Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

İnsan Pankreas Kanseri Hücrelerinde Epidermal Büyüme Faktörü kullanarak Gen Teslimat ve Transfeksiyon Jelatin Tabanlı Engineered Nanovectors Reseptör-hedefli

doi: 10.3791/3612 Published: January 4, 2012

Summary

B Tipi jelatin tabanlı mühendislik nanovectors sistemi (gens), pankreas kanseri tedavisi sistemik gen teslimat ve transfeksiyon için geliştirilmiştir. Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) nanparticles yüzey üzerinde belirli peptid değişiklik, EGFR reseptör hedef olabilir ve plazmid gibi yüksek intrasellüler glutatyon konsantrasyonları olarak azaltılması, çevre altında serbest.

Abstract

32.000 'den fazla hasta yılda Amerika Birleşik Devletleri, pankreas kanseri tanısı ve hastalığın, çok yüksek mortalite 1 ile ilişkilidir. Acil ihtiyaç, pankreas kanseri hastalarının kasvetli hayatta kalma istatistiklerine artırabilir roman klinik olarak çevrilebilir tedavi stratejileri geliştirmek için vardır. Kanser gen tedavisi muazzam bir söz gösterilmiş olsa da, en büyük zorluk, sürekli transgen ekspresyonu yol açabilir, güvenli ve etkili bir dağıtım sistemi gelişimi.

Jelatin, gıda ve ilaç ürünlerinde yaygın olarak kullanılan çok yönlü doğal biopolimer biridir. Laboratuvarımızda Önceki çalışmalar, B tipi jelatin fiziksel DNA, hücre içi teslimat üzerine plazmid ve geliştirilmiş transfeksiyon verimlilik supercoiled yapısı korunarak kapsülleyen olduğunu göstermiştir. Jelatin thiolation sülfidril grupları polimer ve f. Olabilirnanopartiküller, tüm kompleks ve bir kez disülfit bağ dengeler içinde orm disülfit bağ cytosolda glutatyon varlığı nedeniyle bozuldu, yükü 2-5 serbest olacaktır. Poli (etilen glikol) (PEG) modifiye gens, sistemik dolaşıma uygulanan, uzun tirajlı kez sağlar ve gelişmiş geçirgenlik ve saklama etkisi 6 neovaskülarizasyon hiper geçirgenliği nedeniyle tümör kitlesi tercihen hedeflemektedir. Çalışmalar Panc-1 insan pankreatik adenokarsinoma hücreleri 7 epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR)-ifade göstermiştir. Pankreas kanseri hücre hattı aktif olarak hedef için, EGFR spesifik peptid PEG ayırıcı üzerinden parçacık yüzey üzerine konjuge 8

Çoğu anti-tümör gen terapileri, vahşi tip p53 (wt-P53) olarak 9 hücreleri pro-apoptotik fonksiyonu geri tümör baskılayıcı genler, yönetim üzerinde duruldu . 10 olarak p53 mekanizması fonksiyonları. Pankreas kanseri, en hücrelerin apoptotik aktivite kaybına neden, p53 proteini mutasyonlar var. Wt-p53 giriş apoptozis tamir edilebilir ve kanser hücrelerini 11 daha fazla hücre ölümü tetikler .

Yukarıdaki mantığı dayanarak, EGFR wt-p53 geni teslimat ve Panc-1 hücreleri değerlendirilir teslim verimlilik ve transfeksiyon peptid modifiye thiolated jelatin nanopartiküller yönelik tasarladık.

Protocol

1. Plazmid DNA hazırlanması EGFR Hedefli Jelatin Nanopartiküller Encapsulated

  1. Thiolated jelatin Sentezi
    1. Thiolated jelatin 2-iminothiolane ile B tipi jelatin primer amino gruplarının kovalent konjugasyon önceki yöntem 2-5 olarak sentezlenir. 1 gram jelatin 100 ml deiyonize suda çözülür ve 15 saat oda sıcaklığında 20 mg 2-iminothiolane hidroklorür ile inkübe edildi.
    2. Reaksiyona girmemiş reaktif ardından her 3 saat için 1 mM HCl çözeltisi ile 5 mM HCl çözeltisi, karşı diyaliz ile kaldırıldı. Saflaştırılmış thiolated jelatin 4 ° C daha sonra kullanmak üzere kurutulur ve saklanır dondurma oldu.
  2. DNA içeren nanopartiküller hazırlanması
    1. 200 mg thiolated jelatin, su ve çözelti pH içinde çözünmüş 0,2 M NaOH çözeltisi ilave edilerek 7 ayarlandı. 1mg DNA jelatin solüsyonu eklenir ve yavaşça karıştırılır.
    2. Soğuk etanol karışımı yavaş yavaş eklendiyüksek hızda karıştırarak çözüm. Çözücü bileşimi hidro-alkolik bir çözüm% 75 olarak değiştirildi Nanopartiküller kuruldu.
    3. Nanopartiküller daha yavaş ilave edilerek 0,1 ml% 8 (v / v) glyoxal çözüm çapraz. Reaksiyona girmemiş reaktifleri 0.5 ml 0.2 M glisin solüsyonu ile söndürülür.
    4. Nanopartiküller 16,000 rpm'de 30 dakika süreyle ultra santrifüje edildi. Peletler iki kez deiyonize su ile yıkanır ve saflaştırılmış nanopartiküller dondurularak kurutulmuş ve 4 saklanan idi ° C
  3. Nanoparçacıkların yüzey modifikasyonu
    1. Nanopartiküller konsantrasyonu 10 mg / ml 0.1 M fosfat tamponu (pH 7.4) asılı ve metoksi-PEG-succinimidyl karboksi metil ester (MPEG-SCM, 2.000 MW Da) veya maleimide-PEG-succinimidyl karboksi 2 kez ağırlığı ile inkübe edildi. yavaş karıştırarak oda sıcaklığında 2 saat metilester (MAL-PEG-SCM, 2.000 MW Da).
    2. Pegile nanopartiküller 16,000 rpm'de 30 dakika santrifüj ultra toplandıs Peletler iki kez deiyonize su ile yıkanır ve saflaştırılmış nanopartiküller dondurularak kurutulmuş ve 4 saklanan idi ° C
    3. MAL-PEG-SCM modifiye nanopartiküller 10mg/ml konsantrasyon 0.1M fosfat tamponu (pH 6.5) içinde asılı kalır ve yavaş karıştırma ile oda sıcaklığında 6 saat EGFR spesifik peptid (YHWYGYTPQNVI-GGGGC)% 10 ağırlığı ile inkübe edildi.
    4. Peptid modifiye nanopartiküller 16,000 rpm'de 30 dakika süreyle ultra santrifüj ile toplanmıştır. Peletler iki kez deiyonize su ile yıkanır ve saflaştırılmış nanopartiküller dondurularak kurutulmuş ve 4 saklanan idi ° C

