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Neuroscience

가스 크로마토 그래피에 의한 operant 에탄올 자기 관리 및 에탄올 결정시 에탄올의 Microdialysis

doi: 10.3791/4142 Published: September 5, 2012

Summary

operant 에탄올 동안 쥐의 뇌에 에탄올 농도의 시간 코스를 결정하는 방법은 자기 관리가 설명되어 있습니다. 가 생성되는 작은 볼륨에 필요한 감도를 가지고 있기 때문에 불꽃 이온화 검출과 가스 크로마토 그래피는, dialysate 샘플에 에탄올을 수량화하는 데 사용됩니다.

Abstract

Operant 자기 관리 방법은 일반적으로 에탄올 등의 학대의 많은 약물의 행동 및 약리 효과를 연구하는 데 사용됩니다. 그러나 에탄올은 일반적으로 오히려 남용의 많은 다른 약물과 같은 intravenously보다 구두 자기 관리입니다. 구두 관리 약물의 pharmacokinetics은 intravenously 관리 마약보다 더 복잡합니다. 에탄올의 약리 및 행동 효과 사이의 관계를 이해하는 것은 음주 중이나 후에 뇌에 도달 에탄올의 시간 코스에 대한 지식이 필요하기 때문에, 우리는 시간이 지남에 따라 뇌 dialysate의 에탄올 농도를 모니터링하는 불꽃 이온화 감지 생체의 microdialysis 및 가스 크로마토 그래피에 사용합니다.

결합 microdialysis - 행동 실험은 여러 기술의 사용을 포함한다. 의 자기 관리 및 neu 수많은 테스트하도록 구성 할 수있다이 문서, stereotaxic 수술, 행동 교육 및 microdialysis,rochemical 중심 가설은 단지 그들이 샘플 수집 및 dialysate의 에탄올 분석의 후속 단계에 관한 방법을 설명하기위한 포함되어 있습니다. 에탄올 연구에 따라 달라집니다 불꽃 - 이온화 감지,와 가스 크로마토 그래피를 통해 에탄올 농도 분석을 Dialysate이 자세히 설명되어 있습니다. 이러한 방법에 의해 생산 데이터는 자체 관리 절차를 수행하는 동안 뇌에 도달 에탄올의 패턴을 보여, 같은 dialysate 샘플 neurochemical 분석과 결합하여, 결론은 에탄올의 약리 및 행동 효과에 관한 한 할 수 있습니다.

Protocol

1. Stereotaxic 수술

  1. 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드를 따라 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
  2. stereotaxic 장치를 사용하여 장기 에반스 isoflurane과 anesthetized 쥐, 관심있는 뇌 영역 위의 21 게이지 캐뉼라 (나중에 microdilaysis 프로브 삽입) (플라스틱, 하나, 로어 노크, VA)에 주입되며, 테 더링을 잘 처리 볼트는 머리 단계 (microdialysis 장비를 지원하는 데 사용)에 내장되어 있습니다.
  3. 수술하는 동안 및 이후 조심스럽게 쥐를 모니터링합니다. 모든 동물이 포스트 수술 치료 및 복구 적어도 1 주를 받게 다음과 같은 절차를 시작하기 전에 건강 있는지 확인합니다. stereotaxic 수술 방법의 주피터 동영상을 볼 수 있습니다. 1

2. Operant 교육

  1. 포스트 수술 회복 일주일 후, 동물 10 % 자당 solutio를 위해 레버를 언론에 훈련N lickometer, 개폐식 레버, 그리고 sipper 튜브 (이전 하워드 외., 2009에 설명 된대로)에 장착 메드 Associates의 operant 챔버 (MedAssociates 주식회사, 버몬트, USA) 인치 MedAssociates에서 2 소프트웨어는 모든 설계하는 데 사용됩니다 operant 프로그램 (MedAssociates 주식회사, 버몬트, 미국).
  2. 일단, 자당에 대한 응답 에탄올은 서서히 여러 마시는 세션 동안 솔루션에 추가되는 동안 적절한 훈련 일정에 쥐를 시작하도록 훈련.
  3. 예를 들어, 연구소는 현재 에탄올은 10 %의 에탄올 / 10 % 자당 술을 솔루션에 culminating 솔루션으로 잊혀 질까 8 일 훈련 일정을 사용합니다. 제어 동물은 10 %의 자당 또는 전혀 음주 솔루션을받을 수 있습니다. 사용되는 operant 일정의 특정 유형은 다양 할 수 있지만 microdialysis 샘플링에 대해 아래에 설명 된 일반적인 절차는 계속 수행 할 수 있습니다. 3

