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Neuroscience

इथेनॉल के गैस क्रोमैटोग्राफी द्वारा operant इथेनॉल आत्म - प्रशासन और इथेनॉल के दृढ़ संकल्प के दौरान microdialysis

doi: 10.3791/4142 Published: September 5, 2012

Summary

Operant इथेनॉल के दौरान चूहों के दिमाग में इथेनॉल एकाग्रता के समय पाठ्यक्रम निर्धारित करने के लिए एक विधि आत्म - प्रशासन में वर्णित है. लौ ionization का पता लगाने के साथ गैस क्रोमैटोग्राफी dialysate नमूनों में इथेनॉल मात्रा ठहराना करने के लिए प्रयोग किया जाता है, क्योंकि यह छोटी मात्रा है कि उत्पन्न कर रहे हैं के लिए संवेदनशीलता की आवश्यकता है.

Abstract

Operant आत्म - प्रशासन तरीकों सामान्यतः दुरुपयोग इथेनॉल सहित कई दवाओं के व्यवहार और औषधीय प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जाता है. हालांकि, इथेनॉल आमतौर पर मौखिक रूप से दुरुपयोग के कई अन्य दवाओं की तरह नसों के बजाय, आत्म प्रशासित. मौखिक रूप से प्रशासित दवाओं के फार्माकोकाइनेटिक्स नसों के द्वारा प्रशासित दवाओं की तुलना में अधिक जटिल हैं. क्योंकि इथेनॉल के औषधीय और व्यवहार प्रभाव के बीच के रिश्ते को समझने के दौरान और पीने के बाद मस्तिष्क तक पहुंचने इथेनॉल के समय पाठ्यक्रम के ज्ञान की आवश्यकता है, हम लौ ionization पहचान के साथ vivo microdialysis और गैस क्रोमैटोग्राफी में उपयोग करने के लिए समय पर मस्तिष्क dialysate इथेनॉल सांद्रता की निगरानी.

संयुक्त microdialysis व्यवहार प्रयोगों कई तकनीकों का उपयोग शामिल है. में इस लेख, stereotaxic सर्जरी, व्यवहार प्रशिक्षण और microdialysis, जो आत्म - प्रशासन और Neu की एक भीड़ का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैrochemical केन्द्रित hypotheses, केवल वर्णन करने के लिए कैसे वे नमूना संग्रह और dialysate इथेनॉल विश्लेषण के बाद के चरणों के लिए संबंधित शामिल हैं. लौ ionization पता लगाने, जो इथेनॉल के अध्ययन के लिए विशेष है के साथ गैस क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से इथेनॉल एकाग्रता विश्लेषण अपोहित विस्तार से वर्णित है. इन विधियों द्वारा उत्पादित डेटा स्वयं प्रशासन प्रक्रिया के दौरान मस्तिष्क तक पहुंचने इथेनॉल के पैटर्न से पता चलता है, और जब एक ही dialysate नमूनों की neurochemical विश्लेषण के साथ रखा, निष्कर्ष इथेनॉल के औषधीय और व्यवहार प्रभाव के बारे में किए जाने के लिए अनुमति देता है.

Protocol

1. Stereotaxic सर्जरी

  1. सभी प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए NIH गाइड का पालन करें और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है.
  2. एक stereotaxic तंत्र का प्रयोग, चूहों लंबी इवांस, isoflurane साथ anesthetized, एक 21-गेज (बाद microdilaysis जांच प्रविष्टि के लिए) ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र से ऊपर (एक प्लास्टिक, Roanoke, VA) प्रवेशनी साथ प्रत्यारोपित कर रहे हैं, और एक तार को अच्छी तरह से संभाला बोल्ट सिर मंच (microdialysis उपकरण का समर्थन करने के लिए प्रयोग किया जाता है) में बनाया गया है.
  3. चूहों के दौरान और सर्जरी के बाद सावधानी से निगरानी. सुनिश्चित करें कि सभी पशुओं को शल्य चिकित्सा के बाद की देखभाल और वसूली के एक सप्ताह में कम से कम प्राप्त करते हैं और निम्नलिखित प्रक्रियाओं को शुरू करने से पहले स्वस्थ हैं. Stereotaxic सर्जरी विधि का एक जौव वीडियो उपलब्ध है 1.