2. EGFR-Hedefli Nanopartiküller Karakterizasyonu

  1. Partikül büyüklüğü ve zeta potansiyel ölçüm
    Nanopartiküller 1mg/ml konsantrasyonu ile su içinde askıya alındı. Süspansiyon Zetasizer Nano (Malvern Inc) kullanılarak analiz edildi. Partikül büyüklüğü analizi 25, 90 derecelik bir saçılma açıyla gerçekleştirildi °C. Zeta potansiyeli 25 dielektrik sabiti, kırılma indisi ve viskozite su varsayılan parametreleri ölçüldü ° C
  2. Taramalı Elektron Mikroskobu
    Liyofilize nanopartiküller alüminyum örnek montaj üzerine monte edilir ve iletkenliği artırmak ve ücret oluşumunu en aza indirmek için paladyum ile sputter kaplı. Örnekler, taramalı elektron mikroskobu ve 3 kV Hitachi 4800 alan emisyonu altında yüzey morfolojisi gözlendi.
  3. Kimyasal analiz için elektron tayfölçer (ESCA)
    Dondurulmuş kuru kontrol formülasyonu, pegile ve peptid değiştirilmiş nanopartiküller ESCA tarafından incelendi. Ulusal Biyomedikal Sorunları ESCA ve Yüzey Analiz Merkezi (NESAC / BIO), University of Washington (Seattle, WA) yapıldı.
    1. Örnekleri çok yüksek vakumlu yerleştirilir ve yüzeyden ikincil fotoelektronların bir emisyon kaynaklı düşük enerjili x-ışını, maruz kaldılar.
    2. Bin bir fonksiyonu olarak tespit edilen elektron sayısı komploding enerji, gözlemlenen spektrum zirveleri her kimyasal bileşenleri ayrıldı.
    3. Yüksek çözünürlüklü C1S spektrum analizi tam kimyasal hidrokarbon bileşimi (285mV az CC veya CH), 286.4mV az eter (CO)) ve karbonil (C = O 288,1 mV) ve her işlevselliği göreceli kompozisyonu belirlemek için yapıldı eğri altında kalan alan ile tespit edildi.
  4. Kapsüllü plazmid stabilitesi
    Kapsüllü plazmid DNA istikrar prekast jeller edilen DNA ile çalışan tarafından da teyit edildi. Nanopartiküller, aynı anda veya sırayla mg / ml proteaz ayrı ayrı içeren PBS (37 ° C'de 30 dakika) ve 0.2 U / ml DNAz (oda sıcaklığında 10 dakika) 0.2 ile sindirilir. Örnekler daha sonra, yanı başına bir 18μL hacmi 100ng/well bir konsantrasyon% 1.2 agaroz jel (GP) (E-Jel, Invitrogen, CA) yüklenir. Çıplak plazmid kontrol olarak yüklenmiş ve jel 75 V 30 dakika boyunca çalıştırıldı. Kodak Dijital X-ray Örnek (DXS) Sistemi b görselleştirmek için kullanılanUV transluminescence Eleştiri.
  5. Plazmid yükleme Belirlenmesi
    Plazmid kapsüllü nanopartiküller ° C'de 30 dakika 1mg/ml kapanmıştır ve 37 0.2mg/ml proteaz ile sindirilir. Çözüm 10 dakika 13.000 rpm'de santrifüj edildi ve süpernatant Picogreen assay (Invitrogen) ile plazmid konsantrasyon için toplandı ve test edildi. Kapsülleme oranı ilk yükleme% 0.5 (w / w) ile kapsüllü plazmid konsantrasyon bölünmesi ile hesaplanır.

