1. Chirurgie stéréotaxique Toutes les procédures de suivre le Guide du NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation. L'utilisation d'un appareil stéréotaxique, bien géré rats Long-Evans, anesthésiés avec de l'isoflurane, sont implantés avec une canule de calibre 21 (pour plus tard microdilaysis sonde d'insertion) (Plastics One, Roanoke, Virginie) au-dessus de la région du cerveau d'intérêt, et une attache boulon est intégré dans l'étape de tête (utilisé pour soutenir l'équipement de microdialyse). Surveiller attentivement les rats pendant et après la chirurgie. Assurez-vous que tous les animaux reçoivent au moins une semaine de soins post-chirurgicaux et de récupération et sont en bonne santé avant de commencer les procédures suivantes. Une vidéo JoVE de la méthode de chirurgie stéréotaxique est disponible 1. 2. Formation opérant Après une semaine de récupération post-chirurgicale, les animaux sont formés pour presse à levier pour le saccharose 10% solution dans une chambre Med Associates, opérant (MedAssociates, Inc, le Vermont USA) équipé d'un lickometer, levier escamotable, système d'aspiration et le tube (comme décrit précédemment dans Howard et al., 2009). 2 Logiciel de MedAssociates est utilisé pour concevoir les programmes opérant (MedAssociates, Inc, Vermont, Etats-Unis). Une fois formés pour répondre au saccharose, commencez rats sur un programme de formation approprié au cours de laquelle l'éthanol est ajouté progressivement à la solution plus beuveries multiples. Par exemple, notre laboratoire utilise actuellement un programme de formation de 8 jours où l'éthanol est disparu dans la solution aboutissant à un éthanol à 10% / 10% solution buvable saccharose. Les animaux témoins ne reçoivent que 10% de saccharose ou pas de solution buvable. Le type spécifique de calendrier opérant à utiliser peut varier considérablement mais les procédures générales décrites ci-dessous pour l'échantillonnage de microdialyse peut encore être effectuée 3. 3. Pré-microdialyse Procédures: Tethering <ol> La nuit avant la deuxième session de la dernière formation (dans notre exemple, il s'agit de la séance d'entraînement 7 e), les animaux sont habitués à la source d'attache, qui se fixe sur le boulon d'ancrage de leur stade de tête. Le ressort se fixe à la tête d'injection et de microdialyse contre le bras de levier équilibre, qui est suspendu à côté de la cage d'un support annulaire et pinces de telle sorte que l'animal peut se déplacer librement à l'intérieur de sa cage. Animaux captifs passent la nuit dans la salle opérante, dans leur cage avec de la nourriture ad libitum et de l'eau, de les habituer à l'attache set-up. Le lendemain, le rat a terminé son programme opérant avec l'attache en place, pour habituer l'animal à la sensation de l'attache dans l'exercice de ses tâches comportementales. Monter le dispositif d'attache à la paroi de la chambre opérant dans la partie supérieure pour permettre à la suspension de l'attache et pivotant au-dessus du centre de la voûte de la chambre opérant. Tout cela est placé à l'intérieur de la chambre d'insonorisation. After la session, retournez chez le rat dans sa cage à la maison dans la salle opérant dans l'attente insertion de la sonde microdiaysis. 4. Pré-microdialyse Procédures: La sonde de microdialyse est insérée la veille de l'expérience de microdialyse, après le rat a complété une formation comportementale pour la journée La veille de l'expérience de microdialyse, après le rat a terminé une session opérant tout captif, le rat anesthésié à l'isoflurane et retirez l'obturateur de la canule guide. Lentement (pendant ~ 5 min) insérer une sonde de microdialyse, perfusé avec liquide céphalorachidien artificiel (ACSF), à travers la canule de guidage crânienne dans la région du cerveau d'intérêt. Nous utilisons en laboratoire construits sondes de microdialyse et procédures s'inspirent de Doyon et al., 2003 et Pettit et de la Justice, 1991. 3, 4 Utiliser le dispositif d'attache pour suspendre précédemment l'entrée et de sortie de la sonde au-dessus de l'animal. Tournez la pagedébit robe jusqu'à 0,2 l / min. Encore une fois, le rat passe la nuit dans la salle opérante. 