Génération de l'homme cellules souches pluripotentes induites à partir de sang périphérique en utilisant le vecteur lentiviral STEMCCA

Résumé

Ici, nous montrons un protocole simple et efficace pour la génération de l'homme iPSCs de 3-4 ml de sang périphérique en utilisant un vecteur lentiviral unique reprogrammation. La reprogrammation des cellules sanguines facilement disponibles promet d'accélérer l'utilisation des technologies de l'iPSC en la rendant accessible à une communauté plus large de la recherche.

Résumé

Grâce à l'expression ectopique de quatre facteurs de transcription, Oct4, Klf4, Sox2 et cMyc, des cellules somatiques humaines peuvent être convertis en un état ​​pluripotent, générant des dites cellules souches pluripotentes induites (CISP) ^1-4. Spécifiques au patient iPSCs n'ont pas les préoccupations éthiques qui entourent les cellules souches embryonnaires (CSE) et permettrait de contourner possible rejet immunitaire. Ainsi, iPSCs ont attiré une attention considérable pour les études de modélisation des maladies, le dépistage de composés pharmacologiques et les thérapies régénératives ^5.

Nous avons montré la génération de transgène sans iPSCs humains de patients atteints de maladies pulmonaires différents en utilisant un seul soumis à l'accise polycistronique lentiviral cassette de cellules souches (STEMCCA) codant pour les facteurs de Yamanaka ^6. Ces lignes iPSC ont été générés par des fibroblastes de peau, le type cellulaire le plus couramment utilisé pour la reprogrammation. Normalement, l'obtention de fibroblastes nécessite une biopsie cutanée suivie d'une expansion de la cellules dans la culture de quelques passages. Surtout, un certain nombre de groupes ont rapporté la reprogrammation des cellules du sang périphérique en iPSCs ^7-9. Dans une étude, une version inductible Tet du vecteur a été utilisé STEMCCA ^9, qui exigeait que les globules d'être infectés simultanément par un lentivirus codant pour la forme constitutivement active inverse tétracycline transactivateur. En revanche pour les fibroblastes, les cellules sanguines périphériques peuvent être collectées via des procédures minimalement invasives, ce qui réduit considérablement l'inconfort et la détresse du patient. Un protocole simple et efficace pour la reprogrammation des cellules sanguines utilisant un vecteur unique constitutive soumis à l'accise peuvent accélérer l'application des technologies de l'iPSC en la rendant accessible à une communauté plus large de la recherche. En outre, une reprogrammation de cellules du sang périphérique permet de générer des iPSCs de personnes dans laquelle des biopsies de peau doit être évité (par exemple. Aberrante cicatrices) ou en raison de pathologies préexistantes preventiaccès ng de biopsies.

Ici nous démontrons un protocole pour la génération de iPSCs l'homme à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) en utilisant une seule floxé-soumis à l'accise vecteur lentiviral exprimant de manière constitutive les 4 facteurs. PBMC fraîchement récoltées ou décongelés sont développées pendant 9 jours, comme décrit dans l'acide ascorbique ^10,11 milieu contenant, SCF, IGF-1, IL-3 et de l'EPO avant d'être transduites avec le lentivirus STEMCCA. Les cellules sont ensuite étalées sur des MEF et de l'ESC-comme les colonies peuvent être visualisés de deux semaines après l'infection. Enfin, les clones sélectionnés sont développés et testés pour l'expression des marqueurs de la pluripotence SSEA-4, Tra-1-60 et Tra-1-81. Ce protocole est simple, robuste et très logique, en fournissant une méthodologie fiable pour la génération de l'homme iPSCs facilement accessible à partir de 4 ml de sang.

Protocole

1. L'isolement et l'expansion des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC)

JOUR 0

1. Dessin 4 ml de sang périphérique dans un tube BD Vacutainer CPT Préparation des cellules avec du citrate de sodium. Inverser le tube 8 à 10 fois et centrifuger à 1800 xg pendant 30 min à température ambiante. Idéalement, cette étape doit être effectuée dans les 2 heures de la collecte.
2. Recueillir les cellules mononucléaires (MC) à la pipette la couche leuco-plaquettaire (couche de cellules entre la barrière de gel et plasma) dans un tube de 15 centrifugation stérile ml conique. Amener le volume total de 10 ml avec stérile....

Résultats

Nous démontrons un protocole simple et efficace pour la génération de l'homme iPSCs de PBMC en utilisant un vecteur lentiviral unique. Figure 1A montre une représentation schématique du protocole. Le sang est recueilli dans des tubes BD Vacutainer CPT Préparation des cellules avec du citrate de sodium, et, après centrifugation, les cellules mononucléaires peuvent être collectées à partir de l'interface entre le gel de polyester et le plasma (buffy coat) (figure 1B). Les PBMC iso.......

Discussion

Nous décrivons ici l'utilisation du vecteur lentiviral STEMCCA de générer iPSCs humains à partir de cellules mononucléées isolées de quelques millilitres de sang périphérique fraîchement prélevé. Le protocole peut également être utilisé pour reprogrammer PBMC congelés (obtenu directement à partir de la couche leuco-plaquettaire), un détail d'importantes implications pratiques lors de l'utilisation des cellules du donneur acquises à partir d'un emplacement distant. Avant l'induction de la reprogrammat.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
BD Vacutainer CPT Tube Préparation des cellules avec du citrate de sodium	BD Biosciences	362760
QBSF-60 moyen de cellules souches	Qualité biologique	160-204-101
IMDM	Invitrogen	12440
DMEM/F12	Invitrogen	11330
FBS	Atlanta Biologicals	S10250
Remplacement Knockout Sérum	Invitrogen	10828
Primocin	Invivogen	ant-h-2
Pen / Strep	Invitrogen	15140
L-Glutamine	Invitrogen	25030
Non-acides aminés essentiels	Invitrogen	11140
β-mercaptoéthanol	MP Biomédical	190242
Acide ascorbique	Sigma	A4544
IGF-1	R & D Systems	291-G1
IL-3	R & D Systems	203-IL
EFC	R & D Systems	255-SC
OEB	R & D Systems	286-EP
Dexaméthasone	Sigma	D4902
Polybrène	Sigma	H-9268
bFGF	R & D Systems	233-FB
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
Cellule ES Sample Kit Marker	Millipore	SCR002