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Neuroscience

Microdiálisis de etanol durante etanol operante determinación y la auto-administración de etanol por cromatografía de gases

doi: 10.3791/4142 Published: September 5, 2012

Summary

Un método para determinar el curso temporal de la concentración de etanol en el cerebro de ratas durante etanol operante auto-administración se describe. La cromatografía de gases con detección de ionización de llama se utiliza para cuantificar de etanol en las muestras de dializado, debido a que tiene la sensibilidad necesaria para los pequeños volúmenes que se generan.

Abstract

Operantes de auto-administración métodos se utiliza comúnmente para estudiar los efectos conductuales y farmacológicas de muchas drogas de abuso, incluyendo el etanol. Sin embargo, el etanol es típicamente auto-administrarse por vía oral, en lugar de por vía intravenosa como muchas otras drogas de abuso. La farmacocinética de los fármacos administrados por vía oral son más complejos que los medicamentos administrados por vía intravenosa. Debido a la comprensión de la relación entre los efectos farmacológicos y de comportamiento de etanol requiere el conocimiento de la evolución en el tiempo de etanol alcanza el cerebro durante y después de beber, utilizamos microdiálisis in vivo y cromatografía de gases con detección de ionización de llama para supervisar el cerebro concentraciones de etanol de dializado a través del tiempo.

Combinados de comportamiento microdiálisis-experimentos implican el uso de varias técnicas. En este artículo, la cirugía estereotáxica, y la formación del comportamiento de microdiálisis, que puede ser adaptado para probar una multitud de auto-administración y neupetroquímicas hipótesis centrada, sólo se incluyen para ilustrar cómo se relacionan con las fases posteriores de la toma de muestras y análisis de etanol dializado. Dializado análisis etanol concentración por cromatografía de gases con detección de ionización de llama, que es específico para los estudios de etanol, se describe en detalle. Los datos producidos por estos métodos revelar el patrón de etanol alcanza el cerebro durante el procedimiento de auto-administración, y cuando se combina con el análisis neuroquímico de las muestras de dializado mismas, permite conclusiones que se haya efectuado sobre los efectos farmacológicos y de comportamiento de etanol.

Protocol

1. La cirugía estereotáxica

  1. Todos los procedimientos de seguimiento de la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión.
  2. El uso de un aparato estereotáxico, bien manejada ratas Long-Evans, anestesiados con isoflurano, se implantan con una cánula de calibre 21 (para más tarde microdilaysis inserción de la sonda) (Plastics One, Roanoke, VA) por encima de la región cerebral de interés, y una cinta de sujeción cerrojo está integrado en la etapa de cabeza (utilizado para soportar equipo de microdiálisis).
  3. Controlar las ratas cuidadosamente durante y después de la cirugía. Asegúrese de que todos los animales reciben por lo menos una semana de atención postquirúrgica y la recuperación y están sanos antes de iniciar el siguiente procedimiento. Un video JoVE del método de la cirugía estereotáxica está disponible. 1

2. Formación operante

  1. Después de una semana de recuperación post-quirúrgica, los animales son entrenados para palanca de prensa de sacarosa 10% solution en una cámara Med Associates operante (MedAssociates, Inc., Vermont, EE.UU.) equipado con un lickometer, palanca retráctil, y el tubo para sorber (como se ha descrito previamente en Howard et al., 2009). 2 Software de MedAssociates se utiliza para diseñar todo programas operantes (MedAssociates, Inc., Vermont, EE.UU.).
  2. Una vez entrenados para responder a la sacarosa, comienzan las ratas en un programa de entrenamiento adecuado durante el cual el etanol se añade gradualmente a la solución durante varias sesiones de bebida.
  3. Por ejemplo, nuestro laboratorio actualmente utiliza un programa de entrenamiento de 8-día donde el etanol se desvaneció en la solución que culmina en un 10% de etanol / 10% de solución de sacarosa potable. Los animales de control sólo reciben el 10% de sacarosa o ninguna solución bebible. El tipo específico de horario operante para ser usada puede variar ampliamente, pero los procedimientos generales descritos a continuación para la toma de muestras de microdiálisis aún puede llevarse a cabo. 3