5. Procédures de microdialyse: Collection des échantillons au cours de la session d'auto-administration avec des phases de l'appétit et consommatoire séparés Au moins 2 heures avant l'expérience commence, montez la sonde à son débit de travail. Nous utilisons soit 1,0 ou 2,0 l / min en fonction de la région du cerveau. Vérifiez que le débit de la sonde est cohérente, et au moins 90% du débit réglé à l'aide d'une seringue Hamilton pour mesurer le volume au fil du temps. Échantillons de dialyse (5 ou 7 min) sont prises avant, pendant et après la session opérant. L'intervalle d'échantillonnage dépend de la région du cerveau, les neurotransmetteurs en cours d'analyse, le dialysat concentration de l'analyte, et la sensibilité du matériel de chimie analytique utilisée pour l'analyse. Les phases de comportement sont les suivants: Niveau de référence: Au début de l'expérience,prélever des échantillons de dialyse dans la cage de l'animal à la maison (4 échantillons). Transfert: Après la collecte d'échantillons à domicile cage de base, de transférer le rat à la chambre opérant. Transfert du rat captif nécessite un soin extrême afin de s'assurer que la ligne de transfert de microdialyse fluide ne devient pas emmêlés et que le rat reste calme. Immédiatement après le transfert, activer le programme que vous changez opérant à partir de l'échantillon de référence / transfert à l'échantillon d'attente premier. Attendre: Continuer de recueillir des échantillons comme le rat attend le levier d'étendre dans la chambre (échantillons 3-4 en fonction de la région du cerveau). Boire: Après le levier est présentée et défendue, un flacon de solution potable (10% d'éthanol sucrose/10% ou de 10% de saccharose) est mis à la disposition du rat pendant environ 20 minutes (échantillons 3-4). Post-boisson: Après une période de boisson, les bouteilles se rétracte, mais le rat reste in la chambre opérant pendant environ 20 minutes (échantillons 3-4). 6. Procédures de microdialyse: Préparation de l'échantillon pour l'analyse de microdialyse éthanol Deux échantillons avant animaux s'auto-administrer la solution d'éthanol, et tous les échantillons après, sont évaluées pour la concentration en éthanol. Pipeter une aliquote soit 1 ou 2 ul de l'échantillon d'intérêt dans un flacon en verre de 2 ml. Scellez ensuite le flacon avec un septum étanche à l'air (9 mm Rouge Poly Vis d'assemblage, PTFE / Sil Septa, Agilent Technologies). Le volume de l'aliquote d'analyse éthanol (1 ou 2 pi) dépend du volume total de l'échantillon, et le volume d'échantillon requis pour toutes les analyses complémentaires. Si les échantillons seront utilisés pour une analyse ultérieure neurochimique, conserver l'échantillon de manière appropriée suivant l'ajout de l'aliquote pour la quantification d'éthanol. Par exemple, notre laboratoire analyse les échantillons pour la dopamine. Pour ce faire, placer les échantillons sur la glace sèche pendant l'expériencepuis, stocker les échantillons à -80 ° C après l'expérience. Nous utilisons 2 aliquotes pour l'analyse d'un échantillon d'éthanol 5 min recueillies à l'aide d'un débit de 2,0 l / min pour les sondes placées dans le noyau accumbens. Cela permet au moins 7 pl restant pour une analyse ultérieure de la dopamine par chromatographie en phase liquide à haute performance avec détection électrochimique. Pour les échantillons prélevés dans le cortex préfrontal, qui a beaucoup plus faibles concentrations de dopamine extracellulaire, nous utilisons une aliquote de 1 ul d'éthanol pour l'analyse proviennent d'un échantillon de 7 min en utilisant un débit de 1,0 l / min. 7. Post-microdialyse procédures Après la conclusion de l'expérience de microdialyse, anesthésier le rat et retirer la sonde. Remplacez l'obturateur si l'animal n'est pas immédiatement euthanasié. Recueillir le cerveau dans les trois jours de l'expérience. Dans le cas contraire, la visualisation des voies sonde peut ne pas être possible. Le cerveau doit être retiré iconformément aux protocoles approuvés n utilisation des animaux. Nous utilisons du pentobarbital de sodium (150 mg / kg, ip) surdose, suivie de la perfusion cardiaque avec une solution saline, puis dans une solution saline de formol. Cerveau immerger dans une solution de formol salin pendant au moins 12 heures avant la coupe. Coronaire section du cerveau en 100 tranches um. Stain tranches au crésyl violet, et d'examiner le placement correcte de la sonde. 5, 6 8. L'analyse des échantillons de concentration en éthanol Les échantillons prélevés ainsi que des normes externes (de 0,3125 à 20 mM d'éthanol) sont exécutés sur notre chromatographe en phase gazeuse avec détection à ionisation de flamme. Ce système est constitué d'un chromatographe en phase gazeuse Varian CP 3800 avec un détecteur à ionisation de flamme, un spectromètre Bruker (Varian) 8400 autosampler espace de tête chauffé à 50 ° C, et une colonne capillaire HP Innowax (30 mx 0,53 mm x 1,0 um d'épaisseur de film), avec l'hélium en tant que phase mobile. Les chromatogrammes sont enregistrés et analysés avec Chromatography logiciel tel que le logiciel Varian Star Workstation chromatographie