3. 사전 microdialysis 절차 : 테 더링

마지막으로 교육 세션 (우리의 예에서이 7 일 교육 세션)에 두 번째 전날 밤에이 동물들은 머리를 무대로 테 더링 볼트에 부착 테 더링 스프링에 길들여있다. 봄은 동물의 케이지 내에서 자유롭게 이동할 수 있도록 링 스탠드와 클램프로 케이지 옆에 정지되어있는 microdialysis의 회전 및 카운터 밸런스 레버 암에 첨부합니다. 테 더링 동물 테 더링으로 설정들이다 위해, 광고 libitum 음식과 물과의 홈 케이지에 operant 방에서 밤을 지샐.
  • 다음 날, 쥐은 행동 작업을 수행하는 동안 밧줄의 느낌에 동물을 길 들이면하는 장소에서 테 더링과의 operant 프로그램을 완료합니다. operant 챔버의 지붕의 중심 위의 테 더링 및 회전 정지 할 수 있도록 상단에있는 operant 챔버의 벽에 테 더링 장치를 탑재합니다. 이 모든 소리 감쇠 챔버 내에 배치됩니다. AfteR 세션, microdiaysis 프로브 삽입을 기다리고있는 operant 방에서의 홈 케이지에 쥐를 반환합니다.
  • 4. 사전 microdialysis 절차 : 쥐가 하루 행동 교육을 완료 한 후 microdialysis 프로브는 microdialysis 실험 하루 전에 삽입

    1. 테 더링 동안 isoflurane과 쥐를 마취하고 가이드 캐뉼라의 폐쇄를 제거 microdialysis 실험 전 날, 쥐 후 operant 세션을 완료했습니다. 천천히 (5 ~ 이상 분)의 관심 두뇌 지역에 두개 가이드 캐뉼라를 통해 인공 대뇌 척수 (ACSF)로 perfused microdialysis 프로브를 삽입합니다. 우리는 실험실 - 건설 프로브 및 Doyon 외., 2003 및 Pettit와 정의, 1991 년 이후 모델 microdialysis 절차를 사용합니다. 3, 4
    2. 동물 위의 프로브의 입구와 출구 라인을 일시 중지 이전에 논의 테 더링 장치를 사용하십시오.
    3. P을 돌려옷 유량 0.2 μl / 분으로 다운. 다시 한번, 쥐가 operant 방에서 밤을 보낸다.

