Summary
B7-H1 (PD-L1) y su unión a PD-1 proporcionan una importante inducida por tumor señal inmunosupresora en el microentorno del tumor. Una técnica de tinción inmunohistoquímica para caracterizar la expresión y localización de B7-H1 en el adenocarcinoma pancreático se describe aquí.
Abstract
B7-H1/PD-L1, un miembro de la familia B7 de inmuno-reguladoras proteínas de la superficie celular, juega un papel importante en la regulación negativa de respuestas mediadas por células inmunes a través de su interacción con su receptor, muerte programada-1 (PD -1) 1,2. La sobreexpresión de B7-H1 por células tumorales se ha observado en un número de cánceres humanos, incluyendo melanoma, glioblastoma, y los carcinomas de pulmón, mama, colon, ovario y células renales, y se ha demostrado que es perjudicial anti-tumorales T- inmunidad de células 3-8.
Recientemente, B7-H1 expresión por los tejidos de adenocarcinoma pancreático se ha identificado como un marcador pronóstico potencial 9,10. Además, el bloqueo de B7-H1 en un modelo de ratón de cáncer de páncreas se ha demostrado que producen una respuesta anti-tumoral 11. Estos datos sugieren la importancia de B7-H1 como una diana terapéutica potencial. Anti-B7-H1 anticuerpos de bloqueo, por lo tanto están probando en ensayos clínicos para mulples tumores humanos sólidos, incluyendo el melanoma y los cánceres de pulmón, colon, riñón, estómago y páncreas 12.
Con el fin de ser finalmente capaz de identificar a los pacientes que se beneficiarán de B7-H1 focalización terapias, es crítico para investigar la correlación entre la expresión y localización de B7-H1 y la respuesta del paciente al tratamiento con anticuerpos de bloqueo B7-H1. Examinar la expresión de B7-H1 en tejidos pancreáticos humanos adenocarcinoma mediante inmunohistoquímica dará una mejor comprensión de cómo esta molécula de señalización co-inhibidora contribuye a la supresión de la inmunidad antitumoral en el microentorno del tumor. El anticuerpo anti-B7-H1 monoclonal (clon 5H1) desarrollado por Chen y colaboradores se ha demostrado que produce resultados fiables de tinción en secciones criogénicas de múltiples tipos de tejidos neoplásicos humanos 4,8, pero la tinción de portaobjetos incluidos en parafina había sido un reto hasta recientemente 13-18. Tenemos devse fugó el B7-H1 tinción protocolo para las diapositivas incrustadas en parafina de los tejidos adenocarcinoma de páncreas. El protocolo de tinción B7-H1 descrito aquí produce tinción consistente membranosa y citoplásmica de B7-H1 con antecedentes.
Protocol
B7-H1/PD-L1, un miembro de la familia B7 de inmuno-reguladoras proteínas de la superficie celular, juega un papel importante en la regulación negativa de respuestas mediadas por células inmunes a través de su interacción con su receptor, muerte programada-1 (PD -1) 1,2. La sobreexpresión de B7-H1 por células tumorales se ha observado en un número de cánceres humanos, incluyendo melanoma, glioblastoma, y los carcinomas de pulmón, mama, colon, ovario y células renales, y se ha demostrado que es perjudicial anti-tumorales T- inmunidad de células 3-8.
Recientemente, B7-H1 expresión por los tejidos de adenocarcinoma pancreático se ha identificado como un marcador pronóstico potencial 9,10. Además, el bloqueo de B7-H1 en un modelo de ratón de cáncer de páncreas se ha demostrado que producen una respuesta anti-tumoral 11. Estos datos sugieren la importancia de B7-H1 como una diana terapéutica potencial. Anti-B7-H1 anticuerpos de bloqueo, por lo tanto están probando en ensayos clínicos para el consumo humano múltipletumores sólidos incluyendo el melanoma y los cánceres de pulmón, colon, riñón, estómago y páncreas 12.
