에서 추출되었다 대장균 및 apoptotic 치료 효과를 연구 nanoparticles에 캡슐. Panc - 1 세포에서 6 시간 동안 입자 및 추가 24 포스트 transfected, 48, 72, 및 96로 치료했다 시간.

    p53의 세포에서 apoptosis가을 유발 수 있으며이 기능을 수행하기 위해서는 이후 많은 하류 전사 요인이 관여하고 직접 wt - p53의 표현 규제 것이다. 그중 백스, caspase - 3, caspase - 9, DR5, 퓨마와 Apaf - 1는 것이 최대 - 규제 p53의 표현에 의해 및 BCL - 2 동안 survivin가 다운 - 규제 것입니다. 이러한 전사 인자의 수준을 검토하기 위해 mRNA은 48 시간 후 transfection 후 Panc - 1 세포에서 추출 및 RT - PCR에 사용되었다. 제품은 겔 전기 영동과 평가되었고 밴드는 ImageJ와 분석했다. 그림 7에 나타난 결과를 바탕으로 survivin은 다른 치료에 비해 EGFR 대상 thiolated 젤라틴 nanoparticles의 치료를 크게 감소, 명백한 변경 백스와 caspase - 3의 표현, caspase - 9, DR5, BCL - 2에서 볼 수 없었습니다 퓨마와 타겟 nanoparticles 트리 트먼트와 함께 Apaf - 1increased.

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    그림 7. wt - p53의 표현의 하류 요인의 mRNA 수준을 48시간 후 transfection 후 RT - PCR에 의해 비교되었다.

    wt - p53의의 transfection 후, 염색질의 응축 / 분리막 투과율 / 죽은 세포 Apoptosis 키트는 apoptotic 세포, 괴사 세포 및 다른 염료 살 세포를 차별화하는 데 사용되었다. CompuCyte에서 iCys 연구 이미징 Cytometer (웨스트 우드, MA)은 치료 후 apoptosis 수준을 분석하고 비교하는 데 사용되었다. 대조군에 비해 배 변경 apoptotic 세포 밖으로 계산하고 그림 8에 나와 있었다. EGFR 대상 thiolated 젤라틴 nanopaticles는 이후 transfection 후 가장 높은 apoptotic 세포 인구를 보여주 있습니다. caspase 7분의 3 활동의 분석은 또한 EGFR 타겟 nanoparticles 빠른 국제화 및 Panc - 1 세포에서 apoptotic 활동의 높은 수준을했다고했다.

    그림 8 그림 8. 컨트롤 wt - p53의에서 프로 - apoptotic 활동 Cytometric 분석 Panc - 1 iCys를 사용하여 셀 ° 이미징 Cytometer을 transfected

    Discussion

    제어 및 EGFR 대상 thiolated 젤라틴 nanoparticles는 효율적인 DNA의 캡슐화 및 안정성과 함께 준비했다. 이러한 시스템의 모든 입자 크기는 직경 150-250 nm의 범위에 있었다. 제타 전위는이 시스템이 약간 부정적인 시스템입니다 것을 증명했다. SEM 분석, nanoparticles의 크기는 Zetasizer 결과와 동일한되었습니다. ESCA 분석 PEG와 펩타이드 표면 수정을 확인 수 있습니다.

    서양 얼룩 분석 Panc - 1 세포가 높은 EGFR 발현 수준을했고이 셀 라인은 체외 연구에서 사용되었다 것으로 나타났다. PEI에 비해 제어 및 표면 수정 nanoparticles 모두 Panc - 1 세포에서 상대적으로 덜 세포 독성되었습니다.

    세포 밀매 연구 빠른 이해와 Panc - 1 세포에서 EGFR 타겟 nanoparticles의 플라스미드 릴리스를 보여주었다. EGFR 타겟 nanoparticles로 표현 기자 plasmids의 DNA의 배달의 최고 수준의 결과Lipofectin - complexed DNA 등 다른 컨트롤에 상대적으로 GFP의 표현. 동일한 시스템으로 wt - p53의 플라스미드와 함께 transfection은 하류 apoptotic 통로 및 Panc - 1 세포에서 유도된 apoptosis 빠른 울렸어요.

    이러한 예비 결과는 EGFR 타겟 thiolated 젤라틴 nanoparticles는 췌장암에 대한 치료로 유전자 치료를위한 안전하고 효율적인 유전자 전달 시스템으로 사용할 수있는 것이 좋습니다.

    Disclosures

    관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

    Acknowledgments

    이 연구는 암 나노기술 우수에 대한 암 센터 (CCNE) 부여 U54 - CA151881에 대한 나노기술의 국립 암 연구소의 연합에 의해 지원되었다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Type B gelatin, Bloom 225 Sigma-Aldrich G9391
    2-iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256
    pEGFP-N1 plasmid Elim Biopharm N/A
    pORF-hp53 E. coli Invitrogen porf-hp53
    Glyoxal solution (40wt. % in H2O) Sigma-Aldrich 128465
    Glycine Sigma-Aldrich 410225-250G
    QIA filter Plasmid Mega kit Qiagen 12281
    Beckman LE 80K Ultracentrifuge Beckman Coulter Inc. N/A
    FreeZone 6 Liter Console Freeze Dry Systems Labconco Corp. 7753020
    mPEG-SCM, MW 2,000 Da Laysan Bio Inc. mPEG-SCM-2K-1g
    MAL-PEG-SCM, MW 2,000 Da Jenkem Technology A5001-1
    Zetasizer Nano Malvern Instruments Zetasizer Nano ZS
    Hitachi 4800 field emission scanning electron microscope Hitachi S-4800 UHR FE-SEM
    Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits Invitrogen P7589
    Lipofectin Transfection Reagent Invitrogen 18292011
    DMEM Mediatech, Inc. 10 013 CM
    RPMI Mediatech, Inc. 50 020 PB
    Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23225
    iBlot Dry Blotting System Invitrogen IB1001
    XCellSureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark Invitrogen EI0002
    Pierce ECL Western Blotting Substrate Thermo Fisher Scientific, Inc. 32109
    Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) System Kodak N/A
    CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega Corp. G3580
    BioTek SynergyHT plate reader BioTek N/A
    Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific, Inc. N/A
    One-step RT-PCR kit Qiagen 210212
    Chromatin Condensation/Membrane Permeability/Dead Cell Apoptosis Kit Invitrogen V23201
    Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay kit Promega Corp. G7790
    Hybaid PCR Sprint Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific, Inc. N/A
    EGF Receptor Antibody Cell Signaling Technology 2232
    β-Actin Antibody Cell Signaling Technology 4967
    Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074
    Mouse Monoclonal GFP Antibody Novus Biologicals NB600-597
    Goat Polyclonal GFP antibody (Alkaline Phosphatase) Novus Biologicals NB600-1502
    Phosphatase Substrate Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 37620

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    References

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    표피 성장 인자를 사용하여 인간의 췌장 암 세포의 유전자 전달 및 Transfection은 다행 기반 엔지니어링된 Nanovectors를 수용체 타겟
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    Xu, J., Amiji, M. Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles. J. Vis. Exp. (59), e3612, doi:10.3791/3612 (2012).More

    Xu, J., Amiji, M. Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles. J. Vis. Exp. (59), e3612, doi:10.3791/3612 (2012).

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