1. Stereotaksiske kirurgi Alle prosedyrer følger NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité. Ved hjelp av en stereotaksisk anordning, godt håndtert Long-Evans rotter bedøvet med isofluran, er implantert med en 21-gauge kanyle (for senere microdilaysis probe innsetting) (Plast One, Roanoke, VA) ovenfor hjernen regionen av interesse, og et tjore bolt er bygget inn i hodet scenen (brukt til å støtte mikrodialyse utstyr). Overvåke rotter nøye under og etter operasjonen. Sørg for at alle dyr får minst én uke med post-kirurgisk behandling og gjenvinning, og er sunt før du begynner følgende prosedyrer. En Jove video av stereotaksiske kirurgi metoden er tilgjengelig. En 2. Operant trening Etter en uke med post-kirurgiske utvinning, er dyr opplært til spaken trykk for 10% sukrose solution i en Med Associates operant kammer (MedAssociates, Inc., Vermont, USA) utstyrt med en lickometer, uttrekkbar spaken, og sipper tube (som tidligere beskrevet i Howard et al., 2009). 2 Programvare fra MedAssociates brukes til å designe alle operante programmer (MedAssociates, Inc., Vermont, USA). Gang opplært til å svare for sukrose, begynner rotter på en passende KURSKALENDER der etanol blir gradvis tilsatt til løsningen over flere drikking økter. For eksempel bruker vårt lab øyeblikket en 8-dagers KURSKALENDER der etanol er falmet til løsningen kulminerer i en 10% etanol / 10% sukrose drikking løsning. Kontrolldyr bare motta 10% sukrose eller ingen drikking løsning. Den spesifikke type operant tidsplan skal brukes kan variere mye, men den generelle prosedyrer som er beskrevet nedenfor for mikrodialyse prøvetaking kan fortsatt utføres. 3 3. Pre-mikrodialyse Prosedyrer: tethering <ol> Natten før den nest siste treningsøkt (i vårt eksempel er dette det 7. treningsøkt), er dyr habituated til tether våren, som festes til tjore bolt på hodet scenen. Fjæren festes til mikrodialyse svivel og motvekt vektarm, som er suspendert ved buret med en ring stativ og klemmene slik at dyret kan bevege seg fritt innenfor buret sitt. Tethered dyr tilbringe natten i operant rom, i deres hjem bur med ad libitum mat og vann, for å tilvenne dem til tethering set-up. Neste dag, fullfører rotte sin operant program med tjore på plass, for å tilvenne dyret til følelsen av fortøyningen mens du utfører sine atferdsmessige oppgaver. Monter tethering apparatet til veggen av operant kammeret nær toppen for å tillate suspensjon av fortøyningen og svivel ovenfor sentrum av taket av operant kammer. Alt dette er plassert inne i lyddempende kammeret. After økt, returnere rotta til sitt hjem bur i operant rom å avvente microdiaysis probe innsetting. 4. Pre-mikrodialyse Prosedyrer: The mikrodialyse proben er satt dagen før mikrodialyse eksperimentet etter rotte har fullført atferdstrening for dagen Dagen før mikrodialyse eksperimentet, har etter rotte gjennomført en operant økt mens tethered, bedøve rotta med isofluran og fjerne obturatoren fra guiden kanylen. Langsomt (over ~ 5 min) settes det mikrodialyse probe, perfused med kunstig cerebral spinalvæske (ACSF), gjennom den kraniale guiden kanylen inn i hjernen regionen av interesse. Vi bruker laboratorie-bygget prober og mikrodialyse prosedyrer modellert etter Doyon et al., 2003 og Pettit og Justice, 1991. 3, 4 Bruke den tidligere diskuterte tethering apparat å suspendere innløp-og utløp linjer av sonden over dyret. Slå pkappen strømningshastighet ned til 0,2 pl / min. Igjen, tilbringer rotte natten i operant rommet. 