3. Panc-1 Pankreas Kanseri Hücreleri In Vitro Transfeksiyon Çalışmaları

  1. Hücre kültürü koşulları
    Panc-1 ve Çapan-1 pankreatik adenokarsinoma hücre hatları, SKOV3 over adenokarsinom hücre dizisi ve NIH-3T3 fare fibroblast hücre hattı ATCC elde edildi. Panc-1 ve NIH-3T3 DMEM 37 ° C ve% 5 CO 2, Çapan-1 gerekli DMEM% 20 fetal sığır serumu verilen L-glutamin, Kalem-strep ve% 10 fetal sığır serumu ile birlikte büyümüş.SKOV3% 10 fetal sığır serumu ile birlikte RPMI-1640 yetişmiştir.
  2. EGFR ifade için Western Blot analizi
    1. Hücre lizatları 2 milyon hücre toplanır ve toplam protein konsantrasyonu BCA yöntemi (Pierce) kullanılarak analiz edildi. NIH-3T3, negatif kontrolü ve SKOV3 EGFR ifade için pozitif kontrol olarak kullanılan olarak kullanılmıştır.
    2. Total protein ekstresi 10 mg, 90 dakika için 135V prekast sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) sistemi çalıştırıldı.
    3. Daha sonra, jel PVDF membran iBlot Blot Kuru Sistemi (Invitrogen) tarafından transfer edildi.
    4. Membran oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 5 Tween içeren Tris buffer salin (TBS-t) yağsız süt ile engellendi.
    5. Membran gecede 4 ayrı primer tavşan beta-aktin antikorları 1:1,000 seyreltme ve birincil tavşan EGFR antikorlar 1:1,000 seyreltme kesilmiş ve inkübe edildi ° C
    6. Membran sonra iki kez yıkandıTBS-t ve oda sıcaklığında 1 saat 1:2,000 dilüsyonları için ikincil anti-tavşan TBS-t at-turp peroksidaz konjuge IgG ile inkübe.
    7. Aşırı antikorlar TBS-t ve su ile iyice durulandıktan sonra, 4 ml ECL substrat (Pierce, Rockford, IL, USA) eklendi ve 5 dakika boyunca membran inkübe.
    8. Chemiluminescent bantları daha sonra Kodak Dijital X-ray Örnek (DXS) Sistemi kullanılarak görüntülendi.
  3. Farklı formülasyonları ile hücre canlılığını çalışmaları
    1. Panc-1 hücreleri gecede tamamlanan DMEM 200μL de 10.000 hücreleri 96-kuyucuğu yetiştirilmiştir.
    2. Büyüme orta nanoparçacıkların 0 ile farklı konsantrasyonlarda içeren serum serbest medya, 0.5, 1, 2, 4, 6 mg / ml ile değiştirildi. 1mg/ml PEI, bilinen sitotoksik katyonik polimer, pozitif kontrol olarak kullanılmıştır.
    3. Hücreler, 6 saat 200μL nanopartiküller ile tedavi edilen ve daha sonra 20μL MTS reaktif ve tam 100μL ile değiştirilir.kültür ortamı.
    4. 37 sonrası 3 saat inkübasyondan sonra ° C,% 5 CO 2, formazan ürünün absorbansı 490nm az BIOTEK SynergyHT plaka okuyucu (Winooski VT) ile ölçüldü .
    5. Hücrelerin yüzde canlılığı, 100 ile çarpılır negatif kontrol (0mg/ml) göre polimer muamele edilen hücreler absorbans oranı olarak ifade ve polimer konsantrasyonları fonksiyonu olarak çizilir.
  4. Hücre ticareti çalışmaları
    1. Rodamin B izotiyosiyanat (RBITC) amin grubu ile reaksiyona girerek thiolated jelatin konjuge için kullanılır oldu. Sonra, diyaliz ve liyofilizasyon RBITC thiolated jelatin nanopartiküller hazırlanması için kullanılan etiketli.
    2. Desolvation önce, 25μL PicoGreen plazmid 1mg 1 dakika karıştırılır ve etiketli plazmid jelatin solüsyonu eklendi. Farklı formülasyonları önceki yöntemi takip yapıldı.
    3. Panc-1 hücreleri p 200.000 hücre cam kapak fişleri içeren 6-kuyucuğu yetiştiğide er. Gece büyümenin ardından etiketli nanopartiküller 2 ml serum serbest ortamda 1mg/ml konsantrasyonu ile her kuyuya tedavi edildi.
    4. Farklı zaman noktalarında sonra, 6 saat 15 dakika, orta oda sıcaklığında 15 dakika inkübasyon için 1μg/ml hoest 33.342 (Invitrogen) içeren kültür ortamı ile değiştirildi. % 4 paraformaldehid çözüm 2ml hücreleri gidermek için her kuyuya değiştirildi. Hücreler daha sonra PBS ile iki kez yıkandı.
    5. Coversilps cam slaytlar üzerine monte edilmiştir. Lazer tarama konfokal floresan mikroskopi sabit hücrelerin görüntüleri çekmek için kullanılmıştır.
  5. Transfeksiyon verimlilik pEGFP-N1 kapsüllü ile floresan mikroskobu ile kalitatif tayin nanopartiküller
    1. pEGFP-N1 plazmid nanopartiküller kapsüllü ve başka tedaviler için ml'de 10μg plazmid eşdeğer konsantrasyon ile serum serbest medya askıya alındı.
    2. Panc-1 hücreleri, 6-kuyucuğu contai gecede büyüdü.ortalama 200.000 hücre ile cam kapak fişleri ning. PEGFP-N1 plazmid kapsüllü nanoparçacıkların 2ml her kuyuya tedavi edildi. Plazmid 20μg 20μl Lipofectin, katyonik lipid transfeksiyon reaktif ile karışık olduğunu ve tedavi edilmezse hücreleri negatif kontrol olarak kullanılmış iken, pozitif kontrol olarak kullanıldı.
    3. Hücreler, 6 saat boyunca farklı formülasyonları ile inkübe edildi.
    4. Orta, 24, 48, 72 ve 96 saat için post-transfekte kültür ortamı ve hücreler ile yer değiştirdi.
    5. Post-transfeksiyon sonra, orta hoest 33.342 (Invitrogen) 1μg/ml içeren kültür ortamı ile değiştirilir ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında hücreler inkübe.
    6. Lameller, cam Slaytlarınıza monte edildi ve floresan mikroskop hücrelerde GFP ifade gözlendi. Diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve floresan görüntüler Görüntü J yazılımı ile işlendi Olympus BX61 mikroskop ve dijital görüntüleri kullanarak satın aldı.
  6. pEGFP-N1 plazmid nanopartiküller kapsüllü ve başka tedaviler için ml'de 10μg plazmid eşdeğer konsantrasyon ile serum serbest medya askıya alındı.