2. Operant प्रशिक्षण

  1. शल्य चिकित्सा के बाद वसूली के एक सप्ताह के बाद, जानवरों के 10% sucrose solutio के लिए लीवर प्रेस करने के लिए प्रशिक्षित किया जाता हैएक मेड एसोसिएट्स operant चैम्बर (MedAssociates, इंक, वरमोंट, संयुक्त राज्य अमरीका) एक lickometer, वापस लेने योग्य लीवर और एक sipper ट्यूब (जैसा कि पहले हावर्ड एट अल., 2009 में वर्णित है) के साथ outfitted n 2 MedAssociates से सॉफ्टवेयर के लिए सभी डिजाइन किया जाता है operant कार्यक्रमों (MedAssociates, इंक, वरमोंट, संयुक्त राज्य अमेरिका).
  2. एक बार sucrose के लिए जवाब है, एक उचित प्रशिक्षण कार्यक्रम के दौरान जो इथेनॉल धीरे - धीरे कई सत्रों में पीने के समाधान में जोड़ा जाता है पर चूहों शुरू करने के लिए प्रशिक्षित किया.
  3. उदाहरण के लिए, हमारी प्रयोगशाला वर्तमान में एक प्रशिक्षण 8 दिन के समय जहां इथेनॉल समाधान में एक 10% इथेनॉल / 10% sucrose पीने के समाधान में बनी फीका है का उपयोग करता है. नियंत्रण जानवरों केवल 10% sucrose या पीने समाधान प्राप्त करते हैं. चालू करने के लिए इस्तेमाल किया जा अनुसूची के विशिष्ट प्रकार के व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं, लेकिन सामान्य microdialysis नमूना लेने के लिए नीचे वर्णित प्रक्रियाओं अभी भी बाहर किया जा सकता है 3.

3. पूर्व microdialysis प्रक्रिया: Tethering

अंतिम प्रशिक्षण सत्र (हमारे उदाहरण में यह 7 वें प्रशिक्षण सत्र है) के लिए 2 से पहले रात, जानवरों पगहा वसंत, जो उनके सिर मंच पर पगहा बोल्ट के लिए देता है आदी रहे हैं. वसंत microdialysis कुंडा और काउंटर संतुलन लीवर हाथ है, जो पिंजरे में अगले एक अंगूठी स्टैंड और clamps के साथ निलंबित कर दिया गया है तो यह है कि पशु अपने पिंजरे के भीतर आसानी से स्थानांतरित कर सकते हैं करने के लिए देता है. Tethered जानवरों operant कमरे में रात बिताते हैं, उनके यथेच्छ भोजन और पानी के साथ घर पिंजरे में उन्हें tethering आदत डालना सेट अप.
  • अगले दिन, चूहे जगह में पगहा operant कार्यक्रम पूर्ण होता है, जबकि अपने व्यवहार कार्यों का प्रदर्शन पगहा की भावना करने के लिए पशु आदत डालना. शीर्ष के निकट operant कक्ष की दीवार tethering तंत्र माउंट पगहा और operant कक्ष की छत के केंद्र के ऊपर कुंडा के निलंबन की अनुमति. इस सब के सब ध्वनि attenuating कक्ष के भीतर रखा गया है. Afteसत्र r, operant कमरे में घर पिंजरे चूहे वापस microdiaysis जांच प्रविष्टि का इंतजार.
  • 4. पूर्व microdialysis प्रक्रिया: microdialysis की जांच दिन microdialysis प्रयोग से पहले डाला जाता है, के बाद चूहे दिन के लिए व्यवहार प्रशिक्षण पूरा कर लिया है

    1. microdialysis प्रयोग से पहले दिन, चूहे के बाद एक operant सत्र पूरा कर लिया है, सीमित है, जबकि isoflurane साथ चूहे anesthetize और गाइड प्रवेशनी से गवाक्ष हटाने. धीरे धीरे (~ पर 5 मिनट) एक microdialysis जांच, कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी (ACSF) ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र में कपाल गाइड प्रवेशनी के माध्यम से तरल पदार्थ के साथ perfused डालने. हम प्रयोगशाला का निर्माण जांच और microdialysis Doyon एट अल, 2003, और Pettit और न्याय, 1991 के बाद मॉडलिंग की प्रक्रिया का उपयोग 3, 4.
    2. पहले चर्चा की tethering तंत्र का उपयोग करने के लिए और पशु ऊपर जांच के इनलेट आउटलेट लाइनों को निलंबित करने के लिए.
    3. पी मुड़ेंबागे प्रवाह नीचे 0.2 μl / मिनट की दर. एक बार फिर, चूहे operant कमरे में रात बिताती है.

    5. भूख बढ़ाने वाला और consummatory अलग चरणों के साथ आत्म - प्रशासन सत्र के दौरान नमूनों का संग्रह: microdialysis प्रक्रियाएं