qui sera spécifiquement abordée ici. Pour préparer le système pour l'analyse de l'éthanol, faire chauffer la plaque échantillonneur automatique en utilisant un bain de recirculation d'eau, et ouvrez les deux réservoirs de gaz supplémentaires (de l'air et de l'hydrogène; hélium est toujours laissé en marche pour préserver la colonne de cire). Noter les pressions de réservoir de gaz, ainsi que le nombre d'échantillons que vous comptez exécuter afin que vous puissiez tenir le compte du nombre de fois où la fibre et de la cloison ont été utilisés afin qu'ils puissent être modifiés si nécessaire (fibre-500 injections; septum crevaisons -100). Initier la méthode de démarrage, qui prépare le système pour exécuter échantillons (paramètres du programme dans le Tableau 2). Attendez que le système de signaler qu'il est "Prêt". Initier un 20-min "brûler", qui prépare la fibre pour l'analyse d'échantillons en le soumettant à une température élevée pour désorber tout contaminant qu'il a absorbé au repos. Les normes sont faites pardilution de 238 ul d'éthanol à 95% avec de l'eau jusqu'à un volume final de 100 ml en utilisant une fiole jaugée dans une hotte. Cela crée une solution d'éthanol à 40 mM. Nous utilisons une dilution 1:1 de série pour créer 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 normes mM. Pour chaque concentration de l'étalon, utiliser le même volume aliquote qui seront prises à partir des échantillons de dialyse. Pipeter l'aliquote dans un flacon en verre de 2 ml, puis sceller le flacon avec un septum étanche à l'air. Tous les échantillons d'éthanol sont chauffés dans le passeur d'échantillons jusqu'à ce que l'aliquote de liquide entière a été vaporisé. Nous chauffons nos échantillons pendant environ 30 min. Cette section décrit le logiciel Workstation étoiles que nous utilisons avec notre chromatographe en phase gazeuse. D'autres logiciels peuvent être utilisés mais la description ci-dessous peuvent ne pas être applicables. Pour exécuter échantillons, de créer une liste d'exemples de noter que l'échantillon est l'emplacement dans lequel passeur d'échantillons, et combien de fois l'échantillon doit être ponctionnée. Assurez-vous de passer les fichiers de données à votre pli sélectionnéer. Ensuite, sélectionnez la méthode de choix pour vos échantillons, et de commencer la course. Nous utilisons les paramètres de fonctionnement indiquées dans le tableau 2. Notre programme d'éthanol absorbe l'échantillon de dialysat pendant 3 min et désorbe dans le flux d'hélium, qui se jette dans la colonne de cire, pendant 1 min. Toutefois, les programmes peuvent être écrits pour répondre à vos besoins spécifiques. Les composants de l'échantillon séparés dans la colonne de cire, puis passer par le détecteur à ionisation de flamme où les composés contenant du carbone, tels que les ions d'éthanol, la combustion et la libération. Il en résulte un flux d'électrons à partir de l'augmentation du détecteur anode à la cathode de créer un courant, qui est converti en tension et enregistrées, conduisant à l'une des chromatogrammes comme indiqué ci-dessous (figure 1). La variation de tension est proportionnelle à la quantité de carbone qui passe à travers le détecteur à travers temps7 Après que le système a terminé de s'exécuter les échantillons que vous aurez besoin de vérifier l'intégration de chaque pic. Pour le logiciel Workstation Star,cliquez sur l'icône pic bleu dans la barre d'outils. Cliquez sur la couleur de chaque pic et faites glisser les flèches pour régler le niveau de référence. Réinsérer chaque pic avant de passer au prochain groupe de crêtes. Le logiciel d'analyse de pointe peut être n'importe quel logiciel de chromatographie général. Pour le logiciel Workstation Star, cliquez sur l'icône de rapport de lot dans votre barre d'outils. Faites glisser chaque échantillon à partir de votre dossier spécifié pour le journal des lots pour imprimer les exemples de rapports. Logiciel de reporting peuvent être personnalisées avec la plupart des systèmes de logiciel de chromatographie. Les rapports peuvent être programmés pour afficher les informations de votre choix. Nous utilisons actuellement la hauteur du pic, mais les rapports peuvent également être programmé pour utiliser la surface du pic. Pour arrêter le système, déclenche la méthode d'arrêt (paramètres indiqués dans le tableau 2), éteignez le bain d'eau, et de fermer les réservoirs d'hydrogène et d'air lorsque la température du four colonne atteint 30 ° C. 9. Les données d'éthanol Tracer la hauteur du pic commeen fonction de chaque concentration connue éthanol standard externe (figure 2A). Utiliser la fonction linéaire proposée par ces points à calculer la concentration d'éthanol à partir de la hauteur de pic proposée par chaque échantillon de dialysat. En traçant la concentration d'éthanol dans le dialysat au fil du temps, nous pouvons voir le schéma des niveaux d'éthanol dans la région du cerveau d'intérêt lors de notre session de comportement. Exemple de données, indiquées ci-dessous (figure 2B), sont représentés par la concentration d'éthanol dans le dialysat à travers le temps au cours de la session d'auto-administration. 