  7. Panc-1 hücreleri ortalama 200.000 hücreleri ile 6-kuyucuğu gecede yetiştiği. PEGFP-N1 plazmid kapsüllü nanoparçacıkların 2ml her kuyuya tedavi edildi. Plazmid 20μg, negatif kontrol olarak kullanılan pozitif kontrol ve tedavi edilmezse hücreleri gibi kullanılan 20μl Lipofectin, katyonik lipid transfeksiyon reaktif ile karıştırıldı.
  8. Hücreler, 6 saat boyunca farklı formülasyonları ile inkübe edildi.
  9. Orta sonrası 24, 48, 72 ve 96 saat süreyle inkübe edildi kültür ortamı ve hücreler ile değiştirildi.
  10. Post-transfeksiyon sonra, hücre lizatları iyi toplandı ve toplam protein konsantrasyonu BCA yöntemi (Pierce) kullanılarak analiz.
  11. iyi plaka coa1:1000 dilüsyonlarının her iyi anti-GFP monoklonal antikorlar ile 100μl ted. 2 saat inkübasyondan sonra, plaka, PBS% 0.5 (w / v) 4 kez Tween-80 ile yıkandı.
  12. 300μl TBS engelleme tamponlar, her bir kuyunun içine eklenir ve 2 saat süreyle inkübe edildi. Sonra plaka, daha sonra PBS-% 0.5 (w / v) 4 kez Tween-80 ile yıkandı.
  13. Her grubun proteinlerin 30μg plaka içine eklenir ve 4 ° 'de bir gece inkübe edildi. Sonra plaka, daha sonra PBS-% 0.5 (w / v) 4 kez Tween-80 ile yıkandı.
  14. Alkalen fosfataz göre ikincil anti-GFP antikorların 1:2400 dilüsyonları 100μl iyi eklenir ve 1 saat süreyle inkübe edildi. Sonra plaka, daha sonra PBS-% 0.5 (w / v) 4 kez Tween-80 ile yıkandı.
  15. 100μl alkalin fosfataz yüzeyler her iyi eklenir ve 30 dakika 1 saat inkübe edildi. Plaka 405nm BioTek Synergy HT, absorbans için plaka okuyucu ile ölçüldü.
  16. Ifade GFP konsantrasyonu mil başına nanogram olarak rapor edilditoplam protein lligrams.
  • Wt-p53 plazmid kapsüllü nanopartiküller transfeksiyon verimlilik RT-PCR ile kalitatif tayin
    1. Wt-p53 plazmid nanopartiküller kapsüllü ve serum serbest medya ileri tedaviler için 10μg plazmid ml başına konsantrasyon eşdeğeri ile askıya alındı.
    2. Panc-1 hücreleri ortalama 200.000 hücreleri ile 6-kuyucuğu gecede yetiştiği. Wt-p53 plazmid kapsüllü nanopartiküller 2ml her bir kuyunun içine tedavi edildi. Plazmid 20μg, negatif kontrol olarak kullanılan pozitif kontrol ve tedavi edilmezse hücreleri gibi kullanılan 20μl Lipofectin, katyonik lipid transfeksiyon reaktif ile karıştırıldı.
    3. Hücreler, 6 saat boyunca farklı formülasyonları ile inkübe edildi.
    4. Orta sonrası 48 saat süreyle inkübe edildi kültür ortamı ve hücreler ile değiştirildi.
    5. mRNA (T Yüksek Saf RNA izolasyon kiti (Roche, IN Indianapolis) kullanarak her bir kuyudan çıkarılan ve Nanodrop 2000 ile ölçülür edildiHermo Bilimsel, Wilminton, DE).
    6. RT-PCR kullanarak QIAGEN tarafından yapıldı Tek aşamalı RT-PCR kiti (QIAGEN, Valencia, CA). P53 Astarlar, Bax, Bcl-2, Beta-aktin, DR5, Apaf-1, Puma, Survivin Eurofins MWG operonunun (Huntsville, AL) tarafından sentezlenir.
    7. PCR ürünlerinin jel elektroforezi ile değerlendirildi ve cDNA bantların piksel ImageJ yazılım ile analiz edildi.
  • Wt-p53 ile tedavi verimliliği kantitatif tayin kapsüllü nanopartiküller palsmid
    1. Plazmid wt-p53 nanopartiküller içine kapsüllü ve serum serbest medya, daha sonraki tedaviniz için ml'de 10μg plazmid konsantrasyon eşdeğer ile askıya alındı.
    2. Panc-1 hücreleri ortalama 200.000 hücreleri ile 6-kuyucuğu gecede yetiştiği. Wt-p53 plazmid kapsüllü nanopartiküller 2ml her bir kuyunun içine tedavi edildi. 20μl Lipofectin, katyonik lipid transfeksiyon reaktif, pozitif kontrol ve tedavi edilmezse hücreleri olarak kullanılan plazmid 20μg ile karıştırılır.negatif kontrol olarak kullanılmıştır.
    3. Hücreler, 6 saat boyunca farklı formülasyonları ile inkübe edildi.
    4. Orta sonrası 24, 48, 72 ve 96 saat süreyle inkübe edildi kültür ortamı ve hücreler ile değiştirildi.
    5. Kromatin Yoğunlaşma / Membran Geçirgenlik / Ölü Hücre Apoptoz Kiti (Invitrogen, Carlsbad, CA) apoptotik hücreler, nekrotik hücreler ve farklı boyalarla canlı hücreleri etiketlemek için kullanılır oldu.
    6. CompuCyte iCys Araştırma Görüntüleme Sitometre (Westwood, MA), tedavi sonrası apoptoz düzeyleri analiz etmek ve karşılaştırmak için kullanılmıştır. Floresan mikroskobik görüntüleri dayanarak, tüm renklerin şiddetleri kaydedildi ve farklı toplumlarda hesaplandı sayıları ve yüzdeleri karşı çizilmiştir.
    7. Hücreler için bir tedavi yoktur anlamına gelen negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, kat değişiklikler apoptotik hücre olarak hesaplanan ve grafikte belirtilen edildi.
    8. 3.8.8 Apo-ONE Homojen Kaspaz-3 / 7 Assay kiti (Promega, Madison, WI) p incelemek için kullanılır.plazmid wt-p53 transfeksiyon sonra ro-apoptotik aktivite. 1mg/ml PEI apoptotik aktivite ortadan kaldırmak için bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Post-transfeksiyon sonra, hücreleri rodamin 110 ile tedavi edildi, bis-(N-CBZL-aspartyl-L-glutamil-L-valyl-L-aspartik asit amid, Z-DEVD-R110), hangi kaspaz bir substrat 3 / 7 18 saate kadar.
    9. Plaka 490/520 nm floresan BioTek Synergy HT plaka okuyucu ile ölçüldü. Yeşil floresan yoğunluğuna göre, pro-apoptotik aktivite değerlendirilir olabilir.
  • 4. Temsilcisi Sonuçlar