    5. Microdialysis 절차 : 샘플 수집 분리 appetitive 및 consummatory 단계와 자기 관리 세션에서

    1. 실험이 시작 적어도 2 시간 전에, 그 작동 유량에 프로브를 켜십시오. 우리는 1.0 또는 2.0 μl / 뇌 지역에 따라 분 중 하나를 사용합니다. 프로브 흐름 속도가 일관성이 있는지 확인하고, 시간이 지남에 볼륨을 측정하기 위해 해밀턴 주사기를 사용하여 설정 유량의 최소 90 %.
    2. 투석 샘플 (5 또는 7 분) 동안, 그리고 operant 세션 후, 이전에 촬영하고 있습니다. 샘플링 간격이 뇌 지역에 따라 달라집니다, 신경 전달 물질이 분석되고, analyte 농도 및 분석에 사용되는 분석 화학 장비의 감도를 dialysate. 행동 단계는 다음과 같다 :
      1. 기준 : 실험의 시작에서,동물의 홈 케이지 (4 샘플)에 투석 샘플을 수집합니다.
      2. 전송 : 홈 케이지 기준 샘플 수집 후, operant 챔버에 쥐를 전송합니다. 묶여 쥐의 전송 극단적 인 치료 microdialysis 유체 전송 라인 얽힌되며, 쥐가 조용 유지하지 않도록해야합니다. 당신이 첫 번째 대기 샘플에 기준 / 전송 샘플에서 변경하면 즉시 전송 후 operant 프로그램을 활성화합니다.
      3. 잠깐만 쥐가 챔버 (뇌 지역에 따라 3-4 샘플)로 확장 할 수있는 레버를 기다립니다으로 샘플을 수집를 계속합니다.
      4. 음료 : 레버가 수여 누르면 후, 음주 솔루션 (10 % sucrose/10 %의 에탄올 또는 10 %의 자당)의 병을 20 분 (3-4 샘플)에 대한 쥐에게 제공하고 있습니다.
      5. 포스트 음료 : 음료 기간 후, 병 retracts하지만 쥐가 남아 전N 약 20 분 (3-4 샘플)에 대한 operant 챔버.

    6. Microdialysis 절차 : 에탄올 분석을위한 microdialysis 샘플의 작성

    1. , 에탄올 농도에 대한 평가 후 동물 전에 두 샘플은 에탄올 솔루션, 모든 샘플을 직접 관리 할 수​​ 있습니다. 피펫 중 2 ML의 유리관에 관심이 예제에서 도보로 1 또는 2 μl 나누어지는. 그런 다음 공기 빡빡 중격 (9mm 레드 폴리 나사 모자, PTFE / 실 Septa, 애질런트 테크놀로지스)로 병을 밀봉. 에탄올 분석 나누어지는 (1 또는 2 μl)의 볼륨은 총 샘플 볼륨, 추가 분석에 필요한 샘플 볼륨에 따라 달라집니다.
    2. 샘플은 나중에 neurochemical 분석에 사용 할 경우 적절한 에탄올 정량화에 대한 나누어지는을 pipetting 후 샘플을 저장합니다.
    3. 예를 들어, 연구소는 도파민의 샘플을 분석합니다. 이 작업을 수행하려면 실험이 진행되는 동안 드라이 아이스에 샘플을 배치그리고, 실험 후 -80 ° C에서 샘플을 저장합니다. 우리는 2.0 μl / 핵 accumbens에 배치 프로브를위한 분의 유량을 사용하여 수집 된 5 분 샘플의 에탄올 분석을 위해 2 μl aliquots를 사용합니다. 이 전기 감지 고성능 액체 크로마토 그래피에 의해 도파민의 최신 분석에 남아있는 최소 7 μl 수 있습니다.
    4. 훨씬 낮은 세포 도파민 농도가있는 전두엽 피질에서 촬영 샘플의 경우, 우리는 1.0 μl / 분의 유량을 사용하여 7 분 샘플에서 가져온 에탄올 분석을 위해 1 μl 나누어지는을 사용합니다.

    7. 포스트 microdialysis 절차

    1. microdialysis 실험의 결론 후, 쥐를 마취하고 프로브를 제거합니다. 동물이 즉시 euthanized하지 않은 경우 폐쇄를 교체합니다. 실험 3 일 이내에 뇌를 수집합니다. 그렇지 않으면, 프로브 기관의 시각화가 가능하지 않을 수 있습니다.
    2. 뇌는 i를 제거해야승인 된 동물을 사용 프로토콜과 N의에 따라. 우리는 식염수의 염분 후 포르말린과 심장 재관류 다음 나트륨 pentobarbital (150 밀리그램 / kg, IP) 과다 복용을 사용합니다. sectioning 전에 최소한 12 시간 포르말린 - 생리 식염수에 잠기 뇌.
    3. Coronally 섹션 100 μm 슬라이스로 뇌. cresyl 보라색으로 조각 청바지, 그리고 올바른 프로브 게재 위치를 확인합니다. 5, 6