    1. कम से कम 2 घंटा पहले प्रयोग शुरू होता है, अपने काम प्रवाह की दर के लिए जांच की बारी. हम 1.0 या 2.0 μl / मिनट मस्तिष्क क्षेत्र के आधार पर उपयोग करें. जाँच करें कि जांच प्रवाह की दर के अनुरूप है, और एक हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग करने के लिए समय के साथ मात्रा को मापने के द्वारा निर्धारित प्रवाह की दर कम से कम 90%.
    2. डायलिसिस नमूने (5 या 7 मिनट) से पहले लिया जाता है, के दौरान, और चालू सत्र के बाद. नमूना अंतराल मस्तिष्क क्षेत्र पर निर्भर करता है, neurotransmitter विश्लेषण किया जा रहा है, analyte की एकाग्रता, और विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान उपकरणों की संवेदनशीलता को विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा अपोहित. व्यवहार चरण इस प्रकार हैं:
      1. आधारभूत: प्रयोग की शुरुआत में,पशु घर पिंजरे (4 नमूने) में डायलिसिस के नमूने एकत्र.
      2. स्थानांतरण: घर पिंजरे आधारभूत नमूनों के संग्रह के बाद, operant चैम्बर के लिए चूहे का हस्तांतरण. सीमित चूहे के स्थानांतरण चरम देखभाल सुनिश्चित करें कि microdialysis तरल हस्तांतरण लाइन नहीं पेचीदा हो जाते हैं, करता है और चूहे शांत रहता है कि बनाने के लिए की आवश्यकता है. स्थानांतरण के तुरंत बाद, operant कार्यक्रम को सक्रिय करने के रूप में आप नमूना / आधारभूत हस्तांतरण से पहले इंतजार नमूना बदलने.
      3. रुको: जारी करने के लिए नमूनों को इकट्ठा करने के रूप में चूहे कक्ष (3-4 मस्तिष्क क्षेत्र के आधार पर नमूने) में विस्तार करने के लिए लीवर के लिए इंतजार कर रहा है.
      4. पी: बाद लीवर प्रस्तुत किया है और दबाया, पीने के समाधान (10% sucrose/10% इथेनॉल या 10% sucrose) की एक बोतल 20 मिनट के आसपास (3-4 नमूने) के लिए चूहे के लिए उपलब्ध कराया जाता है.
      5. पीने के बाद: मैं पीने के बाद की अवधि, बोतल retracts, लेकिन चूहा रहता हैn 20 मिनट के आसपास (3-4 नमूने) के लिए चालू चैम्बर.

    6. Microdialysis प्रक्रियाएं microdialysis नमूना विश्लेषण के लिए इथेनॉल तैयार:

    1. जानवरों से पहले दो नमूने इथेनॉल समाधान, और सभी नमूनों आत्म - प्रशासन के बाद, इथेनॉल एकाग्रता के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं. पिपेट या तो एक 1 या 2 एक 2 मिलीलीटर कांच की शीशी में ब्याज के नमूने से μl अशेष भाजक. फिर एक तंग हवा पट (9 मिमी लाल पाली भाड़ कैप, / PTFE एसआईएल SEPTA, टेक्नोलॉजीज) के साथ शीशी सील. इथेनॉल विश्लेषण अशेष भाजक (1 या 2 μl) की मात्रा कुल नमूना मात्रा, और नमूना किसी भी अतिरिक्त विश्लेषण के लिए आवश्यक मात्रा पर निर्भर करता है.
    2. अगर नमूने के बाद neurochemical विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, के बाद उचित मात्रा का ठहराव के लिए इथेनॉल अशेष भाजक pipetting नमूना संग्रहीत.
    3. उदाहरण के लिए, हमारी प्रयोगशाला dopamine के लिए नमूने का विश्लेषण करती है. इसे पूरा करने के लिए सूखी बर्फ पर प्रयोग के दौरान नमूने जगहऔर फिर, -80 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोग के बाद नमूने की दुकान. हम एक 5 मिनट नमूना एकत्र नाभिक accumbens में रखा जांच के लिए 2.0 μl / मिनट की एक प्रवाह दर का उपयोग इथेनॉल विश्लेषण के लिए 2 μl aliquots का उपयोग करें. यह उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा dopamine के बाद के विश्लेषण के लिए कम से कम 7 विद्युत का पता लगाने के साथ शेष μl की अनुमति देता है.
    4. Prefrontal प्रांतस्था, जो बहुत कम कोशिकी dopamine सांद्रता से लिए गए नमूने के लिए, हम एक 7 मिनट 1.0 μl / मिनट की एक प्रवाह दर का उपयोग कर नमूने से लिया इथेनॉल विश्लेषण के लिए एक 1 μl अशेष भाजक का उपयोग करें.

    7. पोस्ट - microdialysis प्रक्रियाओं

    1. Microdialysis प्रयोग के समापन के बाद, चूहे anesthetize और जांच निकालने. गवाक्ष बदलें अगर पशु तुरंत euthanized नहीं है. प्रयोग के तीन दिनों के भीतर मस्तिष्क ले लीजिए. अन्यथा, जांच पथ के दृश्य के संभव नहीं हो सकता.
    2. मस्तिष्क मैं हटा दिया जाना चाहिएn अनुमोदित पशु उपयोग के प्रोटोकॉल के साथ अनुसार. हम सोडियम pentobarbital जरूरत से ज्यादा (150 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) का उपयोग करें, और फिर खारा में खारा formalin के साथ हृदय छिड़काव द्वारा पीछा. Formalin-सेक्शनिंग से पहले कम से कम 12 घंटे के लिए खारा समाधान में डूब मस्तिष्क.
    3. Coronally अनुभाग 100 सुक्ष्ममापी स्लाइस में मस्तिष्क. में cresyl बैंगनी साथ स्लाइस दाग, और सही जांच प्लेसमेंट के लिए जांच 5, 6.