    1. EGFR Hedefli Nanopartiküller Sentezi ve Chatacterization

    Şeması Şekil 1'de gösterildiği gibi EGFR hedef peptid değiştirilmiş nanopartiküller sentezlenmiştir. Parçacık boyutu ve zeta potansiyeli desolvation tarafından hazırlanan nanopartiküller karakterize edilmiştir. Parçacıkların ortalama büyüklüğü ve yüzey yükü thiolated jelatin hazırlananthiolation farklı dereceler Tablo 1'de listelenmiştir. Farklı nanoparçacıkların ortalama partikül çapı 150-250 nm arasında. Thiolated nanopartiküller jelatin nanopartiküller göre daha küçük boyutta, parçacıklar içindeki disülfit köprüsü oluşumu nedeniyle. Farklı yüzey değişiklikleri, nanopartiküller boyutları artmıştır. Farklı formülasyonları zeta potansiyelleri -20 mV civarında. SEM analizi ile, boyutları, yüzey morfolojisi ve nanopartiküller küre şeklini tespit ve Zetasizer sonucu karşılık gelen. Jelatin nanopartiküller ve thiolated jelatin nanopartiküller DNA yükleme verimleri% 95 (Tablo 1) daha yüksek bulunmuştur.

    Şekil 1
    Şekil 1: Kimyasal Reaksiyon Programı, epidermal büyüme fiili ile thiolated jelatin nanopartiküller gösteren yüzey modifikasyonur reseptör (EGFR) poli (etilen glikol) (PEG) spacer yoluyla bağlayıcı peptid.

    Nanoparçacıkların Karakterizasyonu

    Formülasyon Nanoparçacık Çapı (nm) Zeta Potansiyeli (mV) Plazmid DNA Yükleme Verim (%)
    Jel NP 151.4 ± 23.5 -17,1 ± 5.23 95.6 ± 2.2
    SH-Gel NP 132.6 ± 17.9 -24,6 ± 5.16 97.0 ± 3.8
    SH-Gel-PEG 179,0 ± 30,9 -22.3 ± 9,50 95.8 ± 6.5
    SH-Gel PEG Peptid 230.8 ± 41.5 -18.1 ± 4.02 94.8 ± 5.1

    Table 1 Tane boyutu, yüzey yükü ve plazmid DNA kapsülleme verimliliği kontrolü ve EGFR-hedefli jelatin ve thiolated jelatin nanopartiküller.

    Yüksek çözünürlüklü C 1S kimyasal analiz için elektron spektroskopisi (ESCA) taramaları hedefleme peptid modifiye thiolated jelatin thiolated jelatin (SH-Gel NP), PEG-modifiye thiolated jelatin (SH-Gel PEG) ve EGFR yüzey bileşeni analiz etmek için kullanılır nanopartiküller (SH-Gel PEG Peptid). Tablo 2'de sonuçları zirve 285,0 CH (hidrokarbon), CO (eter), ve C = O (karbonil) grupları şiddeti, 286,3 ve 288,1 eV sırasıyla gösterdi. Eter CO sinyali PEG değişiklik sonrası artmış ve peptid konjugasyon sonra azalmıştır. Azot bileşimi PEG değişiklik sonrası azalmış ve nano partiküller EGFR hedefleme peptid varlığını doğruladı peptid değişiklik, sonra artmıştır. ESCA analizi, PEG ve peptid yüzey modifikasyonu daha onaylamıştır.