    8. 에탄올 농도에 대한 샘플 분석

    1. 수집 된 샘플뿐만 아니라 외부 기준 (0.3125-20 MM 에탄올) 불꽃 이온화 검출 시스템과의 가스 크로마토 그래프에 게재됩니다. 이 시스템은 불꽃 이온화 검출기와 Varian CP 3800 가스 크로마토 그래프로 구성되어, Bruker (Varian) 8400 천정 공간 autosampler는 ° C, 그리고 HP Innowax 모세관 칼럼 (30 MX 0.53 mm X 1.0 μm 필름 두께)로 50 가열 모바일 단계로 헬륨.
    2. Chromatograms는 chromatogr으로 기록하고 분석이러한 구체적으로 여기에 논의 될 Varian 스타 크로마토 그래피 워크 스테이션 소프트웨어와 같은 aphy 소프트웨어.
    3. 에탄올 분석을 위해 시스템을 준비하려면, 순환 물 목욕을 사용하여 autosampler 판을 가열하고, 두 개의 추가 가스 탱크 (공기와 수소, 헬륨은 항상 왁스 열을 보존하기 위해 실행 남아 있습니다)를 엽니 다.
    4. 심장, 가스 탱크 압력뿐만 아니라, 당신이 섬유 및 중격 그들이 적절한 때에 (섬유-500 주사를 변경 할 수 있도록 사용 된 횟수의 카운트를 유지 할 수 있도록 실행하고자하는 샘플의 수를 기록 -100 구멍).
    5. 샘플을 (표 2의 프로그램 매개 변수)를 실행하는 시스템을 준비 시동 메소드를 시작합니다. 는 "준비"입니다 것을보고 시스템 기다립니다.
    6. 20 분 모든이가 흡수 한 오염 desorb하기 위해 높은 온도에 subjecting하여 샘플 분석을위한 섬유를 준비하는 "굽기"를 시작 휴식하는 동안.
    7. 기준에 의해 만들어진화학 퓸 배출 후드에 용적 플라스크를 사용하여 100 ML의 최종 볼륨에 물과 95 % 에탄올의 238 μl를 diluting. 이 40 밀리미터 에탄올 솔루션을 만듭니다. 우리는 20, 10를 만드는 1:1 시리얼 희석, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 MM 표준을 사용합니다. 표준의 각 농도를 들어, 투석 샘플에서 가져온 될 것 같은 볼륨 나누어지는을 사용합니다. 2 ML 유리 유리 병에 나누어지는을 피펫하고 공기 단단한 심장을 병을 밀봉.
    8. 전체 액체 나누어지는이 기화 될 때까지 모든 에탄올 샘플은 autosampler에서 가열됩니다. 우리는 약 30 분 동안의 샘플을 가열.
    9. 이 섹션은 우리가 가스 크로마토 그래프를 사용하는 스타 워크 스테이션 소프트웨어를 설명합니다. 다른 소프트웨어는 사용할 수 있지만, 아래의 설명은 해당되지 않을 수 있습니다.
    10. 샘플을 실행하려면 샘플 어떤 autosampler 슬롯에있는 지적 샘플 목록을 작성하고, 샘플을 몇 번이나 구멍이 나고해야합니다. 선택한 배에 경로 데이터 파일을해야합니다어. 그런 다음 샘플에 대한 선택의 방법을 선택하고 실행을 시작합니다. 우리는 표 2에 명시된 실행 매개 변수를 사용합니다.
    11. 우리 dialysate 에탄올 프로그램은 3 분의 샘플을 흡수하고 1 분 동안 왁스 열에 피드 헬륨 스트림로 desorbs. 그러나, 프로그램은 사용자의 특정 요구를 충족하도록 작성 할 수 있습니다.
    12. 다음 왁스 열에서 별도의 및 샘플 구성 요소는 불꽃 이온화 검출기를 통해 이동하는 위치 등 에탄올, 발화 및 출시 이온 등의 화합물을 포함하는 탄소. 검출기의 양극에서 전압으로 변환하고 (그림 1) 아래 그림과 같은 chromatograms의 결과로 기록되어있는 현재를 만들어 음극으로 증가 전자 흐름이 발생합니다. 전압의 변화는 time.7에서 검출기를 통해 탄소 통과의 양에 비례
    13. 시스템이 샘플을 실행을 마친 후에는 각 피크의 통합을 확인해야합니다. 스타 워크 스테이션 소프트웨어,툴바에있는 파란색 피크 아이콘을 클릭하십시오. 각 피크의 색상을 클릭하고 기준을 조정하려면 화살표를 드래그합니다. 봉우리의 다음 그룹에 이동하기 전에 각 피크를 다시 통합 할 수 있습니다. 피크 분석 소프트웨어는 일반적으로 크로마토 그래피 소프트웨어가 될 수 있습니다.
    14. 스타 워크 스테이션 소프트웨어를 들어, 도구 막대에서 배치 보고서 아이콘을 클릭하십시오. 지정된 폴더에서 샘플 보고서를 인쇄 할 배치 보고서에 각 샘플을 끕니다. 보고 소프트웨어는 가장 일반적인 크로마토 그래피 소프트웨어 시스템과 사용자 정의 할 수 있습니다.
    15. 보고서는 원하는 정보를 표시하기 위해 programed 수 있습니다. 현재 최고 높이를 사용하지만 보고서는 또한 피크 면적을 사용하는 programed 할 수 있습니다.
    16. 시스템을 종료하려면 시스템 종료 다운 방법 (매개 변수가 표 2에 명시된 바와 같이) 시작, 물 목욕을 해제하고 열 오븐 온도가 30 ° C.에 도달하면 수소와 공기 탱크를 닫습니다