    8. नमूने इथेनॉल एकाग्रता के लिए विश्लेषण

    1. के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूने एकत्र बाहरी मानकों (0.3125 - 20 मिमी इथेनॉल) हमारे लौ ionization पता लगाने प्रणाली के साथ गैस chromatograph पर चलाए जा रहे हैं. इस प्रणाली Varian सी.पी. 3800 एक लौ ionization डिटेक्टर के साथ गैस chromatograph के शामिल है, एक Bruker (Varian) 8400 headspace autosampler 50 के लिए गरम डिग्री सेल्सियस, और के साथ एक HP Innowax केशिका स्तंभ (30 एमएक्स 0.53 मिमी x 1.0 सुक्ष्ममापी फिल्म मोटी) मोबाइल चरण के रूप में हीलियम.
    2. Chromatograms दर्ज की गई और हैं chromatogr साथ विश्लेषणVarian स्टार क्रोमैटोग्राफी वर्कस्टेशन सॉफ्टवेयर है कि विशेष रूप से यहां चर्चा की जाएगी के रूप में इस तरह के aphy सॉफ्टवेयर.
    3. इथेनॉल के विश्लेषण के लिए सिस्टम को तैयार करने के लिए autosampler प्लेट का उपयोग करते हुए एक recirculating पानी स्नान गर्मी, और दो अतिरिक्त गैस टैंक (हवा और हाइड्रोजन, हीलियम हमेशा मोम स्तंभ की रक्षा करने के लिए चल रहा है छोड़ दिया है) खुला.
    4. पट, गैस टैंक दबाव है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूने तुम इतना चला कि आप बार की संख्या की गिनती रखने के लिए फाइबर और पट तो इस्तेमाल किया गया है कि वे उपयुक्त (जब फाइबर-500 इंजेक्शन बदला जा सकता है का इरादा की संख्या रिकार्ड -100) punctures.
    5. विधि शुरू हुआ, जो नमूने (2 तालिका में कार्यक्रम पैरामीटर) को चलाने के लिए सिस्टम तैयार आरंभ. प्रणाली के लिए प्रतीक्षा की रिपोर्ट है कि यह "तैयार" है.
    6. जबकि बाकी पर एक 20 मिनट "जला," जो यह एक उच्च तापमान को subjecting desorb किसी भी contaminates यह अवशोषित कर लेता है नमूना विश्लेषण के लिए फाइबर तैयार आरंभ.
    7. मानक के द्वारा बनाई गई हैं95% पानी के साथ 100 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा एक रासायनिक धूआं हुड में एक बड़ा फ्लास्क का उपयोग करने के लिए इथेनॉल के 238 μl गिराए. यह एक 40 मिमी इथेनॉल समाधान बनाता है. हम एक 1:1 धारावाहिक 10 20, बनाने के कमजोर पड़ने, 5, 2,5, 1.25, 0.625, .३१२५ मिमी मानकों का उपयोग करें. मानक के प्रत्येक एकाग्रता के लिए, एक ही मात्रा अशेष भाजक है कि डायलिसिस नमूनों से ले जाया जाएगा का उपयोग करें. 2 मिलीलीटर कांच की शीशी में अशेष भाजक विंदुक, और फिर एक हवा तंग पट के साथ शीशी सील.
    8. सभी इथेनॉल नमूनों autosampler में गरम कर रहे हैं, जब तक पूरे तरल अशेष भाजक vaporized किया गया है. हम के बारे में 30 मिनट के लिए हमारे नमूने गर्मी.
    9. इस अनुभाग में स्टार कार्य केंद्र सॉफ्टवेयर कि हम हमारे गैस chromatograph के साथ प्रयोग का वर्णन करता है. अन्य सॉफ्टवेयर इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन नीचे वर्णन लागू नहीं हो सकता.
    10. नमूने चलाने के लिए, एक नमूना देखते हुए जो नमूना है जो autosampler स्लॉट में सूची बनाने के लिए, और नमूना की हवा निकाल दी कितनी बार किया जाना चाहिए. आपके चयनित गुना के लिए डेटा फ़ाइलों मार्ग यकीन है किएर. फिर, अपने नमूनों के लिए पसंद की विधि का चयन करें, और चलाने के लिए शुरू. हम तालिका 2 में विख्यात मापदंडों का उपयोग.
    11. हमारे dialysate इथेनॉल कार्यक्रम 3 मिनट के लिए नमूना अवशोषित और हीलियम धारा है, जो मोम स्तंभ में 1 मिनट के लिए, फ़ीड में desorbs. हालांकि, कार्यक्रमों के लिए अपने विशेष जरूरतों को समायोजित करने के लिए लिखा जा सकता है.
    12. नमूना मोम स्तंभ में अलग - अलग है, और फिर घटक लौ ionization डिटेक्टर के माध्यम से जाना जहां इथेनॉल combust, और रिहाई आयनों के रूप में इस तरह के यौगिकों, कार्बन युक्त. बढ़ा डिटेक्टर anode से एक चालू है, जो वोल्टेज के लिए बदल जाती है और जिसके परिणामस्वरूप नीचे दिखाया गया है (1 चित्रा) एक तरह chromatograms दर्ज बनाने कैथोड इलेक्ट्रॉन प्रवाह में यह परिणाम है. वोल्टेज में परिवर्तन time.7 भर में डिटेक्टर के माध्यम से कार्बन पासिंग की राशि के लिए आनुपातिक है
    13. बाद प्रणाली के नमूने चल रहा समाप्त हो गया है और आप प्रत्येक चोटी के एकीकरण की जांच करने की आवश्यकता होगी. स्टार वर्कस्टेशन सॉफ्टवेयर के लिए,टूल बार में नीले शिखर आइकन पर क्लिक करें. प्रत्येक चोटी रंग पर क्लिक करें और तीर खींचें करने के लिए आधारभूत समायोजित. चोटियों के अगले समूह पर जाने से पहले प्रत्येक शिखर पुनः एकीकृत. पीक विश्लेषण सॉफ्टवेयर किसी भी सामान्य क्रोमैटोग्राफी सॉफ्टवेयर हो सकता है.
    14. स्टार वर्कस्टेशन सॉफ्टवेयर के लिए अपने उपकरण पट्टी में बैच रिपोर्ट आइकन पर क्लिक करें. रिपोर्ट के नमूने की रिपोर्ट मुद्रित करने के लिए आपके द्वारा निर्दिष्ट फ़ोल्डर से बैच प्रत्येक नमूने खींचें. रिपोर्टिंग सॉफ्टवेयर सबसे आम क्रोमैटोग्राफी सॉफ्टवेयर सिस्टम के साथ अनुकूलित किया जा सकता है.
    15. रिपोर्ट करने के लिए अपनी पसंद की जानकारी प्रदर्शित करने के लिए programed जा सकता. हम वर्तमान में शिखर ऊंचाई का उपयोग करने के लिए, लेकिन रिपोर्ट भी चोटी क्षेत्र का उपयोग programed जा सकता है.
    16. सिस्टम बंद करने, बंद नीचे विधि मापदंडों (2 तालिका में नोट) शुरू करने के लिए, पानी के स्नान बारी है, और हाइड्रोजन और हवा टैंक बंद जब स्तंभ ओवन का तापमान 30 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है

