Summary
Qui mostriamo un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs umani da 3-4 ml di sangue periferico utilizzando un singolo vettore lentivirale riprogrammazione. La riprogrammazione delle cellule del sangue prontamente disponibili promette di accelerare l'utilizzo della tecnologia iPSC rendendola accessibile ad una comunità di ricerca più ampio.
Abstract
Attraverso l'espressione ectopica di quattro fattori di trascrizione, Oct4, Klf4, Sox2 e cMyc, cellule somatiche umane possono essere convertiti in uno stato pluripotente, generando le cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) 1-4. Paziente-specifici iPSCs mancano le preoccupazioni etiche che circondano le cellule staminali embrionali (ESC) e sarebbe possibile bypassare rigetto immunitario. Così, iPSCs hanno attirato molta attenzione per gli studi di modellazione delle malattie, la proiezione di composti farmacologici e terapie rigenerative 5.
Abbiamo dimostrato la generazione di iPSCs umani transgene-liberi da pazienti con malattie polmonari diverse utilizzando un unico soggetto ad accisa policistronica cassetta lentivirale Stem Cell (STEMCCA), che codifica i fattori Yamanaka 6. Queste linee IPSC sono stati generati da fibroblasti della pelle, il tipo cellulare più utilizzato per la riprogrammazione. Normalmente, ottenendo fibroblasti richiede una biopsia cutanea seguita da espansione della cellas in coltura per alcuni passaggi. Importante, una serie di gruppi hanno riportato la riprogrammazione di cellule del sangue periferico in iPSCs 7-9. In uno studio, una versione inducibile Tet del vettore STEMCCA stato impiegato 9, che ha richiesto le cellule del sangue per essere simultaneamente infettati con un lentivirus costitutivamente attivo codificante l'inverso transattivatore della tetraciclina. A differenza di fibroblasti, cellule del sangue periferico può essere smaltito attraverso procedure mini-invasive, riducendo notevolmente il disagio e la sofferenza del paziente. Un protocollo semplice ed efficace per la riprogrammazione delle cellule del sangue con un singolo vettore costitutivo soggetti ad accisa possono accelerare l'applicazione della tecnologia iPSC rendendola accessibile ad una comunità di ricerca più ampio. Inoltre, la riprogrammazione delle cellule del sangue periferico consente la generazione di iPSCs da individui in cui biopsie cutanee dovrebbero essere evitati (ad esempio. Aberrante cicatrici) oa causa di condizioni pre-esistenti malattie Preventiaccesso ng a biopsie.
Qui mostriamo un protocollo per la generazione di iPSCs umane da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) servendosi di un unico soggetto ad accisa floxed-vettori lentivirali costitutivamente esprimere i 4 fattori. PBMC freschi o scongelati vengono espanse per 9 giorni come descritto 10,11 in mezzo contenente acido ascorbico, SCF, IGF-1, IL-3 e EPO prima di essere trasdotte con il lentivirus STEMCCA. Le cellule vengono poi piastrate su MEF e ESC-colonie, come possono essere visualizzati due settimane dopo l'infezione. Infine, cloni selezionati sono espansi e testati per l'espressione dei marcatori pluripotenza SSEA-4, Tra-1-60 e Tra-1-81. Questo protocollo è semplice, robusto e altamente coerente, fornendo un metodo affidabile per la generazione di iPSCs umani facilmente accessibile da 4 ml di sangue.
Protocol
1. Isolamento ed espansione delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC)
GIORNO 0
- Disegnare 4 ml di sangue periferico in una provetta BD Preparazione Vacutainer CPT cellulare con citrato di sodio. La provetta 8 a 10 volte e centrifugare a 1800 xg per 30 min a temperatura ambiente. Idealmente, questo passo dovrebbe essere fatto entro 2 ore dal prelievo.