3. Microdiálisis Procedimientos previos: Tethering

La noche antes de la segunda a la última sesión de entrenamiento (en nuestro ejemplo se trata de la sesión de entrenamiento 7 º), los animales se habitúan a la primavera de sujeción, que se inserta en el tornillo de sujeción en su etapa cabeza. El resorte se une a la pieza giratoria de microdiálisis y brazo de contra balanza de palanca, que está suspendido al lado de la jaula con un soporte de anillo y abrazaderas para que el animal pueda moverse libremente dentro de su jaula. Animales atados pasar la noche en la habitación operante, en su jaula con comida y agua ad libitum, para habituarse a la inmovilización puesta a punto.
  • El día siguiente, la rata completa su programa operante con la correa de sujeción en su lugar, a habituar al animal a la sensación de la correa de sujeción mientras que realiza sus tareas de comportamiento. Montar el aparato de anclaje a la pared de la cámara operante cerca de la parte superior para permitir la suspensión de la correa de sujeción y giratorio sobre el centro del techo de la cámara operante. Todo esto se coloca dentro de la cámara de atenuación de sonido. After la sesión, vuelva a la rata a su jaula en la sala operante a la espera de inserción microdiaysis sonda.
  • 4. Microdiálisis Pre-Procedimiento: La sonda de microdiálisis se introduce el día antes del experimento de microdiálisis, después de la rata ha completado la formación del comportamiento para el día

    1. El día antes del experimento de microdiálisis, después de que la rata ha completado una sesión operante mientras atado, anestesiar la rata con isoflurano y se retire el obturador de la cánula guía. Lentamente (durante ~ 5 min) insertar una sonda de microdiálisis, perfundidos con líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF), a través de la cánula guía craneal en la región del cerebro de interés. Utilizamos laboratorios construidos por las sondas de microdiálisis y procedimientos siguiendo el modelo de Doyon et al., 2003 y Pettit y Justicia, 1991. 3, 4
    2. Utilizar el aparato de inmovilización previamente discutido para suspender la entrada y la de salida de la sonda por encima del animal.
    3. Gire el ptúnica caudal hasta 0,2 l / min. Una vez más, la rata pasa la noche en la sala operante.

    5. Procedimientos de microdiálisis: Colección de muestras durante el período de auto-administración con fases apetitiva y consumatoria separados

    1. Por lo menos 2 horas antes de comenzar el experimento, suba la sonda a su tasa de flujo de trabajo. Usamos ya sea 1,0 o 2,0 l / min dependiendo de la región del cerebro. Comprobar que el caudal de la sonda es constante, y por lo menos 90% del caudal establecido mediante el uso de una jeringa de Hamilton para medir el volumen con el tiempo.
    2. Muestras de diálisis (5 min o 7) se toman antes, durante y después de la sesión operante. El intervalo de muestreo depende de la región del cerebro, neurotransmisor que se analiza, el dializado concentración del analito, y la sensibilidad del equipo de química analítica para ser utilizado para el análisis. Las fases de comportamiento son los siguientes:
      1. Línea de base: Al inicio del experimento,recoger muestras de diálisis en la jaula hogar del animal (4 muestras).
      2. Transferencia: Después de la recogida de muestras de origen de línea de base jaula, traslado a la rata a la cámara operante. Transferencia de la rata anclada requiere extremo cuidado para asegurarse de que el fluido de microdiálisis línea de transferencia no se enrede, y que la rata se mantiene en calma. Inmediatamente después de la transferencia, activar el programa operante a medida que cambia de la muestra de referencia / transferencia a la espera de la muestra en primer lugar.
      3. Esperar: Continuar para recoger muestras como la rata espera a la palanca para extenderse dentro de la cámara (muestras 3-4, dependiendo de la región del cerebro).
      4. Beber: Después de la palanca se presenta y se presiona, una botella de solución potable (10% sucrose/10% etanol o 10% de sacarosa) se pone a disposición de la rata durante alrededor de 20 minutos (muestras 3-4).
      5. Post-bebida: Después del período de la bebida, se retrae la botella, pero los restos de ratas in la cámara operante durante unos 20 minutos (muestras 3-4).