Con el fin de ser finalmente capaz de identificar a los pacientes que se beneficiarán de B7-H1 focalización terapias, es crítico para investigar la correlación entre la expresión y localización de B7-H1 y la respuesta del paciente al tratamiento con anticuerpos de bloqueo B7-H1. Examinar la expresión de B7-H1 en tejidos pancreáticos humanos adenocarcinoma mediante inmunohistoquímica dará una mejor comprensión de cómo esta molécula de señalización co-inhibidora contribuye a la supresión de la inmunidad antitumoral en el microentorno del tumor. El anticuerpo anti-B7-H1 monoclonal (clon 5H1) desarrollado por Chen y colaboradores se ha demostrado que produce resultados fiables de tinción en secciones criogénicas de múltiples tipos de tejidos neoplásicos humanos 4,8, pero la tinción de portaobjetos incluidos en parafina había sido un reto hasta recientemente 13-18. Hemos desarrollado el staini B7-H1ng protocolo para las diapositivas incrustadas en parafina de los tejidos adenocarcinoma de páncreas. El protocolo de tinción B7-H1 descrito aquí produce tinción consistente membranosa y citoplásmica de B7-H1 con antecedentes.
1. De-parafinization
- Bake desliza a 55 ° C durante 20 min.
- En una campana química, sumergir los portaobjetos en xileno durante 10 min.
- Sumerja los portaobjetos en xileno fresco durante 10 minutos.
- Sumergir desliza en 100% de etanol durante 5 min.
- Sumergir desliza en etanol fresco 100% durante 5 min.
- Sumergir desliza en 95% de etanol durante 5 min.
- Sumergir desliza en 80% de etanol durante 5 min.
- Sumergir los portaobjetos con agua desionizada durante 5 min.
2. Antígeno recuperación
- Sumergir los portaobjetos en tampón Tris-EDTA (pH 9,0) y calor en una olla a presión a 125 ° C durante 30 segundos, luego 90 º C durante 10 sec.
- Deje enfriar diapositivas durante 60 minutos.
- Sumerja los portaobjetos en TBST durante 5 min; Repemenos dos veces.
3. La tinción
- Limpie soluciones alrededor del tejido en las diapositivas. Marcar un círculo alrededor del tejido con un bolígrafo hidrófobo.
- Colocar los portaobjetos en una cámara de humedad y evitar el secado del tejido en la corredera a lo largo de todo el proceso de tinción. Colocar una gota (aproximadamente 200 l o más para cubrir completamente el área de tejido) de bloquear la peroxidasa dentro del círculo hidrófobo sobre el portaobjetos y portaobjetos durante en el bloque peroxidasa durante 5 min.
- Enjuagar los portaobjetos con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min.
- Coloque una gota de tampón de bloqueo BLOCK ACE en cada diapositiva y se incuba durante 15 min.
- Enjuagar los portaobjetos con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min.
- Coloque una gota de solución de avidina en cada diapositiva y se incuba durante 15 min.
- Enjuagar los portaobjetos con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min.
- Coloque una gota de solución de biotina en cada diapositiva y se incuba durante 15 min.
- Enjuague slides con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min.
- Incubar los portaobjetos con dilución 1:1.000 de ratón anti-B7-H1 anticuerpo monoclonal (clon 5H1) o una IgG1 de ratón κ control de isotipo en 200 TBST mu l a 4 ° C durante la noche para 22 hr + / - 1 hr. La concentración final de anticuerpo en TBST es 2,57 g / ml.
- Enjuagar los portaobjetos con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min. Repita dos veces.
- Incubar los portaobjetos con una rata conjugado con biotina anti-IgG1 de ratón anticuerpo secundario a una concentración de 1:500 (en 200 l solución 2% de suero de cabra) durante 30 min.
- Enjuagar los portaobjetos con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min. Repita dos veces.
- Coloque una gota de estreptavidina-biotina (debe estar preparado por lo menos 30 min antes de su uso) en cada portaobjetos y se incuba durante 15 min.
- Enjuagar los portaobjetos con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min. Repita dos veces.
