Vi har utviklet en<em> In vitro</em> Malaria-HIV-1 co-infeksjon modell for å studere virkningen av<em> Plasmodium falciparum</em> På HIV-1 replicative syklus i menneskets primære monocytt-deriverte makrofager. Dette allsidige systemet kan enkelt tilpasses andre primære celletyper utsatt for HIV-1 infeksjon.
Plasmodium falciparum, den forårsaker agent for den dødeligste formen for malaria, og humant immunsviktvirus type-1 (HIV-1) er blant de viktigste helseproblemene i verden, å være ansvarlig for totalt 4 millioner dødsfall årlig en. På grunn av deres omfattende overlapp i utviklingsland, spesielt Afrika sør for Sahara, co-infeksjoner med malaria og HIV-1 er felles, men samspillet mellom de to sykdommene er dårlig forstått. Epidemiologiske rapporter har antydet at malarial infeksjon forbigående forbedrer HIV-1 replikasjon og øker HIV-1 virusmengde i co-infiserte individer 2,3. Fordi denne viremia forblir høy i flere uker etter behandling med antimalariamidler, kan dette fenomenet har en betydning for sykdomsutvikling og overføring.
De cellulære immunologiske mekanismer bak disse observasjonene har blitt studert bare knapt. De få in vitro studier investigating virkningen av malaria på HIV-1 har vist at eksponering for løselige malarial antigener kan øke HIV-1 infeksjon og reaktivering i immunceller. Men brukt disse studiene helcelle ekstrakter av P. falciparum schizont scene parasitter og perifere mononukleære celler (PBMC), som gjør det vanskelig å tyde hvilke malarial komponent (er) var ansvarlig for de observerte effektene og hva målet vert celler var 4,5. Nyere arbeid har vist at eksponering av umodne monocytt-deriverte dendrittiske celler til malarial pigmentet hemozoin økt sin evne til å overføre HIV-1 til CD4 + T celler 6,7, men at det gikk HIV-1 infeksjon av makrofager 8. For å belyse dette komplekse prosessen, en systematisk analyse av samspillet mellom malariaparasitten og HIV-1 i ulike relevante humane primære celle populasjoner er kritisk behov.
Flere teknikker for å undersøke virkningen av HIV-1 på fagocytose av mikroorganismer og effekten av slike patogener på HIV-1-replikasjon er beskrevet. Vi her presentere en metode for å undersøke effektene av P. falciparum-infiserte erytrocytter på replikering av HIV-1 i humane primære monocytt-deriverte makrofager. Virkningen av Parasitten eksponering på HIV-1 transcriptional / translasjonsforskning hendelser overvåkes ved hjelp av én syklus pseudotyped virus der en luciferase reporter gen har erstattet Env genet, mens effekten på mengden av viruset utgitt av de infiserte makrofager bestemmes ved å måle HIV-1 kapsid protein p24 ved ELISA i celle supernatants.
Vi har illustrert her to ulike tilnærminger til å analysere virkningen av malariaparasitten på HIV-1 viral syklus, dvs. ved å analysere enten viral gene expression eller avkom virus produksjon og replikering i monocytt-deriverte makrofager. Lignende tilnærminger har vært brukt til andre HIV-1-parasitten co-infeksjoner 16. Men disse nye dataene er et skritt fremover i etterforskningen av malaria-HIV-1 co-infeksjoner. . Faktisk Diou et al 8 studert effekten av hemozoin, ikke levende parasitter, på HIV-1 replikasjon, i samråd med våre resultater, observerte de at hemozoin var selv tilstrekkelig til å hemme viral produksjon av MDM, og ikke MDMs.
Bruke beskrevet eksperimentelle oppsettet, observerte vi at P. falciparum utøver en klar negativ effekt på HIV-1 replicative syklus i makrofager: en signifikant hemming av viral produksjonen er observert i makrofager forhånd utsatt for parasitter (Figure 2A) og en spesifikk effekt av parasitten på viral transkripsjon er illustrert i figur 2B. Men vi kan ikke la ut ytterligere effekter av parasitten på viral innreise eller fusjon (decapsidation), eller på post-integrasjon mekanismer, for eksempel protein syntese eller viral partikkel montering og spirende. Videre er det mulig at en annen effekt på HIV-1-replikasjon ville oppnås dersom parasitten ble lagt enten samtidig eller etter MDM infeksjon med viruset.