10. Entretien général: La fibre doit être changé toutes les 500 ponctions, et le septum sur 100 ponctions Pour changer la fibre Sur le chromatographe en phase gazeuse touche Menu pad appuyez sur, sélectionnez 8400, appuyez sur Entrée, sélectionnez seringue changement, appuyez sur Entrée. Le passeur se positionnera à permettre à la fibre (fibre SPME Assemblée, 75 um Carboxen-PDMS, Supelco analytique, BellefoNTE, PA) à enlever. Ouvrez la porte recouvrant la fibre. Dévisser l'écrou de blocage, et déplacer le verrou pour permettre à l'ensemble de fibres à éliminer. Prenez l'assemblage de fibres sur. Dévissez l'écrou qui maintient la fibre dans l'assemblée, puis dévisser la fibre. Remplacer la fibre usée par une nouvelle, et remonter l'ensemble de fibres. Remplacer l'ensemble de l'échantillonneur automatique, re-verrouillage et visser l'assemblage en place. Lorsque vous avez terminé, appuyez sur "changer faite" sur le clavier, et le passeur d'échantillons sera lui-même prêt à l'emploi. Pour changer le septum Tout d'abord, dévisser le capuchon recouvrant la cloison (Salut-Temp 0,450 Diam. Générique conditionné Septa, Varian) puis retirez la cloison ancienne. Le siège du septum nouveau vers le bas dans le raccord. Revisser le bouchon et le serrer avec la clé. Ensuite, utiliser une aiguille d'injection pour percer le septum de sorte que la fibre se rompt pas la première fois que le septum est percé. </ol> 11. Les résultats représentatifs La figure 1 montre les chromatogrammes exemple pour trois concentrations d'éthanol et normes pour un échantillon de dialysat rat recueillies à la fin de l'auto-administration d'éthanol session. Des pics d'éthanol doit être relativement symétrique, ont des temps de rétention constants, et un signal de> 10 bruit. Le non-respect de ces critères signifie que votre système nécessite un entretien. Chromatographie normes de qualité et correctement préparés produire une courbe standard linéaire (R2 ≥ 0,99; figure 2A) qui est utilisée pour calculer la concentration en éthanol d'échantillons de dialysat recueilli à partir d'éthanol auto-administrer des animaux au cours de leur session de l'auto-administration (figure 2B) . Figure chromatogrammes Exemple 1.. Un microlitre de la norme d'éthanol ou de l'échantillon de dialysat a été chargé dans un c gazhromatograph flacon et analysés comme décrit dans le texte. A) Superposition des pics générés à partir de 2,5, 5,0 et 10 mM d'éthanol normes. B) de pointe généré à partir d'un échantillon de dialysat à partir d'un rat qui a auto-administré éthanol. Figure 2. Résultats graphiques de l'expérience exemple de la figure 1. A) courbe standard éthanol. Évolution dans le temps B) de la concentration d'éthanol dialysat à travers une auto-administration d'éthanol session. Matériel Paramètre Start-up de réglage Exécution de réglage Mise au repos 8400 Bruker (Varian) Autosampler Mode d'injection SPME SPME n / a <tr> Profondeur de pénétration de solvant 0% 20% n / a Profondeur de pénétration échantillon 20% 20% n / a Temps d'absorption 0,01 min 3 min n / a Temps de désorption 19 min 1 min n / a Nettoyez la source du mode solvant Je Je n / a Propre mode d'adsorption et de désorption du temps 0,01 min 0,01 min n / a Bain d'eau (chauffe échantillonneur automatique) * 50 ° C 50 ° C De Varian CP-3800 chromatographe en phase gazeuse Four injecteur </td> Puissance du four Sur Sur Sur La température du four 250 ° C 220 ° C 30 ° C Four colonne Temps de stabilisation 0,10 min 0,10 min 0.10min Température 65 ° C 65 ° C 30 ° C Colonne Débit de la phase mobile 8,5 ml / min 8,5 ml / min n / a Pression de la colonne ~ 6 psi ~ 6 psi ≥ 0,1 psi Détecteur FID Puissance du four Sur Sur Sur Température 220 ° C 220 ° C 120 ° C </tr> Électronique Sur Sur De Constante de temps Rapide Rapide Rapide Gamme 11 11 11 Autozéro Oui Oui Oui Tableau 2. Chromatographe en phase gazeuse avec des paramètres d'ionisation de flamme du système de détection. Ce tableau indique les paramètres pour les trois programmes utilisés pour préparer les start-up (réglages), course (course paramètres) et maintenir le système lorsqu'il n'est pas utilisé (les réglages de repos).