    Nanopartiküller Yüzey kompozisyon Kimyasal Analiz için Elektron Spektroskopisi

    Formülasyon C 1s (%) O 1s (%) N 1s (%)
    SH-Gel NP 59.3 ± 0.8 22.9 ± 0.5 12,9 ± 0,1
    SH-Gel-PEG 58.2 ± 0.6 28.0 ± 1.2 9.5 ± 0.7
    SH-Gel PEG Peptid 56.7 ± 0.8 25.9 ± 0.7 12.3 ± 0.6
    Formülasyon CC (%) CO, N (%) C = O (% )
    SH-Gel NP 51,5 26,6 21,9
    SH-Gel-PEG 17,1 63,1 19,8
    SH-Gel PEG Peptid 33,1 42,8 24,1

    Tablo 2 C 1S yüksek çözünürlüklü elektron spektroskopisi taramaları kimyasal analizi (ESCA)

    Kapsüllü plazmid istikrar incelemek için, nanopartiküller simuntaneously veya sırayla, proteaz ya da DNAz ayrı ayrı tedavi edildi. Elektroforez sonra, Şekil 2'de sonuçları tüm nanopartiküller kapsüllü plazmid DNA nanopartiküller ve istikrarlı, çıplak karşılaştırılabilir plazmid DNA tarafından korunduğunu göstermiştir. Çalışılan Bunlar, tüm bu nanopartiküller saklanması ve kapsülleme sonra plazmid yapısını korumak göstermiştir.

    / Files/ftp_upload/3612/3612fig2.jpg "/>
    Şekil 2 thiolated jelatin kapsüllü plazmid DNA İstikrar, PEG-modifiye jelatin thiolated ve EGFR agaroz jel elektroforezi ile thiolated jelatin nanopartiküller peptid modifiye. Nanopartiküller nanoparçacık matriks içinde plazmid DNA kapsülleme kanıtlamak için proteaz 0.2 mg / ml ile tedavi edildi

    2. Pankreas Kanseri Hücrelerinde Baseline EGFR İfade

    İki insan pankreatik adenokarsinoma hücre hatları (Panc-1 ve Çapan-1), EGFR ekspresyonu western blot ile analiz edildi. İnsan over adenokarsinomu (SKOV3) ve fare fibroblast ((NIH-3T3) hücreleri, sırasıyla pozitif ve negatif kontroller olarak seçilmiştir. Beta-aktin protein yükleme kontrol olarak analiz edildi. Panc-1 hücreleri Çapan-1 ile karşılaştırıldığında daha yüksek EGFR ifade göstermiştir Bu hücre hattı, in vitro çalışmalar aşağıdaki için kullanılır .

    3. Kontrol ve yüzeyler tah, Sitotoksisitece-Modifiye Jelatin Nanopartiküller Thiolated

    Nanoparçacıkların hücresel etkileşim değerlendirmek için, sitotoksisitesini deneyleri nanopartiküller ile tedavisinden sonra gerçekleştirildi. Şekil 3'te sonuçlarına dayanarak kontrol ve yüzeyi modifiye nanopartiküller PEI karşılaştırıldığında, yüksek konsantrasyonlarda bile Panc-1 hücreleri nispeten güvenli ve biyouyumlu her ikisi de,. 1mg/ml nanopartiküller aşağıdaki çalışmalar gerçekleştirilmiştir.

    Şekil 3
    3. Yüzde hücre canlılığı Panc-1 hücreleri nanoparçacık formülasyon konsantrasyonlarının bir fonksiyonu olarak tetrazolium boyası (MTS) yöntemi ile Şekil değerlendirilir

    4. Panc-1 Hücreler reseptör aracılığı Hücre Alımı

    EGFR hedefleme nanoparçacıkların peptit ve reseptör-aracılı endocytotic alımı yüzey erişilebilirlik onaylamak için, bir sistem, her bir ortak etiketleme tarafından dizayn edilmiştirhücrelerde nanopartiküller alımı ve kaçakçılığı görünüm için farklı floresan ile mponent. Bu etiketleme sistemi, plazmid DNA, nanopartiküller ve hücre çekirdeğinde tespit edilebilir. Lazer tarama konfokal floresan mikroskopi, 6 saat 15 dakika, farklı zaman noktalarında görüntüleri çekmek için kullanılmıştır. Farklı formülasyonları görüntüleri karşılaştırarak, peptid konjuge jelatin nanopartiküller, 30 dakika içinde hızlı alımı ve plazmid serbest gösterdi. Bu sonuç, daha EGFR peptid-konjuge nanopartiküller diğer nanopartiküller, non-spesifik endositoz yapıldı kıyasla çok daha hızlı olan hücre yüzeyinde EGFR özel peptid ve EGFR reseptörleri arasında hızlı etkileşim ile kolaylaştırılmıştır endositoz yapıldı olduğunu kanıtladı.

    Hücre Ticareti Çalışması

    Şekil 4
    Şekil 4 Konfokal floresan mikroskopiPanc-1 hücreleri DNA kapsüllü nanoparçacık alımı ve ticareti alysis. (Kırmızı = rodamin-etiketli nanopartiküller, yeşil = plazmid DNA PicoGreen etiketli ve mavi = DAPI etiketli çekirdeği). Lazer gücü, son dört rakamları alt panel 7 kat daha az oldu.