5. Mikrodialyse Prosedyrer: Samling av prøver under selvadministrering økt med appetitive og consummatory faser skilt Minst 2 time før forsøket begynner, skru opp sonden til arbeidstemperatur strømningshastighet. Vi bruker enten 1,0 eller 2,0 pl / min avhengig hjernen regionen. Kontroller at sonden strømningshastighet er konsistent, og minst 90% av den innstilte strømningshastighet ved hjelp av en Hamilton sprøyte å måle volum over tid. Dialyse prøver (5 eller 7 minutter) er tatt før, under og etter den operant økt. Samplingsintervallet avhenger hjernen regionen, idet nevrotransmitter analysert, dialysatet konsentrasjonen av analytten, og følsomheten for den analytiske kjemi utstyr som skal benyttes for analysen. De atferdsmessige faser er som følger: Baseline: Ved begynnelsen av forsøket,samle dialyse prøver i dyrets home bur (4 prøver). Transfer: Etter samling av hjemme bur baseline prøvene, overføre rotte til operant kammer. Overføring av tethered rotte krever ekstrem forsiktighet for å sikre at mikrodialyse væskeoverføring linje ikke blir flokete, og at rotta er fortsatt rolig. Umiddelbart etter overdragelsen, aktivere operant program som du endrer fra grunnlinjen / overføring prøven til første ventetiden prøven. Vent: Fortsett å samle inn prøver som Rotta venter på spaken for å strekke seg inn i kammeret (3-4 prøver avhengig hjernen regionen). Drikke: Når spaken er presentert og trykket inn, en flaske drikke løsning (10% sucrose/10% etanol eller 10% sukrose) gjort tilgjengelig for rotte for rundt 20 minutter (3-4 prøver). Post-drink: Etter drikke periode, forblir flasken trekkes, men rotte in operant kammer for rundt 20 minutter (3-4 prøver). 6. Mikrodialyse Prosedyrer: Utarbeidelse av mikrodialyse prøve for etanol analyse To prøver før dyr selvadministrere etanol løsning, og alle prøvene etter, blir vurdert for etanolkonsentrasjonen. Pipetten enten 1 eller 2 pl alikvot fra prøven av interesse inn en 2 ml hetteglass. Deretter forsegle flasken med en lufttett septum (9 mm Rød Poly skrukork, PTFE / Sil Septa, Agilent Technologies). Volumet av etanolen analysen delmengde (1 eller 2 pl) avhengig av totalt prøvevolum, og prøven volum som kreves ytterligere analyser. Hvis prøvene skal brukes for senere nevrokjemiske analyse, lagre prøven hensiktsmessig etter pipettering alikvoten for etanol kvantifisering. For eksempel, analyserer lab prøvene for dopamin. For å oppnå dette, plasserer prøvene på tørris under eksperimentetog deretter, lagre prøvene ved -80 ° C etter at eksperimentet. Vi bruker 2 ul aliquoter for etanol analyse av en 5 min prøve samles ved hjelp av en strømningshastighet på 2,0 pl / min for sonder plassert i nucleus accumbens. Dette tillater minst 7 pl gjenværende for senere analyse av dopamin ved høyytelse væskekromatografi med elektrokjemisk deteksjon. For prøver tatt fra den prefrontale cortex, som har mye lavere ekstracellulære dopamin konsentrasjoner, bruker vi en 1 pl alikvot for etanol analyse tatt fra en 7-min prøven ved hjelp av en strømningshastighet på 1,0 pl / min. 7. Post-mikrodialyse prosedyrer Etter avslutningen av mikrodialyse eksperimentet, anesthetize rotte og fjern proben. Erstatt obturatoren hvis dyret ikke umiddelbart avlives. Samle hjernen innen tre dager etter eksperimentet. Ellers kan visualisering av sonden tarmkanalen ikke være mulig. Hjernen bør fjernes in samsvar med godkjente dyr bruk protokoller. Vi bruker natriumpentobarbital (150 mg / kg, ip) overdose, etterfulgt av hjerte perfusjon med saltløsning og deretter formalin i saltvann. Senk hjernen i en formalin-saltvannsoppløsning i minst 12 timer før snitting. Coronally delen hjernen til 100 mikrometer skiver. Stain skiver med Cresyl fiolett, og undersøke for riktig probe plassering. 