    9. इथेनॉल डेटा

    1. शिखर ऊंचाई के रूप में प्लॉटप्रत्येक ज्ञात बाहरी मानक इथेनॉल एकाग्रता के एक समारोह (2A चित्रा). रैखिक इन अंक द्वारा दिए गए शिखर प्रत्येक dialysate नमूना द्वारा दी गई ऊंचाई से इथेनॉल एकाग्रता की गणना के लिए एक समारोह का प्रयोग करें.
    2. समय पर dialysate में इथेनॉल की एकाग्रता की साजिश रचने, हम हमारे व्यवहार सत्र के दौरान ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र में इथेनॉल के स्तर के पैटर्न देख सकते हैं. उदाहरण डेटा, नीचे (चित्रा 2B) में दिखाया गया है, आत्म - प्रशासन सत्र के दौरान समय के पार dialysate में इथेनॉल की एकाग्रता के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं.

    10. सामान्य रखरखाव: फाइबर हर 500 punctures, और पट बदला जाना चाहिए हर 100 punctures

    को फाइबर बदलने

    1. गैस chromatograph कुंजी पैड प्रेस मेनू पर, 8400 का चयन करें, प्रेस दर्ज करें, परिवर्तन सिरिंज का चयन करने के लिए, प्रेस दर्ज करें. autosampler ही स्थिति के लिए अनुमति देगा फाइबर (SPME फाइबर विधानसभा, 75 सुक्ष्ममापी - PDMS Carboxen, Supelco विश्लेषणात्मक, BellefoNTE, पीए) हटाया जा.
    2. फाइबर को कवर दरवाजा खोलो. खोलना ताला अखरोट, और कुंडी को स्थानांतरित करने के लिए फाइबर विधानसभा हटाया जा करने के लिए अनुमति देते हैं. फाइबर विधानसभा से बाहर ले जाओ. अखरोट है कि विधानसभा में फाइबर रखती है, और फिर खोलना फाइबर खोलना.
    3. एक नया एक के साथ पुराने फाइबर बदलें, और फाइबर विधानसभा reassemble. Autosampler में विधानसभा बदलें, फिर से latching और जगह में विधानसभा पंगा लेना. जब आप समाप्त कर रहे हैं, प्रेस, कुंजी पैड पर "परिवर्तन हो", और autosampler ही इस्तेमाल के लिए तैयार होगा.