    5. Gelişmiş Yeşil Floresan Protein Niteliksel ve Niceliksel olarak In Vitro Transfeksiyon

    Şekil 5 ve Şekil 6 floresans mikroskopik analiz ELISA yönetim üzerine Panc-1 hücreleri değiştirilmemiş, PEG-modifiye ve EGFR peptid modifiye thiolated jelatin nanopartiküller kalitatif ve kantitatif GFP tranfection verimliliği ölçmek için kullanılır. EGFR-hedefli nanopartiküller tarafından teslim Plazmidler Lipofectin-complexed DNA da dahil olmak üzere diğer kontrollere göre 48 saat sonra en üst düzeyde GFP ifade sonuçlandı.

    Şekil 5
    Şekil 5 GFP ifade AELISA ile nalyzed zaman kontrolü ve EGFR-hedefli nanopartiküller plazmid DNA sonrası yönetim fonksiyonu olarak çizilir.

    GFP transfeksiyon Fluoresence Mikroskobik Analizi

    Şekil 6
    Şekil 6, EGFP-N1 ile 24, 48, 72 ve 96 saat sonrası transfeksiyon sonra epifluoresence mikroskopi Panc-1 hücreleri yeşil flüoresan protein ekspresyonu Kalitatif analiz . Lipofectin-DNA kompleksi pozitif kontrol olarak kullanılmıştır.

    Panc-1 Hücrelerde 6. Wild-Tipi p53 ile İn Vitro Tranfection Plazmid

    EF-1α / HTLV hibrid organizatörü Wild tip p53 plazmid pORF-hp53, E. çıkarıldı coli ve apoptotik tedavi edici etkisini araştırmak için nanopartiküller içine kapsüllü. Panc-1 hücreleri parçacıklar ve 6 saat ek 24 için post-transfekte, 48, 72, ve 96 ile tedavi edildi saat.

    P53 hücre apoptozisi neden olabilir ve bu işlevi gerçekleştirmek amacıyla bu yana, birçok downstream transkripsiyon faktörleri dahil olacak ve doğrudan ifade wt-p53 tarafından düzenlenir. Bunların arasında, Bax, kaspaz-3, kaspaz-9, DR5, PUMA ve Apaf-1 olacaktır up-regüle olan, p53 ifade ve Bcl-2 iken, survivin aşağı düzenlenmiş olacaktır. Bu transkripsiyon faktörleri düzeylerini incelemek amacıyla, mRNA-transfeksiyon sonrası 48 saat sonra Panc-1 hücrelerden ayıklanır ve RT-PCR için kullanılır. Ürünler jel elektroforezi ile değerlendirildi ve bantlar ImageJ ile analiz edildi. Şekil 7 gösterdi sonuçlarına göre, survivin diğer tedavilere göre EGFR hedef thiolated jelatin nanopartiküller tedavi ile önemli ölçüde azalmıştır, hiçbir belirgin değişiklik Bax ve kaspaz-3 ifade, kaspaz-9, DR5, Bcl-2 'de görüldü PUMA ve hedeflenen nanopartiküller tedavi ile Apaf-1increased.

    les/ftp_upload/3612/3612fig7.jpg "/>
    Şekil 7 wt-p53 ekspresyonu alt faktörler mRNA düzeyleri 48 saat sonrası transfeksiyon sonra RT-PCR ile karşılaştırıldı.

    Wt-p53 transfeksiyon sonra, Kromatin Yoğunlaşma / Membran Geçirgenlik / Ölü Hücre Apoptoz kiti apoptotik hücreleri, nekrotik hücreler ve farklı boyalarla canlı hücreleri ayırt etmek için kullanılır. CompuCyte iCys Araştırma Görüntüleme Sitometre (Westwood, MA), tedavi sonrası apoptoz düzeyleri analiz etmek ve karşılaştırmak için kullanılmıştır. Negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, kat değişiklikler apoptotik hücreleri olarak hesaplanan ve Şekil 8 listelenir. EGFR hedef thiolated jelatin nanopaticles sonrası transfeksiyon sonra en yüksek apoptotik hücre popülasyonu göstermiştir. Kaspaz 3 / 7 aktivite analizi EGFR-hedefli nanopartiküller hızlı içselleştirilmesi ve Panc-1 hücrelerinde apoptotik aktivite en üst düzeyde olduğunu gösterdi.

    Şekil 8 Şekil 8 kontrolü wt-p53 pro-apoptotik aktivite sitometrik analizi Panc-1 iCys kullanarak hücrelerin ° Görüntüleme Sitometre transfekte

    Discussion

    Kontrol ve EGFR hedef thiolated jelatin nanopartiküller verimli DNA kapsülleme ve istikrar ile hazırlanmıştır. Tüm bu sistemlerin parçacık boyutları, çapı 150-250 nm aralığında. Zeta potansiyeli, bu sistemi biraz daha negatif bir sistem olduğunu kanıtladı. SEM analizi ile, nanoparçacıkların boyutları Zetasizer sonuç ile aynıydı. ESCA analizi, PEG ve peptid yüzey modifikasyonu onaylamak.

    Western Blot analizi Panc-1 hücreleri yüksek EGFR ekspresyon düzeyleri vardı ve bu hücre hattında in vitro çalışmalar için kullanılmış olduğunu gösterdi. Panc-1 hücreleri ve kontrol yüzeyi modifiye nanopartiküller PEI ile karşılaştırıldığında göreceli olarak daha az sitotoksik edildi.

    Hücre ticareti çalışmaları hızlı alımı ve EGFR-hedefli nanoparçacıkların Panc-1 hücrelerinde plazmid sürümü gösterdi. EGFR-hedefli nanopartiküller ifade muhabiri plazmid DNA Teslim en yüksek seviyelerindeLipofectin-complexed DNA da dahil olmak üzere diğer denetimleri, GFP ifade. Wt-p53 plazmid ile aynı sistem ile transfeksiyon mansap apoptotik yolağı ve Panc-1 hücreleri kaynaklı hızlı apoptozu tetikledi.