    9. 에탄올 데이터

    1. 피크 높이로 그리기각 알려진 외부 표준 에탄올 농도의 함수 (그림 2A). 각 dialysate 샘플이 제공 피크 높이에서 에탄올 농도를 계산하기 위해 이러한 점에서 주어진 선형 함수를 사용합니다.
    2. 시간이 지남에 따라 dialysate에서 에탄올의 농도를 모의함으로써, 우리는 우리의 행동 세션 중에 관심있는 뇌 영역에서 에탄올 수준의 패턴을 볼 수 있습니다. (그림 2B) 아래에 표시되는 예제 데이터, 자기 관리 세션 시간에 걸쳐 dialysate에서 에탄올의 농도로 표현됩니다.

    10. 일반 유지 보수 : 섬유마다 500 구멍, 그리고 심장을 변경해야 모든 100 구멍

    섬유를 변경하려면

    1. 기체 크로마토 그래프 키 패드 메뉴에서 선택 8400은 입력 한 다음 Enter 키를 누릅니다, 변경 주사기를 선택 Enter 키를 누릅니다. autosampler 허용하는 자체 위치에서 섬유 (SPME 섬유 조립, 75 μm Carboxen-PDMS, Supelco 분석, Bellefonte, PA)을 제거 할 수 있습니다.
    2. 섬유를 덮고있는 문을 엽니 다. 나사가 빠지다 잠금 너트 및 섬유 어셈블리가 제거 될 수 있도록 래치를 이동합니다. 섬유 어셈블리를 꺼내주세요. 나사가 빠지다 다음 어셈블리의 섬유를 가지고 있으며, 너트는 섬유를 돌려서 빼다.
    3. 새로운 하나 기존의 섬유를 교체하고, 섬유 어셈블리를 조립. , autosampler에있는 어셈블리를 교체 다시 래치과 장소에 어셈블리를 놓구. 작업이 완료되면, 키 패드의 "변경 완료"눌러 autosampler는 사용 자체가 준비됩니다.