    पट को बदलने के लिए

    1. सबसे पहले, खोलना टोपी पट (हाय अस्थायी .450 व्यास जेनेरिक वातानुकूलित SEPTA, Varian) को कवर और फिर पुराने पट हटा दें. नीचे फिटिंग में सीटों की नई पट. टोपी पेंच और यह रिंच कस. फिर, पट पंचर एक इंजेक्शन सुई का उपयोग इतना है कि फाइबर पहली बार नहीं टूट जाएगा पट हवा निकाल दी है.
    2. 11. प्रतिनिधि परिणाम

      1 चित्रा इथेनॉल मानकों के तीन सांद्रता के लिए और एक चूहे dialysate इथेनॉल आत्म - प्रशासन सत्र के अंत में एकत्र नमूना के लिए उदाहरण chromatograms से पता चलता है. इथेनॉल चोटियों अपेक्षाकृत सममित हो, लगातार प्रतिधारण समय चाहिए, और शोर अनुपात> 10 के लिए एक संकेत है. इन मानदंडों को पूरा करने में विफलता का मतलब है कि आपके सिस्टम के रखरखाव की आवश्यकता है. गुणवत्ता क्रोमैटोग्राफी और सही ढंग से तैयार मानकों एक रेखीय मानक (0.99 ≥ R2, चित्रा 2A) वक्र उत्पादन कि dialysate नमूनों की इथेनॉल एकाग्रता इथेनॉल से एकत्र की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है आत्म - प्रशासन (चित्रा 2B) उनके आत्म - प्रशासन सत्र के पाठ्यक्रम पर पशुओं .

      चित्रा 1
      1. उदाहरण chromatograms चित्रा. इथेनॉल मानक या dialysate नमूना के एक microliter एक गैस ग में भरी हुई थीशीशी hromatograph और विश्लेषण के रूप में पाठ में वर्णित है. 5.0, 2.5, और 10 मिमी इथेनॉल मानकों से उत्पन्न चोटियों के ओवरले) ए. बी) पीक एक चूहा है कि आत्म प्रशासित इथेनॉल से एक dialysate नमूना से उत्पन्न.

      चित्रा 2
      चित्रा 2 उदाहरण चित्र 1 में दिखाया प्रयोग से आलेखीय परिणाम. ए) इथेनॉल मानक वक्र. बी) एक इथेनॉल सत्र आत्म प्रशासन भर dialysate इथेनॉल एकाग्रता का समय बेशक.

      <tr>
      हार्डवेयर प्राचल शुरू स्थापना सेटिंग रनिंग आराम कर सेटिंग
      8400 Bruker autosampler (Varian)
      इंजेक्शन मोड SPME SPME n / a
      सॉल्वेंट प्रवेश गहराई 0% 20% n / a
      नमूना प्रवेश गहराई 20% 20% n / a
      अवशोषण समय 0.01 मिनट 3 मिनट n / a
      Desorption समय 19 मिनट 1 मिनट n / a
      मोड विलायक स्रोत साफ मैं मैं n / a
      स्वच्छ मोड सोखना और desorption समय 0.01 मिनट 0.01 मिनट n / a
      जल स्नान (autosampler तपता) * 50 डिग्री सेल्सियस 50 डिग्री सेल्सियस बंद
      CP-3800 Varian गैस chromatograph
      इंजेक्टर ओवन ओवन शक्ति पर पर पर
      ओवन तापमान 250 डिग्री सेल्सियस 220 डिग्री सेल्सियस 30 डिग्री सेल्सियस
      कॉलम ओवन स्थिरीकरण समय 0.10 मिनट 0.10 मिनट 0.10min
      तापमान 65 डिग्री सेल्सियस 65 डिग्री सेल्सियस 30 डिग्री सेल्सियस
      स्तंभ मोबाइल चरण प्रवाह दर 8.5 मिलीग्राम / मिनट 8.5 मिलीग्राम / मिनट n / a
      कॉलम दबाव ~ 6 साई ~ 6 साई ≥ 0.1 साई
      खूंटी डिटेक्टर ओवन शक्ति पर पर पर
      तापमान 220 डिग्री सेल्सियस 220 डिग्री सेल्सियस 120 डिग्री सेल्सियस इलेक्ट्रानिक्स पर पर बंद
      लगातार समय तेज तेज तेज
      रेंज 11 11 11
      Autozero हां हां हां

      तालिका 2 लौ ionization का पता लगाने प्रणाली मानकों के साथ गैस chromatograph. इस तालिका में तीन कार्यक्रमों के लिए तैयार किया जाता मानकों सेटिंग्स (शुरू), रन (सेटिंग्स चल रहा है) से पता चलता है और व्यवस्था बनाए रखने जबकि (आराम सेटिंग्स) में नहीं है.

    Discussion

    आवेदन और सीमाएं

    नशीली दवाओं के आत्म - प्रशासन मॉडल नशीली दवाओं की लत के लिए कृन्तकों में प्रयोग किया जाता है. दुरुपयोग है कि इस फैशन में मॉडलिंग कर रहे हैं की कई दवाओं नसों के द्वारा प्रशासित किया जा सकता है, जिसमें दवा सीधे केंद्रीय डिब्बे के लिए दिया जाता है. यह आत्म - प्रशासन की एक सत्र में खुराक के पास निगरानी के लिए अनुमति देता है. चूंकि इथेनॉल आमतौर पर मौखिक रूप से आत्म प्रशासित, यह बहुत कठिन है अवशोषण और चयापचय में व्यक्तिगत मतभेदों के कारण दवा के स्तर की निगरानी. नमूना करने के लिए ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र से microdialysis का उपयोग करके, हम केवल इथेनॉल क्षेत्र तक पहुँचने के पैटर्न पर नजर रखने में सक्षम नहीं हैं, लेकिन हम भी करने के लिए एक साथ एक समय पर एक ही क्षेत्र में आत्म - प्रशासन प्रत्येक चरण के दौरान neurotransmitter परिवर्तन की निगरानी करने में सक्षम हैं.