- Raccogliere le cellule mononucleate (MC) pipettando il buffy coat (strato di cellule di barriera tra il gel e plasma) in un tubo da centrifuga sterile 15 ml. Portare il volume totale di 10 ml con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), invertito diverse volte e centrifugare a 300 xg per 15 min.
- Risospendere le cellule in 10 ml di PBS sterile ed eseguire conta cellulare. Trasferire 1 a 2x10 6 cellule in una provetta da centrifuga sterile 15 ml conica e centrifugare a 300 xg per 10 min.
- Risospendere le cellule in 2 ml di mezzo di espansione (EM) (QBSF-60 cellule Medium Stem contenente 50 ug / ml AscoAcid rbic, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml di IL-3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 pM desametasone e 100 pg / ml primocin o 1% Pen / Strep) e trasferimento un pozzetto di una piastra da 12 pozzetti. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
- Centrifugare le cellule rimanenti a 300 x g per 10 min e congelare ~ 2x10 6 cellule / flacone contenente FBS al 10% DMSO.
- Per avviare il protocollo utilizzando PBMC congelato, scongelare 1 fiala di cellule in 10 ml di terreno QBSF e centrifugare a 300 xg per 10 min. Risospendere le cellule in 2 ml di EM e trasferire ad un pozzetto di una piastra da 12 pozzetti. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
GIORNO 3 e 6 ° GIORNO
- Trasferire le cellule ad una sterile 15 ml tubo conico e lavare bene una volta con 1 ml di QBSF-60 Media delle cellule staminali per raccogliere le cellule aderenti.
- Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min.
- Risospendere le cellule in 2 ml di EM e trasferire ad un pozzetto di un 12-Pozzetti. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
2. Trasduzione di PBMC con STEMCCA Lentivirus
GIORNO 9
- Trasferire le cellule ad una sterile 15 ml tubo conico e lavare bene una volta con 1 ml di QBSF-60 Media delle cellule staminali per raccogliere le cellule aderenti.
- Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min.
- Risospendere le cellule in 1 ml di EM fresco contenente 5 mg / ml di polibrene e STEMCCA lentivirus (MOI = 1 a 10) e di trasferimento ad un pozzetto di una piastra da 12 pozzetti. (Il protocollo che descrive la produzione di particelle lentivirali sono disponibili all'indirizzo http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
- Centrifugare la piastra a 2250 rpm a 25 ° C per 90 min.
- Dopo la rotazione, aggiungere un ulteriore 1 ml di EM freschi contenente 5 mg / ml di polibrene per un totale di 2 ml di terreno e incubare la piastra a 37 ° C,5% di CO 2 incubatore.
GIORNO 10
- Trasferire le cellule ad una sterile 15 ml tubo conico e lavare bene una volta con 1 ml di QBSF-60 Media delle cellule staminali per raccogliere le cellule aderenti.
- Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min.
- Risospendere le cellule in 2 ml di EM e trasferire a 1 pozzetto di una piastra da 12 pozzetti. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
3. Placcatura cellule trasdotte sul MEF
GIORNO 11
- Cappotto dei pozzetti di una piastra da 6 pozzetti con 0,1% di gelatina e fibroblasti di topo piastra inattivati embrionali (MEF) a 2x10 5 cellule / pozzetto in terreno MEF (IMDM contenente 10% FBS, 1% Aminoacidi non essenziali, 100 pM β- mercaptoetanolo, 2 mM L-glutammina, 100 pg / ml primocin o 1% Pen / Strep). Preparare 3 pozzetti per infezione.
GIORNO 12
- Trasferire le cellule ad una sterile 15 ml tubo conico e lavare il bene una volta con 1 ml di QBSF-60 Media delle cellule staminali per raccogliere le cellule aderenti.
- Risospendere le cellule in 3 ml di mezzo di MEF contenente 10 ng / ml bFGF, e l'acido ascorbico e fattori di crescita alle stesse concentrazioni come utilizzato in EM media (50 ug / ml di acido ascorbico, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 pM desametasone).