    6. Procedimientos de microdiálisis: Preparación de la muestra para el análisis de microdiálisis etanol

    1. Dos muestras de animales antes de la auto-administración de la solución de etanol, y todas las muestras después, se evalúan para la concentración de etanol. Pipetear ya sea una alícuota de 1 o 2 l de la muestra de interés en un vial de vidrio de 2 ml. A continuación, sellar el vial con un tabique hermético (9 mm Red Poly tapón de rosca, PTFE / Sil Septa, Agilent Technologies). El volumen de la alícuota análisis etanol (1 l o 2) depende del volumen total de la muestra, y el volumen de muestra requerido para los análisis adicionales.
    2. Si las muestras se usarán para su posterior análisis neuroquímico, almacenar la muestra apropiadamente después de pipetear la alícuota para la cuantificación de etanol.
    3. Por ejemplo, nuestro laboratorio analiza las muestras para la dopamina. Para lograr esto, colocar las muestras en hielo seco durante el experimentoy, a continuación, almacenar las muestras a -80 ° C después del experimento. Nosotros utilizamos 2 ml de alícuotas para el análisis de una muestra de etanol min 5 recogieron usando un caudal de 2,0 l / min para las sondas colocadas en el núcleo accumbens. Esto permite por lo menos 7 l restante para el análisis posterior de la dopamina por cromatografía líquida de alto rendimiento con detección electroquímica.
    4. Para las muestras tomadas de la corteza prefrontal, que tiene mucho más bajas concentraciones de dopamina extracelular, se utiliza una parte alícuota de 1 l de etanol para el análisis de una muestra de 7 min utilizando una velocidad de flujo de 1,0 l / min.

    7. Microdiálisis procedimientos posteriores

    1. Después de la conclusión del experimento de microdiálisis, anestesiar la rata y retirar la sonda. Vuelva a colocar el obturador si el animal no es sacrificado inmediatamente. Recoger el cerebro dentro de los tres días del experimento. De lo contrario, la visualización del tracto sonda puede no ser posible.
    2. El cerebro debe ser eliminado in acuerdo con los protocolos aprobados animales de uso. Usamos pentobarbital sódico (150 mg / kg, ip) sobredosis, seguido de la perfusión cardiaca con solución salina y después de la formalina en solución salina. Sumergir cerebro en una solución de formalina salina durante al menos 12 horas antes de seccionar.
    3. Sección coronal del cerebro en rodajas 100 micras. Stain rebanadas con cresil violeta, y examinar la colocación de la sonda correcta. 5, 6