    मस्तिष्क में neurochemical परिवर्तन और दवा प्रेरित प्रतिक्रियाओं नशीली दवाओं के दुरुपयोग और निर्भरता के साथ जुड़े रहे हैं, इस प्रकार, समवर्ती विदेश मंत्रालय की क्षमतायकीन है कि और विशिष्ट आत्म - प्रशासन चरणों के दौरान neurochemical दवा सांद्रता एक बहुत शक्तिशाली और अद्वितीय उपकरण प्रदान करता है. व्यवहार के साथ analytes की dialysate सांद्रता correlating के लिए मन में रखने के लिए एक मुद्दा microdialysis पाइपलाइन की शारीरिक विशेषताओं है. विशेष रूप से, यह तरल पदार्थ के लिए लेता है microdialysis जांच के लुमेन से संग्रह ट्यूब को हस्तांतरित किया जा महत्वपूर्ण है, और कम बार बेहतर कर रहे हैं. हमारी प्रयोगशाला में, हम जांच का निर्माण इतना है कि समय के बारे में 90 सेकंड है. इन शर्तों का प्रयोग, हमने पाया है कि इथेनॉल खपत, जो डाइलासेट इथेनॉल एकाग्रता बढ़ जाती है के रूप में पेय और पीने के बाद की अवधि के पाठ्यक्रम पर कम हो जाती है की दीक्षा में एक accumbal dopamine वृद्धि हुई है 2,3,8,9 इन प्रयोगों. जब औषधीय अध्ययनों से डेटा के साथ संयुक्त, हमें बाहर पार्स करने के लिए चर्चा पर इथेनॉल और आत्म - प्रशासन जुड़े पर्यावरण cues का कड़ाई औषधीय प्रभाव की अनुमति दी हैneurotransmitter सांद्रता में anges.

    यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संयुक्त व्यवहार microdialysis तकनीक के इस विशेष आवेदन हमारी प्रयोगशाला की वर्तमान अनुसंधान के हितों के लिए अनुकूल है. यह इथेनॉल के अस्थायी पैटर्न एक ही क्षेत्र में neurotransmitter परिवर्तन के पैटर्न की तुलना में मस्तिष्क तक पहुंचने का मूल्यांकन करने के लिए, ताकि हम इन उपायों तुल्यकालिक आत्म - प्रशासन के व्यवहार से संबंधित कर सकते हैं के लिए बनाया गया है. व्युत्पन्न dialysate इथेनॉल सांद्रता vivo जांच वसूली में सही नहीं कर रहे हैं, और केवल मस्तिष्क इथेनॉल ऊतक एकाग्रता का एक अंश हैं. यदि इथेनॉल के मात्रात्मक microdialysis की आवश्यकता है, तो इथेनॉल की निकासी के अंश है कि जांच में बाह्य अंतरिक्ष से diffuses प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए. तरीकों और आगे की चर्चा के लिए हमारी प्रयोगशाला से पिछले प्रकाशनों देखें 10,11,12.

    हालांकि इस प्रोटोकॉल गैस चर्चा के उपयोग दिखाता हैmicrodialysis नमूनों की headspace से इथेनॉल के ठोस चरण microextraction के साथ romatography, microdialysis नमूना इथेनॉल सामग्री का विश्लेषण करने के लिए अन्य तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, वैकल्पिक तरीकों को कुछ नुकसान से पीड़ित हो सकता है. उदाहरण के लिए, कम संवेदनशील विश्लेषणात्मक तरीकों एक बड़ा नमूना मात्रा है जो आवश्यक नमूना यहाँ सचित्र 5-7 मिनट से अधिक समय की आवश्यकता हो सकती है. यहाँ पर चर्चा की प्रणाली के प्रकार एक ठोस चरण microextraction है कि शीशी headspace में रखा फाइबर अवशोषण की अनुमति देकर मोहरबंद नमूना शीशी में भाप चरण में इथेनॉल ध्यान केंद्रित का उपयोग करता है. यह प्रत्यक्ष headspace नमूना है जो आम तौर पर इंजेक्शन वाष्प के 50-100 microliters करने की अनुमति देता है के साथ तुलना में सीमा का पता लगाने में सुधार. Headspace विधि का एक और बड़ा लाभ यह है कि नमूना विश्लेषण के लिए इंजेक्शन अत्यंत स्वच्छ और लवण से मुक्त है. तरल microdialysis नमूना की डायरेक्ट इंजेक्शन उच्च Sensit के साथ भी इस्तेमाल किया जा सकता हैivity, लेकिन इस इंजेक्शन लवण की सफाई के लिए नियमित रूप से आवश्यक रखरखाव के कारण समय के नीचे और अधिक साधन की आवश्यकता होगी.