    심장을 변경하려면

    1. 첫째, 나사가 빠지다 다음 중격 (하이 온도 0.450 DIA. 일반 에어컨, Septa, Varian)를 다루는 캡하고 기존의 중격을 제거합니다. 피팅에 내려 안전 새로운 중격합니다. 뚜껑을 다시 망치와 렌치로 조입니다. 섬유 심장이 구멍을 첫 번째 휴식 시간하지 않도록 다음, 찔린 심장에 주입 바늘을 사용합니다.
    2. 11. 대표 결과

      그림 1은 에탄올 표준의 세 농도 및 에탄올 자기 관리 세션의 끝에서 수집 한 쥐 dialysate 샘플에 대한 예 chromatograms을 보여줍니다. 에탄올 봉우리는 비교적 대칭이 될 일관성 유지 시간을 가지고 있고, 잡음 비율> 10 신호한다. 이러한 기준을 충족하지 않으면 시스템이 유지 보수를 필요 있다는 것을 의미합니다. 품질 크로마토 그래피와 올바르게 준비 표준 선형 표준 곡선 (R2 ≥ 0.99, 그림 2A) 생산 에탄올에서 수집 한 dialysate 샘플 에탄올 농도를 계산하는 데 사용됩니다 자기 관리의 자기 관리 세션의 과정 (그림 2B)을 통해 동물을 .

      그림 1
      1. 예 chromatograms 그림. 에탄올 표준 또는 dialysate 샘플 중 하나 마이크로 리터는 가스 C에로드 된병을 hromatograph하고 텍스트에 명시된 분석했다. 2.5, 5.0 및 10 밀리미터 에탄올 표준에서 생성 된 봉우리 A) 중첩. B) 피크 자기 관리 에탄올을 가진 쥐에서 dialysate 샘플에서 생성.

      그림 2
      그림 2. 그림 1에 표시된 예를 들어 실험에서 그래픽 결과입니다. A) 에탄올 표준 곡선. 에탄올 자기 관리 세션에서 dialysate 에탄올 농도의 B) 시간 코스입니다.

      <TR>
      하드웨어 매개 변수 시작 - 설정 설정을 실행 휴식 설정
      8400 Bruker (Varian) Autosampler
      사출 모드 Spme Spme N / A
      용매 침투 깊이 0% 20% N / A
      샘플 침투 깊이 20% 20% N / A
      흡수 시간 0.01 분 3 분 N / A
      탈착 시간 19 분 1 분 N / A
      모드 용매 소스를 청소 나는 나는 N / A
      클린 모드 흡착 및 탈착 시간 0.01 분 0.01 분 N / A
      물 목욕 (autosampler를 가열) * 50 ° C 50 ° C 끄기
      CP-3800 Varian 기체 크로마토 그래프
      주입기 오븐 오븐 전력
      오븐 온도 250 ° C 220 ° C 30 ° C
      열 오븐 안정화 시간 0.10 분 0.10 분 0.10min
      온도 65 ° C 65 ° C 30 ° C
      모바일 위상 유량 8.5 ML / 분 8.5 ML / 분 N / A
      열 압력 ~ 6 PSI ~ 6 PSI ≥ 0.1 PSI
      FID 검출기 오븐 전력
      온도 220 ° C 220 ° C 120 ° C 전자 공학 끄기
      일정한 시간 빠른 빠른 빠른
      범위 11 11 11
      Autozero

      불꽃 이온화 검출 시스템 매개 변수 표 2. 가스 크로마토 그래프. 이 표는 준비하는 데 사용되는 세 가지 프로그램에 대한 매개 변수 (시동 설정)을 실행합니다 (설정을 실행)를 표시하고 시스템을 유지하지 사용 (휴게소 설정)에있는 동안.

    Discussion

    응용 프로그램 및 제한

    약물 자기 관리는 모델 약물 중독과 동물에 사용됩니다. 이 방식으로 모델 아르 학대의 많은 약물은 약물이 중앙 구획에 직접 전달되는, intravenously 관리 할 수​​ 있습니다. 이 자체 관리 세션 이상 복용의 가까이에 모니터링 할 수 있습니다. 에탄올은 구두 보통 자기 관리이기 때문에, 그것은 흡수와 신진 대사의 개별 차이로 인해 마약 수준을 모니터링하기가 훨씬 어렵습니다. 관심의 두뇌 지역에서 샘플로 microdialysis를 사용하여, 우리는이 지역에 도달 에탄올의 패턴을 모니터 할 수 없지만, 우리는 또한 동시에 각 자체 관리 단계에서 시간이 지남에 같은 지역에서 신경 전달 물질의 변화를 모니터링 할 수 있습니다.