Vår in vitro co-infeksjon Modellen gir et kraftig verktøy for å utføre detaljerte undersøkelser av HIV-1 / P. falciparum interaksjoner i vertscellen. For eksempel kombinasjonen av dette eksperimentelle oppsettet med andre teknikker som kvantitativ sanntids PCR, som kan målrette og kvantifisere bestemte trinn i viral retrotranscription og virusgenomet integrasjon til vertscellen genomet, er helt mulig og bør gi ytterligere insights i de mekanismene som er involvert i co-infeksjoner. Videre til spesifikke analyser vurdere tidlige trinn av viral syklusen (viral fusion, decapsidation, oppføring kvantifisering) kan brukes til dette grunnleggende protokollen for å analysere effekten på viral replikasjon. Disse endringene viser hvor fleksibel denne protokollen er om HIV-1 kvantifisering og deteksjon: Ja, selv vanlige HIV-1 reverstranskriptase kvantifisering analyser ved hjelp av tritium-merkede nukleotider kan tenkes å erstatte ELISA for HIV-1 p24. I tillegg til MDM, forventer vi vårt system for å kunne tilpasses andre celletyper relevante for HIV-1-malaria interaksjoner, for eksempel monocytter og dendrittiske celler. Det faktum at MDM er heftende celler forenkler deres manipulasjon, noe som åpner for enkel vask av iRBC som ikke er tatt i, eller som er i kontakt med MDM, uten å eliminere eventuelle makrofager. En slik fordel vil ikke gjelde for dendrittiske celler og monocytter, som er dyrket i suspensjon, kompliserer separation av uRBC og gratis iRBC med slike celler og vi er i dag ta opp dette problemet. Vårt system kan også være nyttig å studere mer komplekse interaksjoner som virkningene av Plasmodium-eksponerte monocytt-deriverte celler på HIV-1 viral syklus i andre immunceller som CD4-positive T-celler i co-kultur eksperimenter. Endelig kan vår protokoll være egnet for eksperimenter som ser på effekten av P. falciparum iRBCs om HIV-1 reaktivering i PBMC for HIV-1 infiserte individer.
Etikk uttalelse
Menneskelig PBMC ble hentet fra blodet av friske givere, i samsvar med retningslinjer bioetikkomité av senteret Hospitalier de l'Université Laval Research Center. En skriftlig samtykke ble innhentet fra alle blodgivere.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av den kanadiske Institutes of Health Research gjennom en katalysator Co-infeksjoner og tilleggssykdommer stipend. Humane erytrocytter ble gitt av Senter Hospitalier de l'Université Laval blodbanken.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
RPMI 1640 | Multicell | 350-000-CL | |
PBS-endotoxin free | Sigma | D8662 | |
FBS | Wisent | 080-150 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
Accutase | eBiosciences | 00-4555-56 | |
Albumax II | Gibco | 11021-037 | Dissolved in RPMI 1640, filter-sterilized |
Lymphocyte separation medium | Multicell | 305-010-CL | |
White luminometer plates | Promega | Z3291 | |
CS Macs separation columms | Miltenyi Biotech | 130-041-305 | |
VarioMacs separator | Miltenyi Biotech | 130-090-282 | |
Penicillin/Streptomycin solution | Wisent | 450-201-EL | |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
Cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.1830 | |
24-Well Cell Culture Plates | BD Falcon | 353047 | |
150 x 20 mm culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | |
M-CSF | Genscript | Z02001 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Human serum AB+ | Valley Biomedical | HP1022 | |
HBSS | Wisent | 311-505-CL | |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Luciferase Assay System | Promega | E1500 | |
Human red blood cells | Obtained purified from CHUL blood bank. |