    8. Análisis de las muestras para la concentración de etanol

    1. Las muestras recogidas, así como normas externas (0,3125 a 20 mM de etanol) se ejecutan en nuestro cromatógrafo de gases con sistema de detección de ionización de llama. Este sistema se compone de un cromatógrafo de gases Varian CP 3800 con un detector de ionización de llama, un Bruker (Varian) 8400 espacio de cabeza del inyector automático calienta a 50 ° C, y una columna capilar HP INNOWax (30 mx 0,53 mm x 1,0 m de espesor de película), con helio como fase móvil.
    2. Los cromatogramas se registran y analizan con Chromatography software tal como el software Varian Star Cromatografía de estación de trabajo que va a ser discutido específicamente aquí.
    3. Para preparar el sistema para el análisis de etanol, calentar la placa del inyector automático usando un baño de agua de recirculación, y abrir los dos tanques adicionales de gas (aire e hidrógeno, helio se deja siempre corriendo para preservar la columna de cera).
    4. Registre las presiones de los tanques de gas, así como el número de muestras que tengan la intención de correr para que pueda llevar la cuenta del número de veces que la fibra y el tabique se han utilizado de manera que se puede cambiar cuando sea apropiado (fibra-500 inyecciones; tabique -100 pinchazos).
    5. Iniciar el procedimiento de puesta en marcha, que prepara el sistema para que ejecute las muestras (los parámetros del programa de la Tabla 2). Espere a que el sistema para informar de que se trata de "Ready".
    6. Iniciar un 20-min "quemar", que prepara la fibra para el análisis de la muestra sometiéndola a una temperatura alta para desorber cualquier contaminante que haya absorbido mientras está en reposo.
    7. Las normas son hechas pordilución de 238 l de etanol al 95% con agua hasta un volumen final de 100 ml en un matraz volumétrico en una campana química. Esto crea una solución de etanol 40 mM. Usamos una dilución 1:1 en serie para crear 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 mm Normas. Para cada concentración de estándar, utilizar el mismo volumen alícuota que se tomarán de las muestras de diálisis. Pipetear la parte alícuota en un vial de vidrio de 2 ml y, a continuación sellar el vial con un tabique hermético de aire.
    8. Todas las muestras de etanol se calientan en el inyector automático hasta que la alícuota de líquido entero se ha vaporizado. Calentamos nuestras muestras durante aproximadamente 30 min.
    9. En esta sección se describe el software de estación de trabajo Star que utilizamos con nuestro cromatógrafo de gases. Otro software puede ser utilizado, pero la descripción a continuación pueden no ser aplicables.
    10. Para ejecutar muestras, crear una lista de ejemplo señalar que la muestra es en qué ranura inyector automático, y las veces que la muestra debe ser perforado. Asegúrese de que la ruta de los archivos de datos en su pliegue seleccionadoer. A continuación, seleccione el método de elección para sus muestras, y comenzar la carrera. Usamos los parámetros de funcionamiento indicados en la Tabla 2.
    11. Nuestro programa de etanol dializado absorbe la muestra durante 3 min y se desorbe en la corriente de helio, que se alimenta en la columna de la cera, durante 1 min. Sin embargo, los programas pueden ser escritos para adaptarse a sus necesidades específicas.
    12. Los componentes de la muestra separados en la columna de la cera, y luego pasar por el detector de ionización de llama, donde el carbono que contiene compuestos, tales como iones de etanol, combustos y liberación. Esto da lugar a aumento del flujo de electrones desde el ánodo del detector para el cátodo creando una corriente, que se convierte en voltaje y grabado resultante en cromatogramas como la que se muestra a continuación (Figura 1). El cambio en la tensión es proporcional a la cantidad de carbono que pasa a través del detector a través de tiempo.7
    13. Después de que el sistema termine de ejecutarse las muestras que usted tendrá que comprobar la integración de cada pico. Para el software de estación de trabajo Star,haga clic en el icono de pico azul en la barra de herramientas. Haga clic en el color de cada pico y arrastrar las flechas para ajustar la línea de base. Vuelva a integrar cada pico antes de pasar al siguiente grupo de picos. El software de análisis de pico puede ser cualquier software de cromatografía general.
    14. Para el software de estación de trabajo Star, haga clic en el icono de informes por lotes en la barra de herramientas. Arrastra cada muestra de la carpeta especificada al informe de lotes para imprimir los informes de ejemplo. Software de informes se pueden personalizar con los sistemas de software más comunes de cromatografía.
    15. Los informes pueden ser programados para mostrar la información de su elección. Actualmente usamos la altura del pico, pero los informes también puede ser programado para usar el área del pico.
    16. Para apagar el sistema, iniciar el procedimiento de desconexión (parámetros indicados en la Tabla 2), apague el baño de agua, y cerca de los tanques de hidrógeno y de aire cuando la temperatura del horno de columna alcanza los 30 ° C.

    9. Datos del etanol

    1. Trazar la altura del pico comouna función de cada concentración conocida externo etanol estándar (Figura 2A). Utilizar la función lineal dada por estos puntos para calcular la concentración de etanol a partir de la altura de pico dada por cada muestra de dializado.
    2. Al graficar la concentración de etanol en el líquido de diálisis a través del tiempo, podemos ver el patrón de los niveles de etanol en la región cerebral de interés durante nuestra sesión de comportamiento. Ejemplo de datos, que se muestran a continuación (Figura 2B), se representan como la concentración de etanol en el dializado a través del tiempo durante la sesión de autoadministración.