5, 6 8. Analyse av prøver for etanolkonsentrasjonen De innsamlede prøvene samt eksterne standarder (0,3125 til 20 mM etanol) kjøres på vår gasskromatograf med flamme ionisering detection system. Dette systemet består av en Varian CP 3800 gasskromatograf med en flamme ionisering detektor, et Bruker (Varian) 8400 headspace autosampler oppvarmet til 50 ° C, og en HP Innowax kapillarkolonne (30 mx 0,53 mm x 1,0 um film tykk), med helium som mobil fase. Kromatogrammer blir registrert og analysert med Chromatography programvare som Varian stjerne Kromatografi Workstation programvare som vil bli spesielt diskutert her. For å klargjøre systemet for etanol analyse, oppvarme autosampler plate ved hjelp av en resirkulerende vannbad, og åpne de to ekstra gasstankene (luft og hydrogen; helium er alltid igjen kjører å bevare voks kolonne). Spille gasstanken press, samt antall prøver du har tenkt å kjøre, slik at du kan holde telling av antall ganger fiber og septum har blitt brukt slik at de kan bli endret når det passer (fiber-500 injeksjoner; septum -100 punkteringer). Initiere oppstart metode, som klargjør systemet til å kjøre prøver (programparametere i tabell 2). Vent til systemet for å rapportere at det er "klar". Initiere en 20-min "brenne", som forbereder fiber for prøveanalyse ved å underkaste den en høy temperatur for å desorbere enhver forurenser det har absorbert mens resten. Standarder er laget avfortynne 238 ul 95% etanol med vann til et endelig volum på 100 ml ved hjelp av en volumetrisk kolbe i avtrekkskap. Dette skaper en 40 mM etanol løsning. Vi bruker en 1:1 seriefortynning å opprette 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 mM standarder. For hver konsentrasjon av standard, bruker du samme volum delmengde som vil bli tatt fra dialyse prøvene. Pipetter alikvoten i en 2 ml hetteglass, og deretter forsegle hetteglasset med en lufttett septum. Alle etanol prøver oppvarmet i autosampler inntil hele væsken delmengde er fordampet. Vi varmer våre prøver i ca 30 min. Denne delen beskriver Star Workstation-programvaren som vi bruker med våre gasskromatograf. Annen programvare kan brukes, men beskrivelsen nedenfor, kan ikke være aktuelt. Hvis du vil kjøre prøver, lage en liste med merke seg hvilken prøve er der autosampler sporet, og hvor mange ganger prøven skal punkteres. Pass på å rute datafiler til valgt foldeh. Deretter velger du metoden for valg for dine prøver, og begynne kjøringen. Vi bruker de kjører parametere nevnt i Tabell 2. Vårt dialysatet etanol programmet absorberer prøven i 3 min og desorbs inn helium strømmen, som strømmer inn i voks kolonnen, i 1 min. Men, kan programmer bli skrevet for å imøtekomme dine spesifikke behov. De prøvekomponenter separate i voks-kolonnen, og deretter gå gjennom flammen ioniserings detektoren der karbonholdige forbindelser, slik som etanol, forbrenn og slipp ioner. Dette resulterer i økt elektron flyte fra detektorens anoden til katoden skape en strøm, som blir omdannet til spenning og fart som resulterer i kromatogrammer som vist nedenfor (figur 1). Endringen i spenningen er proporsjonal til mengden av karbon som passerer gjennom detektoren tvers time.7 Etter at systemet er ferdig prøvene må du sjekke integrering av hver topp. For Star Workstation,Klikk på den blå topp ikonet på verktøylinjen. Klikk på hver topp farge og dra pilene for å justere den opprinnelige planen. Reintegrere hver topp før du flytter til neste gruppe av topper. Toppen analyse programvare kan være noen generell kromatografi programvare. For Star Workstation, klikk på batch rapporten ikonet i verktøylinjen. Dra hver prøve fra angitte mappen til batch rapporten til å skrive ut eksempelrapportene. Rapportering programvare kan tilpasses med de vanligste kromatografi programvaresystemer. Rapportene kan være programmerte til å vise informasjonen du ønsker. For tiden bruker topphøyde, men rapportene kan også programmerte til bruke topparealet. Å slå av systemet, starte shut-down metoden (parametre nevnt i tabell 2), slå av vannbadet, og lukk hydrogen og luft tanker når kolonnen ovnen temperaturen når 30 ° C. 9. Etanol data Plotte topphøyden somen funksjon av hver kjent ekstern standard etanolkonsentrasjonen (figur 2A). Bruke den lineære funksjonen gitt av disse punkter for å beregne etanolkonsentrasjonen fra topphøyden gitt av hver dialysatet prøve. Ved å plotte konsentrasjonen av etanol i dialysatet over tid, kan vi se et mønster av etanol nivåer i hjernen regionen av interesse i løpet av vår atferdsmessige sesjon. Eksempeldata, vist nedenfor (figur 2B), er representert som konsentrasjonen av etanol i dialysatet over tid under selvadministrering sesjon. 