    뇌 Neurochemical 변경 및 약물 유발 반응은 약물 남용과 의존과 연결되어, 따라서 동시에 MEA 할 수있는 능력을특정 자기 관리 단계 동안 확인 neurochemical 및 약물 농도는 매우 강력하고 독특한 도구를 제공합니다. 행동과 analytes의 dialysate 농도를 상호 연관에 대해 유의해야 할 하나의 문제는 microdialysis의 배관의 물리적 특성입니다. 특히,이 수집 관에 microdialysis 프로브의 루멘에서 전달되는 유체에 대해 걸리는 시간은 매우 중요하며, 짧은 시간이 더 있습니다. 시간이 90 초 정도입니다 수 있도록 우리가 실험실에서, 우리는 프로브를 구성합니다. 이러한 조건에 사용, 우리는 dialysate 에탄올 농도 증가로 음료 및 사후 음료 기간에 걸쳐 감소 에탄올 소비의 개시에서 accumbal 도파민 증가가 나타났습니다. 2,3,8,9 이러한 실험 , 약리 연구의 데이터와 결합 할 때, 우리 채널에서 에탄올과 자기 관리 관련 환경 단서의 엄격 약리 효과를 분석 할 수있다신경 전달 물질 농도에 anges.

    그것은 결합 동작 - microdialysis 기술의 특정 응용 프로그램이 저희 연구실의 현재 연구 관심 분야에 적합한 것을 주목해야한다. 그것은 우리가 동기 자기 관리 행동에 이러한 조치를 관련 수 있도록, 같은 지역에서 신경 전달 물질의 변화 패턴에 비해 뇌에 도달 에탄올의 시간 패턴을 평가하기 위해 설계되었습니다. 파생 dialysate의 에탄올 농도는 생체 프로브 복구에 대한 수정 및 뇌 에탄올 조직 농도의 일부분 일 뿐인 걸까되지 않습니다. 에탄올의 정량 microdialysis가 필요한 경우 프로브에 세포 우주에서 diffuses하는 에탄올의 추출 분율은 실험적으로 결정해야합니다. 방법과 자세한 설명을 위해 저희 연구실에서 이전 출판물을 참조하십시오. 10,11,12

    이 프로토콜 가스 채널의 사용을 보여줍니다 있지만microdialysis 샘플의 천정 공간에서 에탄올의 견고한 위상 microextraction와 함께 romatography는 microdialysis 샘플의 에탄올 내용의 분석을위한 다른 방법을 사용할 수 있습니다. 그러나, 다른 방법은 몇 가지 단점으로 고생 할 수 있습니다. 예를 들어, 덜 민감 분석 방법은 여기에 도시 된 5-7 분보다 샘플링 시간 더 필요로 큰 샘플 볼륨이 필요할 수 있습니다. 여기에 설명 시스템의 유형은 유리 병의 천정 공간에 배치 섬유에 흡수함으로써 밀봉 된 샘플 병에 증기 단계에서 에탄올을 집중 견고한 위상 microextraction을 사용합니다. 이것은 일반적으로 증기의 50-100 microliters을 주입 할 수 있습니다 직접 헤드 스페이스 샘플링에 비해 검출 한계를 향상시킵니다. 헤드 스페이스 방법의 또 다른 주요 장점은 분석을 위해 주입 된 샘플은 매우 깨끗하고 소금은 무료입니다 것입니다. 액체 microdialysis 샘플의 직접 분사도 높은 sensit와 함께 사용할 수 있습니다ivity하지만,이 주입 된 소금을 청소하는 데 필요한 정기적 인 유지 관리 작업으로 인해 시간 다운 더 많은 악기를 필요합니다.