    मुसीबत शूटिंग और अन्य नोटों

    1. अपने प्रयोग से पहले शुरू होता है, तो अपने आप को समय के बहुत सारे देने के लिए जाँच करें कि आपके microdialysis सेट अप ठीक से कार्य कर रहे हैं और किसी भी मुद्दे को मुसीबत शूट. हमारा सुझाव है कि आप एक सेट अप अतिरिक्त, ACSF साथ perfused के साथ बाहर जाने के लिए तैयार है एक सेट अप खराब होने के अपने आप को समय बचा है, के रूप में सबसे अधिक चालू सत्र के लिए हर दिन एक विशिष्ट समय में पाए जाते हैं.
    2. सुनिश्चित करें कि microdialysis जांच के बारे में 5 मिनट के एक अवधि में डाला जाता है ऊतक क्षति को कम करने के रूप में ऊतक के बाल काटना जांच मस्तिष्क प्रवेश द्वारा उत्पादित.
    3. Operant कक्ष में चूहे के हस्तांतरण के लिए यह उपयोगी है एक दूसरे व्यक्ति की सहायता के इतना है कि हस्तांतरण लाइन (microdialysis सेट अप का हिस्सा) पेचीदा बनने नहीं करता है, और इसलिए कि operant कार्यक्रम init जा सकतासमय पर iated.
    4. सुनिश्चित करें कि आप समय की autosampler पानी स्नान करने के लिए उचित तापमान तक पहुँचने के लिए बहुत कुछ दे. हमारी प्रणाली आम तौर पर 50 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के लिए दो घंटे की आवश्यकता यह भी आश्वासन देता है, कि अपने नमूनों को पूरी तरह से नमूनों का विश्लेषण करने से पहले vaporized हैं. हम आम तौर पर नेत्रहीन पुष्टि करते हैं कि यह नमूना विश्लेषण शुरू करने से पहले हुआ है.
    5. मानक अच्छा विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान प्रथाओं का पालन किया जाना चाहिए. ये शामिल हैं, लेकिन, व्यक्तियों, उपकरण, और प्रक्रियाओं का सत्यापन ही सीमित नहीं हैं. संक्षेप में, हम निम्नलिखित निर्देशों को रोजगार: व्यक्तिगत उपयोगकर्ताओं के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कई दिनों में मानक और सांद्रता रैखिक मानक घटता (R2 ≥ 0.99) के लिए पीक ऊंचाई मूल्यों उत्पन्न करने की क्षमता का प्रदर्शन करना चाहिए. यह सत्यापित करने के लिए जीसी - खूंटी प्रणाली सही ढंग से काम कर रहा है, मानकों हमेशा हो विश्लेषण से पहले किसी भी dialysate नमूने इंजेक्ट कर रहे हैं चाहिए. मानक उत्पन्न वक्र एक R2 ≥ 0.99 होना चाहिए.
    6. उपकरण का उपयोग हम में से अधिकांशVarian, Inc, जो टेक्नोलॉजीज द्वारा 2010 में अधिग्रहण कर लिया था के माध्यम से खरीदा गया था. इस समय, Bruker वैज्ञानिक उपकरण Varian प्रयोगशाला गैस क्रोमैटोग्राफी उपकरणों व्यापार प्राप्त. भविष्य की खरीद के लिए, या तो कंपनी से परामर्श करें.
    7. चूहों के साथ मौजूद प्रोटोकॉल operant व्यवहार से पता चलता है, लेकिन दर्शक जानते हैं कि व्यवहार की अधिक व्यवधान छोटे माउस मॉडल के साथ होने की संभावना है होना चाहिए. एक अन्य मुद्दे के बारे में पता होना मस्तिष्क औसत दर्जे का prefrontal प्रांतस्था या नाभिक accumbens एक बड़ा डिग्री की तुलना में यहाँ दिखाया operant व्यवहार को बाधित कर सकते हैं के अलावा अन्य क्षेत्रों में एक microdialysis जांच की है कि नियुक्ति है. यह महत्वपूर्ण है को बारीकी से कई व्यवहार मापदंडों की जांच करने के लिए निर्धारित करती है कि जांच नियुक्ति द्वारा वजह से नुकसान में व्यवहार में गंभीर बदलाव का उत्पादन.

    Disclosures

    इस लेख मेड एसोसिएट्स इंक द्वारा वित्त पोषित किया गया था

    Acknowledgments

    इस शोध NIH / NIAAA (AA11852 और AA007471) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    95% Ethanol AAPER Alcohol and Chemical Co., Shelbyville, KY E190, 111000190
    Ultra-Pure Sucrose MP Biomedicals, LLC, Solon, OH 821721
    Ultra High Purity Helium Air Gas HE UHP300
    Air Air Gas AIZ300
    Hydrogen Air Gas AIZ300
    GC 2 ml vials Agilent Technologies #8010-0015
    GC vial caps with PTFE/silicone septa Agilent Technologies #8010-0084
    Table 1. Specific reagents

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    References

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    इथेनॉल के गैस क्रोमैटोग्राफी द्वारा operant इथेनॉल आत्म - प्रशासन और इथेनॉल के दृढ़ संकल्प के दौरान microdialysis
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    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).More

    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).

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