- Coloque una gota de reactivo de amplificación (diluido 2:1 con TBST) a cada lado y se incuba durante 4 min.
- Enjuagar los portaobjetos con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min. Repita dos veces.
- Coloque una gota de estreptavidina-HRP en cada portaobjetos y se incuba durante 15 min.
- Enjuagar los portaobjetos con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min. Repita dos veces.
- Depositar una gota de 3,3-diaminobencidina (DAB) como sustrato y cromógeno en cada diapositiva y desarrollar el color durante 2 min.
- Inmediatamente después del desarrollo del color, lavar los portaobjetos con ddH 2 O durante 1-2 min.
- Incubar los portaobjetos con una gota de hematoxilina durante 90 segundos.
- Lavar con ddH 2 O durante 1-2 min.
- Lavar con agua corriente y jabón durante 1-2 min.
- Lavar con ddH 2 O durante 1-2 min.
4. Deshidratación y montaje
- Sumergir los portaobjetos en etanol al 80% durante 3 min.
- Sumergir los portaobjetos en etanol al 95% durante 3 min.
- Sumergir los portaobjetos en 100% de etanol durante 5 min. Repetir.
- Sumergir los portaobjetos en xileno durante 5 min. Repetir.
- Añadir una gota deCytoseal 60 a la corredera y el lugar del cubreobjetos.
La Tabla 1 enumera los reactivos utilizados en los procedimientos descritos anteriormente.
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Representative Results
Tinción inmunohistoquímica de éxito B7-H1 demostrará la expresión heterogénea de B7-H1 (marrón señales desarrollo del color DAB) en el adenocarcinoma de páncreas. Algunas células de adenocarcinoma pancreático tienen predominantemente membranosa expresión de B7-H1 (Figura 1A) mientras que otras tienen una expresión ya sea predominantemente citoplasmática de B7-H1 o poca expresión de B7-H1 (Figuras 2 y 3). Epitelio del conducto pancreático normal expresa poco B7-H1 (Figura 4). La tinción con un anticuerpo de ratón IgG1 de control de isotipo κ en lugar del anticuerpo anti-B7-H1 muestra la tinción de fondo poco (Figura 1B).
Figura 1. Tinción A. inmunohistoquímica con el anticuerpo anti-B7-H1, clon de anticuerpo 5H1 muestra la expresión membranosa en algunas células pancreáticas adenocarcinoma. B. Immunohistoctinción hemical con el control de isotipo IgG1 muestra un desarrollo poco de color DAB en el tejido pancreático adenocarcinoma mismo.
Figura 2. B7-H1 expresión en el citoplasma de células de adenocarcinoma pancreático.
Figura 3. Algunas células de adenocarcinoma de páncreas expresar poco B7-H1.
Figura 4. B7-H1 expresión en el epitelio ductal pancreático normal.
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Discussion
La tinción inmunohistoquímica de B7-H1 en criosecciones se ha informado en estudios anteriores para una variedad de cánceres 3,4. Sin embargo, las muestras de tumores clínicas por lo general sólo están disponibles en forma de bloques incluidos en parafina. El anticuerpo monoclonal 5H1 Más recientemente se ha aplicado con éxito a la tinción de tejidos embebidos en parafina de tumores incluyendo carcinoma de células renales, carcinoma cervical, cáncer de vejiga y melanoma 13-18. B7-H1 en la tinción en parafina 9,19 o criostato 20 secciones de tejidos de adenocarcinoma pancreático con otros anticuerpos monoclonales también se ha descrito. Aquí, hemos demostrado con éxito de la tinción de tejidos incluidos en parafina de adenocarcinoma de páncreas con el anticuerpo monoclonal 5H1 para B7-H1. La expresión de B7-H1 en el adenocarcinoma pancreático es heterogénea, similar a la de muchos otros tipos de tumores malignos tales como melanoma 4,21. Tanto la expresión membranosa y citoplásmica de B7-H1 are observado con células de adenocarcinoma (Figuras 1 y 2). Membranosa expresión de B7-H1 es coherente con su función biológica. El papel de la citoplásmica B7-H1 en los tejidos neoplásicos que queda por explorar. Normales de los conductos pancreáticos o células epiteliales acinares no expresan B7-H1 (Figura 4).
Todos los pasos de este protocolo tener lugar a temperatura ambiente, a excepción de la incubación durante la noche a 4 ° C. Condiciones de recuperación de antígenos utilizados en este procedimiento de tinción B7-H1 no se informaron en la citada publicaciones de 9,19. La etapa de amplificación no fue también empleado por estos estudios. Se encontró que los pasos críticos en este protocolo incluyen la recuperación de antígeno, la incubación durante la noche con el anticuerpo primario, la amplificación, y el desarrollo de color DAB. La dilución del anticuerpo primario que tenga que ser ajustada ligeramente para cada lote diferente de 5H1. La amplificación se ha mantenido exactamente a 4 minutos conun reactivo de amplificación diluida. Estas modificaciones dan suficiente amplificación de señales positivas sin aumentar el fondo. El tiempo de desarrollo es típicamente 2 min, pero de manera rutinaria controlar el desarrollo bajo un microscopio para asegurarse de tinción óptima con el fondo mínimo. Con cada ronda de tinción, que incluyen una diapositiva de un lote anterior y de una diapositiva del tejido de las amígdalas como controles positivos. Tinción paracortical de B7-H1 en la amígdala ha sido descrita previamente 4. Si el fondo es alto o si se tarda más de 5 minutos para desarrollar señales típicas en estos portaobjetos de control, se recomienda sustituir los reactivos para los pasos críticos y verificar todos los pasos de tinción.
El uso de esta técnica de tinción permite el análisis cualitativo y semicuantitativo de la expresión de B7-H1 y la localización en células neoplásicas del adenocarcinoma de páncreas. Con la modificación de la dilución del anticuerpo primario, la longitud y la dilución de la amplificatien el paso, y el tiempo de desarrollo de color, este protocolo se puede aplicar a otros tipos de tejidos. Hemos modificado este protocolo y lo utilizó para el cáncer de mama y los tejidos de sarcoma. Como B7-H1 y su unión a PD-1 proporcionan una importante inducida por tumor señal inmunosupresora en el microentorno del tumor, esta técnica de tinción facilitará la comprensión de la función del microentorno del tumor en la iniciación del tumor, progresión y anti-tumor respuesta inmune.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
EB, KMB, HX y contribuir por igual. Este estudio fue apoyado por el NCI SPORE en cánceres gastrointestinales P50 CA062924, CA148964 NIH K23, Fundación Lustgarten, Fundación Viragh, Premio Joven Investigador ASCO, NIH 5T32 CA0090701-28 Training Grant, Sol Goldman cáncer de páncreas Center y la Fundación Nacional de páncreas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSA System | Dako | K1500 | Includes the following reagents mentioned in the protocol: peroxidase block, streptavidin-biotin complex, amplification reagent, streptavidin-HRP, and DAB substrate and chromogen |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| Block ACE | Serotec | BUF029 | |
| Biotin anti-mouse IgG1 | BD | 553441 | |
| Mouse IgG1 K Isotype Control | eBioscience | 14-4714-85 | |
| TBS(Tris-buffered saline), 10X | Cellgro | 46-012-CM | 10xTBS contains 80 g/L NaCl and 24.2 g/L Tirs; Diluted to 1X with ddH2O for washes; |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 1 ml added to 1 L of 1X TBS to make TBST |
| Target Retrieval, 20x | Celerus Wave | 014-3000-000 | Diluted to 1x with ddH2O |
| 190 Proof Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000190 | |
| 200 Proof Ethyl Alcohol | Pharmo-Aaper | 111000200 | |
| Xylene | VWR | 95057-827 | |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 72804 | |
| Cytoseal 60 | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Coverslips | Corning | 2940-245 | |
| Humidity chamber | Sigma | H6644 | |
| Table 1. Reagents and equipment. | |||
References
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