    10. Mantenimiento general: La fibra debe cambiarse cada 500 perforaciones, y el tabique de la cada 100 punciones

    Para cambiar la fibra

    1. En el cromatógrafo de gases tecla Menú pulse el parche, seleccione 8400, enter, seleccione jeringa cambio, pulse Intro. El automuestreador se posicionará para permitir la fibra (Fiber Asamblea SPME, 75 m Carboxen-PDMS, Supelco Analítica, Bellefonte, PA) para ser eliminado.
    2. Abra la puerta que cubre la fibra. Desenroscar la tuerca de bloqueo, y mover el pestillo para permitir que el conjunto de fibras para ser eliminado. Tome el conjunto de fibras fuera. Desenroscar la tuerca que sujeta la fibra en la asamblea, y luego desenroscar la fibra.
    3. Cambiar la fibra del viejo por uno nuevo, y volver a montar el conjunto de fibras. Vuelva a colocar el conjunto en el muestreador automático, re-enganche y atornillar el conjunto en su lugar. Cuando haya terminado, pulse el botón "cambiar done" en el teclado, y el inyector automático estará listo para su uso propio.

    Para cambiar el septum

    1. En primer lugar, desenroscar el tapón que cubre el tabique (Hi-Temp 0.450 Dia. Genérico acondicionado Septa, Varian) y retire el tabique de edad. Asiente el septum nuevo abajo en el accesorio. Vuelva a enroscar el tapón y apriételo con la llave. A continuación, utilizar una aguja de inyección para perforar el tabique de manera que la fibra no se rompe la primera vez que se perfora el septum.
    2. 11. Los resultados representativos

      La Figura 1 muestra los cromatogramas de ejemplo para tres concentraciones de etanol y normas para una muestra de dializado rata recogido al final del etanol auto-administración de sesiones. Picos de etanol debe ser relativamente simétrica, tienen tiempos de retención consistentes, y una relación de señal a ruido> 10. Si no se cumplen estos criterios, significa que el sistema requiere mantenimiento. Cromatografía de estándares de calidad y correctamente preparados de producir una curva estándar lineal (R2 ≥ 0,99; Figura 2A) que se utiliza para calcular la concentración de etanol de las muestras de dializado recogido en etanol auto-administración de animales en el transcurso de su auto-administración de sesiones (Figura 2B) .

      Figura 1
      Figura 1. Ejemplo cromatogramas. Un microlitro de etanol estándar o de la muestra de dializado se cargó en un gas chromatograph vial y se analizaron como se describe en el texto. A) superposición de los picos generados de 2,5, 5,0 y 10 mM de etanol normas. B) Pico generada a partir de una muestra de líquido de diálisis de una rata que tiene autoadministrado etanol.

      Figura 2
      Figura 2. Los resultados gráficos del experimento de ejemplo que se muestra en la figura 1. A) Etanol curva estándar. B) Evolución temporal de la concentración de etanol líquido de diálisis a través de una mezcla de etanol autoadministración sesión.

      <tr>
      Hardware Parámetro Puesta en valor Ejecución de ajuste Ajuste de reclinación
      8400 Bruker (Varian) Autosampler
      Inyección de modo SPME SPME n / a
      Profundidad de penetración de los disolventes 0% 20% n / a
      Ejemplo de profundidad de penetración 20% 20% n / a
      Absorción tiempo 0,01 min 3 min n / a
      Desorción tiempo 19 min 1 min n / a
      Limpie el modo de fuente solvente Yo Yo n / a
      Clean modo de adsorción y desorción tiempo 0,01 min 0,01 min n / a
      Baño de agua (inyector automático calienta) * 50 ° C 50 ° C De
      CP-3800 cromatógrafo de gases Varian
      Inyector Horno Horno poder En En En
      Temperatura del horno 250 ° C 220 ° C 30 ° C
      Estufa de columna Tiempo de estabilización 0,10 min 0,10 min 0.10min
      Temperatura 65 ° C 65 ° C 30 ° C
      Columna Fase móvil caudal 8,5 ml / min 8,5 ml / min n / a
      Columna de presión ~ 6 psi ~ 6 psi ≥ 0,1 psi
      Detector FID Horno poder En En En
      Temperatura 220 ° C 220 ° C 120 ° C Electrónica En En De
      Constante de tiempo Rápido Rápido Rápido
      Alcance 11 11 11
      Autocero

      Tabla 2. Cromatógrafo de gases con los parámetros del sistema de detección de ionización de llama. Esta tabla muestra los parámetros para los tres programas que se utilizan para preparar (ajustes de inicio), Run (ejecutar ajustes) y mantener el sistema cuando no está en uso (valores de reposo).

    Discussion

    Aplicaciones y limitaciones

    Medicamentos auto-administración se utiliza en los roedores a la adicción de drogas modelo. Muchas drogas de abuso que se modelan de esta manera puede administrarse por vía intravenosa, en la que el fármaco se administra directamente en el compartimento central. Esto permite un control estricto de la dosis durante una sesión de auto-administración. Puesto que el etanol es habitualmente de forma oral auto-administrada, es mucho más difícil de controlar los niveles de fármaco debido a las diferencias individuales en la absorción y el metabolismo. Mediante el uso de microdiálisis a la muestra de la región cerebral de interés, no sólo son capaces de controlar el patrón de etanol de llegar a la región, pero también somos capaces de controlar simultáneamente los cambios de neurotransmisores en la misma región en el tiempo durante cada fase de auto-administración.

    Alteraciones neuroquímicas y las respuestas inducidas por las drogas en el cerebro están asociados con el abuso y dependencia de drogas, por lo que la capacidad para medir simultáneamenteneuroquímico seguro y las concentraciones de drogas específicas durante las fases de auto-administración es una herramienta muy poderosa y única. Una cuestión a tener en cuenta para la correlación de las concentraciones de analitos dializado con conductas son las características físicas de la tubería microdiálisis. Específicamente, el tiempo que tarda para que el líquido se transfiere desde el lumen de la sonda de microdiálisis para el tubo de recogida es crítica, y tiempos más cortos son mejores. En nuestro laboratorio, la construcción de las sondas de modo que el tiempo es de aproximadamente 90 segundos. Usando estas condiciones, hemos encontrado que hay un aumento de la dopamina accumbal en el inicio del consumo de etanol, lo que disminuye en el curso de los períodos de bebida y post-bebida al aumentar la concentración de etanol de dializado. 2,3,8,9 Estos experimentos , cuando se combinan con los datos de los estudios farmacológicos, nos han permitido analizar los efectos estrictamente farmacológicas de etanol y autoadministración señales ambientales asociadas en canalanges en las concentraciones de neurotransmisores.

    Cabe señalar que esta aplicación particular de la combinación del comportamiento de microdiálisis técnicas se adaptan a los intereses actuales de investigación de nuestro laboratorio. Está diseñado para evaluar el patrón temporal de etanol alcanza el cerebro en comparación con el patrón de cambios de neurotransmisores en la misma región, por lo que podemos relacionar estas medidas a síncronos de auto-administración comportamientos. Las concentraciones de etanol derivado de dializado no se corrigen por la sonda en la recuperación in vivo, y son sólo una fracción de la concentración de etanol en el tejido cerebral. Si microdiálisis cuantitativa de etanol se requiere, la fracción de extracción de etanol que se difunde desde el espacio extracelular en la sonda debe ser determinado experimentalmente. Ver publicaciones anteriores de nuestro laboratorio de métodos y nuevos debates. 10,11,12

    Aunque este protocolo ilustra el uso de gas chromatography junto con microextracción en fase sólida de etanol del espacio de cabeza de muestras de microdiálisis, otros métodos para el análisis del contenido de etanol de la muestra de microdiálisis se podría utilizar. Sin embargo, los métodos alternativos pueden sufrir de algunas desventajas. Por ejemplo, los métodos analíticos menos sensibles pueden requerir un volumen de muestra más grande que requiere tiempos de muestreo mayor que el 7.5 min ilustra aquí. El tipo de sistema discutido aquí utiliza una microextracción en fase sólida que concentra el etanol en la fase de vapor en el vial de muestra sellada, permitiendo la absorción de la fibra colocada en el espacio de cabeza del vial. Esto mejora el límite de detección en comparación con el muestreo del espacio de cabeza directo que permite típicamente 50-100 microlitros de la que se inyecta vapor. Otra ventaja importante del método del espacio de cabeza es que la muestra inyectada para el análisis es extremadamente limpio y libre de sales. La inyección directa de la muestra de microdiálisis líquido también se puede usar con mayor Sensitividad, pero esto requerirá más tiempo de inactividad instrumento debido a un mantenimiento regular necesario para la limpieza de las sales inyectadas.

    Solución de problemas y otras notas

    1. Antes de que su experimento comienza, te dan un montón de tiempo para comprobar que sus microdiálisis montajes están funcionando correctamente y para localizar averías cualquier problema. Nosotros sugerimos que usted tiene un extra de puesta a punto, perfundidos con ACSF, dispuesto a cambiar con un mal funcionamiento del set-up para ahorrar tiempo, ya que la mayoría de las sesiones operantes tienden a ocurrir a una hora específica cada día.
    2. Asegúrese de que las sondas de microdiálisis se insertan en un período de aproximadamente 5 min para minimizar el daño tisular producido por cizallamiento del tejido como la sonda penetra en el cerebro.
    3. Cuando la transferencia de la rata en la cámara operante es útil tener una segunda persona ayudar de manera que la línea de transferencia (parte de la microdiálisis set-up) no se enreden, y para que el programa operante puede ser initiated a tiempo.
    4. Asegúrese de que usted le debe suministrar agua suficiente automuestreador bañera de tiempo para alcanzar la temperatura adecuada. Nuestro sistema requiere normalmente dos horas para llegar a los 50 ° C. Además, aseguran que sus muestras están completamente vaporizado antes de analizar las muestras. Normalmente nos confirme visualmente que esto ha ocurrido antes de iniciar el análisis de la muestra.
    5. Estándar de buenas prácticas de química analítica deben ser seguidas. Estos incluyen, pero no se limitan a, la validación de los individuos, equipos, y procedimientos. En resumen, contamos con los siguientes lineamientos: Los usuarios individuales deben demostrar la capacidad de generar reproducibles valores de altura de pico para las concentraciones estándar y curvas lineales estándar (R2 ≥ 0,99) a través de varios días. Para verificar el sistema GC-FID está trabajando correctamente, las normas deben ser siempre ser analizados antes de cualquier muestra de dializado se inyectan. La curva estándar generada debe tener un R2 ≥ 0,99.
    6. La mayor parte del equipo que utilizamosfue comprado a través de Varian, Inc., que fue adquirida por Agilent Technologies en 2010. En este momento, Bruker Scientific Instruments laboratorio obtenido de Varian de cromatografía de gases de negocios instrumentos. Para futuras compras, consultar cualquiera de estas sociedades.
    7. El presente protocolo muestra un comportamiento operante con ratas, pero el espectador debe ser consciente de que más interrupción de comportamiento es probable que ocurra con el modelo de ratón más pequeño. Otra cuestión a tener en cuenta es que la colocación de una sonda de microdiálisis en otras regiones del cerebro de la corteza medial prefrontal o núcleo accumbens puede perturbar el comportamiento operante a un mayor grado que se muestra aquí. Es importante examinar de cerca numerosos parámetros de comportamiento para determinar si el daño causado por la colocación de la sonda produce graves cambios en el comportamiento.

    Disclosures

    Este artículo fue financiado por Med Associates, Inc.

    Acknowledgments

    Esta investigación fue apoyada por las subvenciones del NIH / NIAAA (AA11852 y AA007471).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    95% Ethanol AAPER Alcohol and Chemical Co., Shelbyville, KY E190, 111000190
    Ultra-Pure Sucrose MP Biomedicals, LLC, Solon, OH 821721
    Ultra High Purity Helium Air Gas HE UHP300
    Air Air Gas AIZ300
    Hydrogen Air Gas AIZ300
    GC 2 ml vials Agilent Technologies #8010-0015
    GC vial caps with PTFE/silicone septa Agilent Technologies #8010-0084
    Table 1. Specific reagents

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Microdiálisis de etanol durante etanol operante determinación y la auto-administración de etanol por cromatografía de gases
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    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).More

    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).

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