    Bu ön sonuçlar EGFR-hedefli thiolated jelatin nanopartiküller, pankreas kanseri için bir tedavi olarak gen tedavisi için güvenli ve verimli bir DNA dağıtım sistemi olarak hizmet verebilir öneririz.

    Disclosures

    Çıkar çatışması ilan etti.

    Acknowledgments

    Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü Kanser Kanser Nanoteknoloji Mükemmeliyet Merkezi (CCNE) hibe U54-CA151881 Nanoteknoloji Alliance tarafından desteklenmiştir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Type B gelatin, Bloom 225 Sigma-Aldrich G9391
    2-iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256
    pEGFP-N1 plasmid Elim Biopharm N/A
    pORF-hp53 E. coli Invitrogen porf-hp53
    Glyoxal solution (40wt. % in H2O) Sigma-Aldrich 128465
    Glycine Sigma-Aldrich 410225-250G
    QIA filter Plasmid Mega kit Qiagen 12281
    Beckman LE 80K Ultracentrifuge Beckman Coulter Inc. N/A
    FreeZone 6 Liter Console Freeze Dry Systems Labconco Corp. 7753020
    mPEG-SCM, MW 2,000 Da Laysan Bio Inc. mPEG-SCM-2K-1g
    MAL-PEG-SCM, MW 2,000 Da Jenkem Technology A5001-1
    Zetasizer Nano Malvern Instruments Zetasizer Nano ZS
    Hitachi 4800 field emission scanning electron microscope Hitachi S-4800 UHR FE-SEM
    Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits Invitrogen P7589
    Lipofectin Transfection Reagent Invitrogen 18292011
    DMEM Mediatech, Inc. 10 013 CM
    RPMI Mediatech, Inc. 50 020 PB
    Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23225
    iBlot Dry Blotting System Invitrogen IB1001
    XCellSureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark Invitrogen EI0002
    Pierce ECL Western Blotting Substrate Thermo Fisher Scientific, Inc. 32109
    Kodak Digital X-ray Specimen (DXS) System Kodak N/A
    CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega Corp. G3580
    BioTek SynergyHT plate reader BioTek N/A
    Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific, Inc. N/A
    One-step RT-PCR kit Qiagen 210212
    Chromatin Condensation/Membrane Permeability/Dead Cell Apoptosis Kit Invitrogen V23201
    Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay kit Promega Corp. G7790
    Hybaid PCR Sprint Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific, Inc. N/A
    EGF Receptor Antibody Cell Signaling Technology 2232
    β-Actin Antibody Cell Signaling Technology 4967
    Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074
    Mouse Monoclonal GFP Antibody Novus Biologicals NB600-597
    Goat Polyclonal GFP antibody (Alkaline Phosphatase) Novus Biologicals NB600-1502
    Phosphatase Substrate Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 37620

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Vimalachandran, D. Genetics and prevention of pancreatic cancer. Cancer. Control. 11, 6-14 (2004).
    2. Kommareddy, S., Amiji, M. Preparation and evaluation of thiol-modified gelatin nanoparticles for intracellular DNA delivery in response to glutathione. Bioconjug. Chem. 16, 1423-1432 (2005).
    3. Kommareddy, S., Amiji, M. Poly(ethylene glycol)-modified thiolated gelatin nanoparticles for glutathione-responsive intracellular DNA delivery. Nanomedicine. 3, 32-42 (2007).
    4. Kommareddy, S., Amiji, M. Antiangiogenic gene therapy with systemically administered sFlt-1 plasmid DNA in engineered gelatin-based nanovectors. Cancer. Gene. Ther. 14, 488-498 (2007).
    5. Kommareddy, S., Amiji, M. Biodistribution and pharmacokinetic analysis of long-circulating thiolated gelatin nanoparticles following systemic administration in breast cancer-bearing mice. J. Pharm. Sci. 96, 397-407 (2007).
    6. Kaul, G., Amiji, M. Tumor-targeted gene delivery using poly(ethylene glycol)-modified gelatin nanoparticles: in vitro and in vivo studies. Pharm. Res. 22, 951-961 (2005).
    7. Bardeesy, N., DePinho, R. A. Pancreatic cancer biology and genetics. Nat. Rev. Cancer. 2, 897-909 (2002).
    8. Li, Z. Identification and characterization of a novel peptide ligand of epidermal growth factor receptor for targeted delivery of therapeutics. FASEB. J. 19, 1978-1985 (2005).
    9. McCormick, F. Cancer gene therapy: fringe or cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 1, 130-141 (2001).
    10. Green, D. R., Kroemer, G. Cytoplasmic functions of the tumour suppressor p53. Nature. 458, 1127-1130 (2009).
    11. Barton, C. M. Abnormalities of the p53 tumour suppressor gene in human pancreatic cancer. Br. J. Cancer. 64, 1076-1082 (1991).
    İnsan Pankreas Kanseri Hücrelerinde Epidermal Büyüme Faktörü kullanarak Gen Teslimat ve Transfeksiyon Jelatin Tabanlı Engineered Nanovectors Reseptör-hedefli
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Xu, J., Amiji, M. Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles. J. Vis. Exp. (59), e3612, doi:10.3791/3612 (2012).More

    Xu, J., Amiji, M. Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles. J. Vis. Exp. (59), e3612, doi:10.3791/3612 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter