Vi har udviklet en<em> In vitro</em> Malaria-HIV-1 co-infektion model for at undersøge virkningen af<em> Plasmodium falciparum</em> På HIV-1 replikativ cyklus i humane primære monocyt-afledte makrofager. Dette alsidige system kan let tilpasses andre primære celletyper modtagelige for HIV-1 infektion.
Plasmodium falciparum, det forårsagende middel af den dødbringende form malaria, og human immundefekt virus type-1 (HIV-1) er blandt de vigtigste sundhedsproblemer i hele verden, er ansvarlig for en total på 4 millioner dødsfald årligt 1. På grund af deres omfattende overlap i udviklingslandene regioner, især Afrika syd for Sahara, co-infektioner med malaria og HIV-1 er almindelige, men samspillet mellem de to sygdomme er dårligt forstået. Epidemiologiske rapporter har foreslået, at malariainfektion transient forøger HIV-1 replikation og forøger HIV-1 viral belastning i co-inficerede individer 2,3. Fordi denne viræmi forbliver højt i flere uger efter behandling med malariamidler, kan dette fænomen have en indvirkning på sygdommens progression og transmission.
De cellulære immunologiske mekanismer bag disse observationer er kun blevet undersøgt næppe. De få in vitro undersøgelser Investigating indvirkning malaria på HIV-1 har vist, at udsættelse for opløselige malariaantigener kan forøge HIV-1 infektion og reaktivering i immunceller. Disse undersøgelser anvendte helcelleekstrakter af P. falciparum schizont etape parasitter og perifere mononukleære blodceller (PBMC), hvilket gør det svært at dechifrere, som malaria komponent (er) var ansvarlig for de observerede effekter og hvad målet værtscellerne var 4,5. Nyligt arbejde har vist, at eksponering af umodne monocytafledte dendritiske celler til malariaparasitter pigmentet hemozoin forøget evne til at overføre HIV-1 til CD4 + T-celler 6,7, men faldt HIV-1 infektion af makrofager 8. At kaste lys over denne komplekse proces, en systematisk analyse af samspillet mellem malariaparasitten og HIV-1 i forskellige relevante humane primære cellepopulationer er kritisk behov.
Adskillige teknikker til undersøgelse af virkningen af HIV-1 på fagocytose af mikroorganismer, og virkningen af sådanne patogener på HIV-1 replikation, er blevet beskrevet. Vi her præsenterer en metode til at undersøge virkningerne af P. falciparum-inficerede erythrocytter på replikationen af HIV-1 i humane primære monocyt-afledte makrofager. Virkningen af parasitten eksponering for HIV-1 transkriptionelle / translationelle begivenheder overvåges ved hjælp af en enkelt cyklus pseudotype virus, hvori en luciferase-reportergen, der er erstattet af env-genet, mens virkningen af mængden af virus frigivet af de inficerede makrofager bestemmes ved måling af HIV-1-capsid-protein p24 ved ELISA i cellesupernatanter.
Vi har vist her to forskellige fremgangsmåder til at analysere virkningen af malariaparasitten på HIV-1 virale cyklus, dvs ved at analysere enten viral genekspression eller afkom virusproduktion og replikation i monocyt-afledte makrofager. Lignende fremgangsmåder er blevet anvendt til andre HIV-1-parasit co-infektioner 16. Men disse nye data er et skridt fremad i undersøgelsen af malaria-HIV-1 co-infektioner. . Faktisk Diou et al 8 undersøgte effekten af hemozoin, ikke levende parasitter, på HIV-1 replikation, i overensstemmelse med vores resultater, observerede de, at hemozoin i sig selv var tilstrækkelig til at hæmme viral produktion af MDM, og ikke MDMs.
Brug den beskrevne eksperimenterende layout, vi observeret, at P. falciparum udøver en klar negativ virkning på HIV-1 replikativ cyklus i makrofager: en signifikant inhibering af viral produktion observeret i makrofager forhånd udsat for parasitter (Figure 2A) og en specifik virkning af parasitten på viral transkription er illustreret i figur 2B. Men kan vi ikke lade eventuelle yderligere effekter af parasitten på viral indrejse eller fusion (decapsidation), eller på post-integration mekanismer, såsom proteinsyntese eller viral partikel samling og spirende. Endvidere er det muligt, at en anden effekt på HIV-1 replikation ville opnås, hvis parasitten blev tilsat enten samtidigt eller efter MDM infektion med viruset.
Vores in vitro co-infektion model giver et kraftfuldt værktøj til at udføre detaljerede undersøgelser af HIV-1 / P. falciparum interaktioner i værtscellen. For eksempel er kombinationen af denne eksperimentelle indretning med andre teknikker, såsom kvantitativ real time PCR, som kan målrettes mod og kvantificere specifikke trin i viral retrotransskription og virusgenomet integration i værtscellegenomet, ganske muligt, og forventes at give yderligere insights ind i de mekanismer, der er involveret i co-infektioner. Desuden specifikke assays evaluere tidlige trin af den virale cyklus (viral fusion, decapsidation, post mængdebestemmelse) kan anvendes til dette grundlæggende protokol til yderligere at analysere virkningen på viral replikation. Disse ændringer viser, hvor fleksibel denne protokol om HIV-1 kvantificering og sporing: Selv standard HIV-1 reverse transkriptase kvantificering analyser ved hjælp af tritium-mærkede nukleotider kunne tænkes at erstatte ELISA for HIV-1 p24. Ud over MDM, forventer vi vores system skal kunne tilpasses til andre celletyper relevante for HIV-1-malaria interaktioner, såsom monocytter og dendritiske celler. Det faktum, at MDM er adhærente celler letter manipulation, hvilket tillader nem udvaskning af iRBC, der ikke er taget i, eller som er i kontakt med MDM, uden at fjerne nogen makrofager. En sådan fordel ikke anvendelse til dendritiske celler og monocytter, som dyrkes i suspension, hvilket komplicerer separation af uRBC og fri iRBC med sådanne celler, og vi er i øjeblikket om dette emne. Vores system kan også være nyttigt at undersøge mere komplekse interaktioner, såsom virkningerne af Plasmodium-eksponerede monocyt-afledte celler i HIV-1 virale cyklus i andre immunceller, såsom CD4-positive T-celler i co-kultur eksperimenter. Endelig kan vores protokol være egnet til eksperimenter ser på effekten af P. falciparum iRBCs på HIV-1 reaktivering i PBMC for HIV-1 inficerede individer.
Etik erklæring
Menneskelig PBMC blev opnået fra blod fra raske donorer, i overensstemmelse med retningslinjerne i Bioethics Committee af Centre Hospitalier de l'Université Laval Research Center. Et skriftligt samtykke blev opnået fra alle bloddonorer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den canadiske Institutes of Health Research gennem en katalysator Co-infektioner og Komorbiditet tilskud. Humane erythrocytter blev fremlagt af den Centre Hospitalier de l'Université Laval blodbank.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
RPMI 1640 | Multicell | 350-000-CL | |
PBS-endotoxin free | Sigma | D8662 | |
FBS | Wisent | 080-150 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
Accutase | eBiosciences | 00-4555-56 | |
Albumax II | Gibco | 11021-037 | Dissolved in RPMI 1640, filter-sterilized |
Lymphocyte separation medium | Multicell | 305-010-CL | |
White luminometer plates | Promega | Z3291 | |
CS Macs separation columms | Miltenyi Biotech | 130-041-305 | |
VarioMacs separator | Miltenyi Biotech | 130-090-282 | |
Penicillin/Streptomycin solution | Wisent | 450-201-EL | |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
Cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.1830 | |
24-Well Cell Culture Plates | BD Falcon | 353047 | |
150 x 20 mm culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | |
M-CSF | Genscript | Z02001 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Human serum AB+ | Valley Biomedical | HP1022 | |
HBSS | Wisent | 311-505-CL | |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Luciferase Assay System | Promega | E1500 | |
Human red blood cells | Obtained purified from CHUL blood bank. |