1. Antibody Adsorption Afvejes 120 mg Protein A-Sepharose i en 15 ml konisk rør (Falcon). Som 15 mg protein A-Sepharose er nødvendig for hver immunoprecipitation (IP) Denne mængde er tilstrækkelig til 8 IP'er. Der tilsættes 5 ml 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,4), og lad Protein A Sepharose kvældning i 30 min ved 4 ° C. (Bemærk, at alle trin fra dette punkt på skal udføres med handsker for at undgå forurening med keratin og på is for at undgå proteinnedbrydning / kompleks dissociation.) Centrifugeres i 60 sekunder ved 1.000 x g og 4 ° C for at pelletere opkvældet protein A-Sepharose. Omhyggeligt fjerne supernatanten og resuspendere perlerne i 5 ml 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,4). Gentag dette trin tre gange for at vaske perlerne grundigt. Efter det sidste centrifugeringstrin, fjern supernatanten og efterlade cirka 0,5 ml phosphatbuffer. Tilsættes 0,9 ml 0,5 M phosphatpuffer (pH 7,4), 400pi affinitetsoprensede primære antistoffer (50 pi per IP) mod målproteinet (her HSP70B), og 16 gl antistoffer mod en kontrol-protein (her CF1β). Påfyld ddH 2 O til et samlet volumen på 5 ml. (Bemærk, at affinitetsoprensede antistoffer skal anvendes til reduktion af kontaminering af uspecifikke IgG, som interfererer med nano-LC-MS-analyse – for en protokol se Willmund et al (2005) 10 CF1β fældes som en loading kontrol og blev valgt.. fordi det er rigelige og, efter cellelyse, er til stede i opløselige og membranassocierede fraktioner. Alternativt kan niveauer for forurenende proteiner anvendes til at normalisere til ulige belastning.) Tillad Protein A-Sepharose-perler til adsorption af IgG'er i løbet af en 1-times inkubation ved 25 ° C på et rør valse (CAT RM5W, 36 rpm). Centrifugeres i 60 sekunder ved 1.000 x g og 4 ° C for at pelletere protein A Sepharose-perler. Fjern forsigtigt supernatanten og resuspend perlerne i 5 ml 0,1 M natriumborat-puffer (pH 9,0). Gentag dette trin tre gange til grundigt at fjerne aminer, der ville slukke tværbinderen. Afvej 25,9 mg af frisk, solid dimethylpimelimidate og resuspendere den i 5 ml 0,1 M natriumborat-puffer (pH 9,0) til opnåelse af en slutkoncentration på 20 mM. Tilsættes til den protein A-Sepharose-perler. Tillad IgG'er til tværbinding til protein A i 30 minutter ved 25 ° C på et rør valse. Centrifugeres i 60 sekunder ved 1.000 x g og 4 ° C for at pelletere kuglerne. Omhyggeligt fjerne supernatanten og resuspendere perlerne i 5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5) for at kvæle frie tværbinder. Gentage dette trin én gang og inkuberes i 2 timer ved 25 ° C eller 12-24 timer ved 4 ° C på et rør valse. Valgfrit: Hvis Protein A-Sepharose-perler koblet med IgG ikke direkte anvendes til IP, opbevaring i op til en uge er mulig. Til dette, ° centrifuge i 60 sekunder ved 1.000 xg og 4 C til pellet perlerne, forsigtigt fjerne supernatant og resuspender perler i 5 ml 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,5) indeholdende 0,02% natriumazid og opbevar ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse. 2. Cellelyse, tværbinding og Prøvefremstilling Vokse to Chlamydomonas kulturer i medium indeholdende 7,5 mM 14 NH4CI eller 15 NH4CI som nitrogenkilde til en densitet på ~ 5 x 10 6 celler / ml. Celler er nødt til at passere gennem mindst ti generationer for fuld mærkning. Her blev celler dyrket photomixotrophically i TAP medium 11 på en roterende omryster ved 25 ° C under kontinuerlig bestråling med hvidt lys (30 μE m -2 s -1). Overfør to alikvoter hver af 14 N-og 15N-mærkede celler til fire GSA rør og høst celler af en 4 minutters centrifugering ved 4.000 x g og 4 ° C (Celletallet høstet for hver alikvot er afhængig af den cellulære koncentration af målet protein og skal bestemmes empirically i forvejen at sikre, at tilstrækkelig målprotein udfældes. Et godt udgangspunkt er 10 9 celler pr aliquot, dvs 200 ml af en kultur med 5 x 10 6 celler / ml.) Til tværbinding Kun: hvis proteinkomplekser vil blive tværbundet forud for undersøgelsesperioden, celler skal vaskes for at fjerne aminer er til stede i mediet. Til dette overføre Resuspender cellerne i 40 ml forafkølet KH-buffer (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 80 mM KCI), og dem til 50 ml Falcon-rør. Centrifugeres i 60 sekunder ved 1.000 x g og 4 ° C. Gentag dette trin én gang. Resuspender cellerne i 2 ml lysepuffer (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 1 mM MgCI2, 10 mM KCI, 154 mM NaCI) for-kølet til 4 ° C og overføre dem til 15 ml Falcon-rør. Opsaml de resterende celler i GSA rør med yderligere 1 ml lyseringsbuffer hver. Tilsættes 50 pi 25 x proteaseinhibitor og 12,5 gl 1 M MgCI2 (til en slutkoncentration på 3,5 mM) til hver portion. Tilsæt 150pi lysisbuffer, 12.5 pi 1 M ATP, 833 ul 270 mM creatinphosphat og 7 gl 5 ug / ul kreatinkinase (slutkoncentrationen er 2,5 mM ATP, 45 mM creatinphosphat, og 7 ug / ml creatinphosphokinase) til en af De alikvoter indeholdende 14 N-og 15N-mærkede celler (disse er de + ATP alikvoter). Tilsættes 930 ul lysepuffer og 70 gl 1 U / pl apyrase til de andre alikvoter indeholdende 14 N-og 15N-mærkede celler (disse er de-ATP alikvoter). Inkuber i 2 minutter ved 25 ° C på et rør valse til at etablere ATP-nedbryder og ATP-propfuld tilstande. Hvis tværbindingstrinnet udelades, tilsættes yderligere 1 ml lysisbuffer. Til tværbinding Kun: hvis de undersøgte protein-protein interaktioner er forbigående er det tilrådeligt at fange dem ved et tværbindingstrin. Til dette tilsættes 500 pi 20 mM dithio-bis (succinimidylpropionat) (DSP) opløst i DMSO (slutkoncentration er 2 mM) til each rør direkte før lydbehandling. Soniker fire gange 20 sek på is for at bryde cellerne med 20-sek pauser i mellem til afkøling. (Vi bruger BANDELIN Sonoplus HD2070 med en KE76 spids på udgang kontrol over 75% og duty cycle på 60%. De nødvendige indstillinger for andre maskiner / udstyr / tips skal fastlægges på forhånd for at sikre fuldstændig cellelyse og at undgå at spilde. ) Til tværbinding Kun: tillade protein-komplekser til tværbinding ved inkubation i 1 time ved 4 ° C på et rør valse. Efter tværbinding, supplere hvert rør med 500 gl 1 M glycin og inkuberes på et rør valse i yderligere 15 minutter ved 4 ° C for at standse frie tværbinder. Forberede fire 6-ml saccharose puder (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 0,6 M saccharose) SW41 Ti tynd væg rør (Beckman Coulter Medie nr.: 344059), forsigtigt lægge hele ~ 5,5 ml cellelysater på saccharose puder (balance med lysepuffer) og centrifugeres i 30 minutter ved 200.000 x g og 4 ° C i en SW41 Ti rotor. Overfør toppen af gradienten, der indeholder opløselige proteinkomplekser i fire 15-ml Falcon-rør (undgå at overføre dele af saccharosepude), tilsættes 350 pi 10% Triton X-100 til en slutkoncentration på 0,5% til hver af dem, blandes omhyggeligt og tilføje Lysis buffer til et samlet volumen på 7 ml hver. (Transfer 70 pi af hver opløselig celleekstrakt til friske 1,5 ml koniske rør (Eppendorf-rør), og der tilsættes 70 pi 2 x SDS-prøvepuffer (4% SDS, 125 mM Tris-HCI (pH 6,8), 20% glycerol, 10 % 2-mercaptoethanol) til hver for SDS-PAGE og immunoblot-analyser.) Kasser saccharose puder og resuspender membran pellets i 3 ml lyseringspuffer hver. Til hvert 1 ml 10% Triton X-100 til en slutkoncentration på 2%, sonikeres på is for at opløse pellets, og der tilsættes lysepuffer til et samlet volumen på 5 ml hver. Forbered yderligere fire 6-ml saccharose puder i SW41 Ti tyndvæggede rør, lægge ~ 5 ml af solubiliserede membraner fra trin 2,10 forsigtigt på saccharosepuder, og centrifuger i 30 minutter ved 200.000 x g og 4 ° C i en SW41 Ti rotor. Overfør toppen af gradienten, der indeholder membranprotein-komplekser i fire 15-ml Falcon-rør, og der tilsættes Lysis buffer (indeholdende 2% Triton X-100) til et slutrumfang på 7 ml hver. (Transfer 70 pi af hver opløselig celleekstrakt til frisk Eppendorf-rør og tilsæt 70 pi 2 x SDS-prøve til hvert af SDS-PAGE og immunoblot-analyser.) 3. Immunpræcipitation Pellet protein A Sepharose-perler indeholdende koblede antistoffer (fra trin 1,8 og 1,9) ved en 60 sec centrifugering ved 1.000 x g og 4 ° C, forsigtigt fjerne supernatanten og resuspender perler i 4 ml lyseringsbuffer. Gentag dette trin to gange at komme i ligevægt perler i Lysis buffer. Fyld op til 8 ml med lysisbuffer og overføres 1 ml af suspensionen på hver af de otte 15-ml Falcon rør indeholdende opløselige eller membran proteinkomplekser fra ATP-fyldt og ATP-nedbryder 14 </sop> N-og 15N-mærkede celler (fra trin 2.9 og 2.12). Der inkuberes i 2 timer ved 4 ° C på et rør valse til udfældning af proteinkomplekser. Pellet perlerne ved en 60-sec centrifugering ved 1.000 x g og 4 ° C og kasseres supernatanterne. Efterlade et lille væskevolumen på toppen af perlerne for at lette overførslen. Overfør perlerne fra hvert Falcon-rør til 1,5 ml koniske rør (Eppendorf-rør). At indsamle alle resterende perler i Falcon-rør, tilføje yderligere 0,8 ml lysisbuffer indeholdende 0,1% Triton til hver, vortex forsigtigt, centrifugeres i 60 sekunder ved 1.000 x g og 4 ° C og overførsel af pufferen med resterende perler til Eppendorf-rør. Tube udveksling er nødvendig for at forhindre forureninger fra proteiner klæber til plast vægge. Pellet perlerne ved en 15-sec centrifugering ved 16.100 x g og 4 ° C, forsigtigt fjerne supernatanterne og resuspender perler i 1,3 ml lysebuffer indeholdende 0,1% Triton. Gentag dette trin to gange med lysis buffer indeholdende Triton og to gange med lyseringsbuffer mangler Triton til grundigt at vaske perlerne. Efterlade et lille væskevolumen på toppen af perlerne for at lette overførslen. Igen overføres perlerne til friske 1,5 ml Eppendorf-rør til fjernelse af proteiner, der klæber til plastvæggene. Vask de gamle rør med 1 ml lysepuffer mangler Triton og overføre alle resterende perler til de friske rør. Der centrifugeres i 15 sekunder ved 16100 x g og 4 ° C, fjerne supernatanterne først med en normal pipette, og derefter fjernelse af eventuelt resterende supernatant fuldstændigt med en 50 pi Hamilton-sprøjte. 4. Sample Forberedelse til nano-LC-MS/MS Tilsæt 100 gl frisk fremstillet elueringspuffer (8 M urinstof, 25 mM NH4 HCO 3) til hvert rør, så brug 100 ul elueringspuffer at vaske perlerne klæber til Hamilton-sprøjte og inkuberes i 10 minutter i en Thermomixer ved 800 rpm og 65 ° C, og i yderligere 20 min ved 30 ° C. (En mere kompleteluering af bundne proteiner opnås ved eluering med 2% SDS og efterfølgende udfældning med 80% acetone.) Centrifuger i 15 sekunder ved 16.100 xg og 25 ° C. Overfør supernatanterne til friske rør med et 50 pi Hamilton-sprøjte. Tilsættes 50 ul elueringspuffer til perlerne, bruge 50 ul elueringspuffer at vaske perlerne klæber til Hamilton-sprøjte og gentage inkubation og centrifugering trin 4.1 og 4.2 hhv. Pool de respektive eluater. (Transfer 30 ul af eluaterne til friske Eppendorf-rør, 30 pi 2 x SDS-prøvepuffer til hver for SDS-PAGE og immunoblot-analyser tilsættes.) Kombiner den eluerede udfældes fra + /-ATP-behandlede, 14 N-og 15N-mærkede opløselige og membranassocierede proteiner som følger: 120 pi 15 N / + ATP og 120 pi 14 N /-ATP 120 pi 14 N / + ATP og 120 pi 15 N /-ATP 120 pi 15 N / + ATP og 120 pi 14 N /-ATP <br /> 120 pi 14 N / + ATP og 120 pi 15 N /-ATP Tilsættes 1,5 gl frisk fremstillet 1 M DTT til en slutkoncentration på 6,5 mM til hver af de fire kombinationer til at reducere disulfidbindinger (herunder dem i tværbinder) og inkuberes i 30 minutter ved 25 ° C. Tilsættes 10,5 pi frisk fremstillet 0,6 M iodacetamid til en slutkoncentration på 25 mM til carboxymethylate de reducerede thioler og inkuberes i 20 minutter ved 25 ° C i mørke. Tilsættes 256 pi 40 mM NH4 HCO 3 og 4 pi Lys-C (0,1 pg / pl), forsegling rør med parafilm og inkuber i mindst 16 timer natten over på et rotationshjul ved 37 ° C. Tilsættes 470 pi 20 mM NH4 HCO 3, 10 pi 100% acetonitril (til en slutkoncentration på 1%) og 8 ul trypsin perler, og inkuberes i et rotationshjul i mindst 16 timer ved 37 ° C. Centrifugeres i 5 minutter ved 16.100 x g og 4 ° C og overførsel supernatanter til frisk 2-ml Eppendorf tubes. Vask de gamle rør med 50 ul 20 mM NH4 HCO 3, 0,5% eddikesyre, og pool med første supernatanter. For afsaltning, forberede hjemmelavede C 18-StageTips ved at skære ud to diske fra Empore C 18 materiale med en kanyle og placere dem i en 200-pi pipettespids. På denne måde forberede fire 200-ul tips. Punch huller i lågene af fire 2-ml Eppendorf rør og indsætte tips. Forudsætning af C 18-StageTips med 50 ul opløsning B (80% acetonitril, 0,5% eddikesyre). Centrifugeres i 3 minutter ved 800 g og 25 ° C. Ækvilibrere C18-StageTips med 100 gl Opløsning A (0,5% eddikesyre, 2% acetonitril). Centrifugeres i 3 minutter ved 800 g og 25 ° C. Gentag dette trin én gang. Load 100 gl af supernatanterne fra de tryptiske fordøjelser (4.9) på C18-StageTips og centrifugeres i 3 minutter ved 800 g og 25 ° C. Gentag dette trin, indtil de fuldstændige supernatanter blev anvendt tilkolonnerne. Vask C18-StageTips med 100 gl opløsning A. centrifugeres i 3 minutter ved 800 g og 25 ° C. Gentag dette trin to gange. Eluering tryptiske peptider i en frisk 1,5 ml Eppendorf-rør med 50 ul opløsning B. centrifugeres i 3 minutter ved 800 g og 25 ° C. Gentag dette trin én gang. Tørre peptider til færdiggørelse i en Speed Vac. Valgfrit: sæl Eppendorf rør med parafilm og opbevares ved -80 ° C indtil videre anvendelse. Resuspender de tørrede peptider med 20 ul opløsning A og inkuberes i mindst 1 time på is, afbrudt af to 15-minutters inkubationer i et sonikatorbad. Centrifuger i 20 minutter ved 16.100 x g og 4 ° C, og anvende supernatanten til nano-LC-MS/MS. 5. Repræsentative resultater Som vist eksemplarisk for de 14 N-mærkede celleekstrakter i figur 2A, er HSP70B og CGE1 næsten udelukkende lokaliseret til den opløselige fraktion, uafhængigt af ATP tilstand. IDerimod CF1β er lokaliseret til opløselige og membran-berigede fraktioner, som lydbehandling sakse med fra membran-lokaliserede CF o, og tjener derfor som loading kontrol for begge fraktioner. Som vist i figur 2B blev tilsvarende mængder af HSP70B præcipiteret med anti-HSP70B antistoffer fra 14 N-og 15N-mærket opløselige ekstrakter, uafhængigt af ATP tilstand. I modsætning hertil blev kun lidt HSP70B udfældet fra membranfraktioner med lidt større mængder stammer fra ATP-depleteret membranfraktioner i forhold til ATP propfuld fraktioner, således bekræfter tidligere resultater 9. Ingen CGE1 blev co-udfældet med HSP70B i ATP-propfuld opløselige eller membran fraktioner, mens store mængder CGE1 