10. Generelt vedlikehold: The fiber bør endres hver 500 punkteringer, og septum hver 100 punkteringer Å endre fiber På gasskromatograf tastaturet trykker Menu, velger 8400, trykk enter, velg endre sprøyte, trykk enter. Den autosampler vil posisjonere seg slik at fiber (SPME Fiber Assembly, 75 mikrometer Carboxen-PDMS, Supelco Analytisk, BellefoNTE, PA) som skal fjernes. Åpne døren dekker fiberen. Skru låsemutteren, og flytte låsen for å tillate fiberen montering for å bli fjernet. Ta fiber forsiktig ut. Skru av mutteren som holder fiber i forsamlingen, og deretter skrur fiber. Erstatt den gamle fiber med en ny, og montere fiber forsamlingen. Erstatte forsamlingen i autosampler, re-låsing og skru montering på plass. Når du er ferdig, trykker du på "endre gjort" på tastaturet, og autosampler vil klare seg selv i bruk. Hvis du vil endre septum Først, skru av lokket som dekker septum (Hi-Temp 0.450 Dia. Generic Conditioned Septa, Varian) og deretter fjerne den gamle septum. Seat den nye septum ned i beslaget. Re-skru av korken og skru det fast med skiftenøkkelen. Deretter bruker en injeksjonsnål for å punktere septum slik at fiberen ikke vil bryte den første gangen septum er punktert. </ol> 11. Representant Resultater Figur 1 viser eksempel kromatogrammer for tre konsentrasjoner av etanol standarder og for en rotte dialysatet prøve samles ved slutten av etanolen selvadministrering sesjon. Etanol topper bør være relativt symmetrisk, har konsekvent retensjonstider, og et signal til støy-forhold> 10. Unnlatelse av å oppfylle disse kriteriene betyr at systemet krever vedlikehold. Kvalitet kromatografi og fullstendig forberedt standarder produsere en lineær standardkurve (R2 ≥ 0,99, Fig. 2A) som brukes til å beregne konsentrasjonen av etanol dialysatet prøver samlet fra etanol selv administrere dyr i løpet av deres selvadministrering økt (figur 2B) . Figur 1. Eksempel kromatogrammer. Ett mikroliter etanol standard eller dialysatet prøve ble lastet inn i en gass chromatograph hetteglass og analysert som beskrevet i teksten. A) Overlay av topper generert fra 2,5, 5,0 og 10 mM etanol standarder. B) Peak generert fra en dialysatet prøve fra en rotte som har selvadministrert etanol. Figur 2. Grafiske resultater fra eksempel eksperiment vist i figur 1. A) Etanol standardkurve. B) Tidsforløpet for dialysatet etanolkonsentrasjonen over en etanol selvadministrering sesjon. Hardware Parameter Oppstart innstilling Kjører innstilling Resting innstilling 8400 Bruker (Varian) Autosampler Injeksjon modus Spme Spme n / a <tr> Løsemiddel inntrengningsdybde 0% 20% n / a Eksempel stikkedybde 20% 20% n / a Absorpsjon tid 0,01 min 3 min n / a Desorpsjon tid 19 min 1 min n / a Rengjør modus løsemiddel kilde Jeg Jeg n / a Clean-modus adsorpsjon og desorpsjon tid 0,01 min 0,01 min n / a Vannbad (varmer autosampler) * 50 ° C 50 ° C Av CP-3800 Varian Gas Chromatograph Injektor Oven </td> Ovnen makt På På På Ovnstemperaturen 250 ° C 220 ° C 30 ° C Kolonne Oven Stabilisering tid 0,10 min 0,10 min 0.10min Temperatur 65 ° C 65 ° C 30 ° C Kolonne Mobil fase flow rate 8,5 ml / min 8,5 ml / min n / a Kolonne Pressure ~ 6 psi ~ 6 psi ≥ 0,1 psi FID detektor Ovnen makt På På På Temperatur 220 ° C 220 ° C 120 ° C </tr> Elektronikk På På Av Tidskonstant Rask Rask Rask Range 11 11 11 Autozero Ja Ja Ja Tabell 2. Gasskromatograf med flamme ionization Detection System parametere. Denne tabellen viser parametrene for de tre programmene som brukes til å forberede (oppstart innstillinger), kjøre (kjører innstillinger) og vedlikeholde systemet mens ikke er i bruk (hvile innstillinger).