    문제 해결 및 기타 사항

    1. 실험이 시작하기 전에 microdialysis 세트 업이 제대로 작동하는지 확인하고 문제를 고장 쏘 자신에게 충분한 시간을 제공합니다. 우리는 당신이 밖으로 전환 할 준비, ACSF와 perfused, 설정 추가를하는 것이 좋습니다 가장 operant 세션을 매일 특정 시간에 발생하는 경향이로, 자신에게 시간을 절약 할 설정 오작동.
    2. microdialysis 프로브는 프로브의 뇌를 침투로 조직의 전단에 의해 생성 된 조직의 손상을 최소화하기 위해 약 5 분에 걸쳐 삽입되어 있는지 확인하십시오.
    3. operant 챔버에 쥐를 전송하는 경우는 두 번째 사람이 operant 프로그램을 초기화 할 수 있도록 전송 라인 (microdialysis 설정의 일부) 얽힌되고하지 않도록 지원하고있는 것이 유용합니다시간에 iated.
    4. 당신은 적절한 온도에 도달하는 시간의 autosampler 물 목욕을 충분히 제공해야합니다. Google 시스템은 일반적으로 두 시간 밖에 50 ° C.에 도달해야합니다 또한 샘플이 완전히 샘플을 분석하기 전에 기화 있으니 안심하십시오. 우리는 일반적으로 시각이 샘플 분석을 시작하기 전에 발생했음을 확인합니다.
    5. 표준 좋은 분석 화학 관행을 준수해야합니다. 여기에는 있지만, 개인, 장비 및 절차의 검증에 제한되지 않습니다. 간단한에서, 우리는 다음과 같은 가이드 라인을 고용 : 개인 사용자는 여러 일에 걸쳐 표준 농도 및 선형 표준 곡선 (R2 ≥ 0.99)을 재현 피크 높이 값을 생성 할 수있는 능력을 입증해야합니다. GC-FID 시스템이 제대로 작동하는지 확인하기 위해, 표준은 dialysate 샘플을 주입하기 전에 분석 할 항상 있어야합니다. 생성 된 표준 곡선 R2 ≥ 0.99이 있어야합니다.
    6. 우리가 사용하는 장비의 대부분은2010 년 애질런트 테크놀로지스 인수 한 Varian 주식회사를 통해 구입했습니다. 현재 Bruker 과학 인스트루먼트는 Varian의 실험실 가스 크로마토 그래피 기기 사업을 획득하였습니다. 향후 구매를 들어, 두 회사를 참조하십시오.
    7. 현재 프로토콜은 쥐와 operant 동작을 보여 주지만 뷰어는 행동의 더 많은 혼란이 작은 마우스 모델에서 발생할 가능성이 있다는 것을 알고 있어야한다. 인식해야 할 또 다른 문제는 중간 전두엽 피질 또는 핵 accumbens는 여기에 표시된 것보다 더 큰 정도 operant 동작을 방해 할 수 있습니다 이외의 다른 뇌 영역에 microdialysis 프로브의 게재 위치가 있습니다. 그것은 밀접하게 프로브 배치로 인한 손상이 행동의 심각한 변화를 초래 여부를 결정하는 여러 행동 매개 변수를 검사하는 것이 중요합니다.

    Disclosures

    이 문서는 메드 어소시에이츠 주식회사가 추진하는 사업

    Acknowledgments

    이 연구는 NIH / NIAAA (AA11852과 AA007471)에서 보조금에 의해 지원되었다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    95% Ethanol AAPER Alcohol and Chemical Co., Shelbyville, KY E190, 111000190
    Ultra-Pure Sucrose MP Biomedicals, LLC, Solon, OH 821721
    Ultra High Purity Helium Air Gas HE UHP300
    Air Air Gas AIZ300
    Hydrogen Air Gas AIZ300
    GC 2 ml vials Agilent Technologies #8010-0015
    GC vial caps with PTFE/silicone septa Agilent Technologies #8010-0084
    Table 1. Specific reagents

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    References

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    가스 크로마토 그래피에 의한 operant 에탄올 자기 관리 및 에탄올 결정시 에탄올의 Microdialysis
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    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).More

    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).

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