blev co-udfældet med HSP70B fra ATP-udtømte opløselige fraktioner, og lidt fra ATP-udtømte membranfraktioner. Interaktionen af CGE1 med HSP70B kun i ADP tilstand er også observeret iMS-analyse: i figur 3, som er repræsentativ MS1 spektre af HSP70B og CGE1 peptider fra præcipitater genereret med HSP70B antiserum fra opløselige celleekstrakter er vist. I eksperimentet vist i figur 3A, blev præcipitatet fra blandinger af 14 N-mærkede ekstrakter mangler ATP og 15 N-mærkede ekstrakter indeholdende ATP. Mens den tunge og lette mærket form af HSP70B peptidet blev påvist på samme intensiteter, blev kun lyset mærket form af CGE1 peptid (fra-ATP ekstrakter) fundet. I figur 3B de samme peptider fra anti-HSP70B bundfald afledt af blandinger af hinanden mærkede opløselige celleekstrakter er vist. Følgelig denne gang kun den tunge mærkede form af CGE1 peptid (fra-ATP ekstrakter) blev detekteret, mens dette var igen tilfældet for både, lette og tunge mærkede HSP70B peptider. <strong> Figur 1. Eksperimentelle arbejdsgang. Cellerne metabolisk mærket med 14 N og 15 N i mindst 10 generationer, høstet og leveres med eller forarmet fra ATP. Efter cellelyse proteinkomplekser eventuelt kan være tværbundet (X-link) med DSP. Lyserede celler separeres derefter i opløselig (Sol) og membran-berigede (Pel) fraktioner. Målproteiner (her HSP70B) og en kontrol-protein (her CF1β) er immunpræcipiteret med specifikke antistoffer koblet til protein A-sepharosekugler (sort). Efter vask udfældede proteiner elueres og enten direkte analyseret ved immunoblotting, eller de respektive 14 N-og 15N-mærket fraktioner i + ATP og ATP-tilstande pooles, fordøjes og analyseres ved nano-LC-MS/MS. I eksemplet viste tilfælde her de 15 N-mærkede fraktion blev udtømt fra ATP. Følgelig er forholdet mellem intensiteter af tunge mærkede (mørke farver) til lys mærkede (lyse farver) peptider fra kontrolprotein(CF1β), målproteinet (HSP70B) og ikke-specifikt bundne forureninger skal vare ca, mens dette forhold forventes at være meget høj for proteiner specifikt interagerer med målproteinet (CGE1). se større tal . Figur 2. En analyse af råmaterialer, HSP70B immunfældning. Samlet protein blev ekstraheret fra opløseligt (Sol) og membran-berigede (Pel) fraktioner enten depleteret fra ATP (-ATP) eller suppleret med ATP og et ATP-regenererende system (+ ATP). 0,01% af proteinekstrakter blev separeret på en 10% SDS-polyacrylamidgel, og niveauer af HSP70B og CGE1 protein i forhold til lastning kontrol CF1β blev analyseret ved immunoblotting. B Analyse af immunopræcipitater. HSP70B blev immunopræcipiteret fra 14 N-og15N-mærkede opløselige og membran-berigede celleekstrakter indeholder eller mangler ATP. Proteiner svarende til 3,3% af immunpræcipitater blev separeret på en 10% SDS-polyacrylamidgel og niveauer af HSP70B og CGE1 forhold til lastning kontrol CF1β blev analyseret ved immunoblotting. se større tal . Figur 3. En repræsentant massespektre af HSP70B og CGE1 peptider fra anti-HSP70B immunpræcipitater udført på blandede opløselige fraktioner (14 N-ATP / 15 N + ATP). Full MS-spektre på 14 N og 15 N mærkede peptider, svarende til-ATP og + ATP stater, henholdsvis fra HSP70B og co-immunopræcipiterede CGE1 er vist. Begge peptider tredobbelt opladet, HSP70B peptidet indeholder 22 nitrogenatomer, de CGE1 Peptide 19, svarende til en masse skift af 7,33 og 6,33 m / z hhv. B repræsentant massespektre fra den reciprokke forsøg (14 N + ATP / 15 N-ATP). Fuld MS-spektre af de samme 14 N og 15 N mærkede peptider, her svarende til + ATP og-ATP stater, henholdsvis fra HSP70B og co-immunopræcipiterede CGE1 vises. Klik her for at se større figur .