- Piastra 1 ml di cellule per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti contenente MEFs. Aggiungere 1,5 ml di MEF media con bFGF, acido ascorbico, e fattori di crescita per un totale di 2,5 ml di mezzo / e.
- Centrifugare la piastra a 500 rpm a 25 ° C per 30 min. Incubare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
GIORNO 14
- Cellule di alimentazione a giorni alterni con 2,5 ml di mezzo di MEF contenenti 10 ng / ml bFGF e 50 ug / ml di acido ascorbico (non fattori di crescita). Aspirare ed eliminare le cellule mobili con ogni feed.
- Aggiungi ulteriori MEF in base alle esigenze (di solito una volta alla settimana).
- Una volta che la comparsa di colonie, le cellule di alimentazione giornaliera con 2 ml di cellule staminali embrionali umane (hESC) medio (DMEM/F12 sostituzione contenente Knockout 20% siero, 1% amminoacidi non essenziali, 100 mM β-mercaptoetanolo, 2 mM L-Glutammina , 100 pg / ml primocin o 1% Pen / Strep e 10 ng / ml bFGF).
4. Raccolta ed espansione di cloni iPSC
~ DAY 30-40
- Selezionare ogni colonia in singoli pozzetti di un 12-pozzetti pre-seminato con MEF inattivato contenente 1 ml / pozzetto di media hESC più 10 pM di Stemolecule Y27632 (ROCK inibitore).
- Pasci le cellule quindi giornalmente con 1 ml di terreno hESC solo (senza inibitore ROCK).
5. Colorazione di immunofluorescenza per Marcatori pluripotenza
- La colorazione è stata eseguita utilizzando il kit "Cell ES Kit Marker campione" da Millipore e seguendo il protocollo del produttore.
6. Asportazione di Integnominale STEMCCA Vector
- Asportazione di riprogrammazione cassetta si ottiene utilizzando un Cre-IRES-Puro transfezione vettore che esprime seguendo e selezione puromicina breve come descritto 6.
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Representative Results
Dimostriamo un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs da PBMC umane utilizzando un singolo vettore lentivirale. Figura 1A mostra una rappresentazione schematica del protocollo. Il sangue viene raccolto in una provetta BD Preparazione Vacutainer CPT cellulare con citrato di sodio e, dopo centrifugazione, le cellule mononucleate possono essere raccolte dall'interfaccia tra il gel di poliestere e il plasma (buffy coat) (Figura 1B). Le PBMC isolate vengono espanse in coltura per 9 giorni. Figura 2 confronta PBMC al giorno 0 e 9 giorni, dimostrando che le cellule sono notevolmente divisione. Circa 10-15 giorni dopo la trasduzione con il lentivirus STEMCCA, comparsa di piccole colonie brillanti si osservano, con la morfologia delle colonie ancora non definito. Dopo l'aggiunta del mezzo hESC, hESC come colonie possono essere facilmente identificati (Figura 2D). Alcune di queste colonie sono meccanicamente raccolte, ampliato e caratterizzatoper l'espressione di marcatori pluripotenza come SSEA-4, Tra-1-60 e Tra-1-81 (Figura 3). Utilizzando un approccio di selezione breve puromicina 6, siamo in grado di ottenere sempre cloni IPSC transgene-libere come illustrato nella Figura 4.
Figura 1. Generazione di iPSCs umani da sangue periferico. A) Rappresentazione schematica del protocollo utilizzato per generare iPSCs umani da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) utilizzando il vettore STEMCCA. EM: media espansione; GF: Fattori di crescita; RBC: globuli rossi, MEF: Mouse fibroblasti embrionali; hESC: cellule staminali embrionali umane B) BD Vacutainer Tubo cellulare CPT preparazione con citrato di sodio utilizzato per la raccolta di sangue intero e la separazione. di cellule mononucleate. La separazione avviene durante la centrifugazione quando la barriera gel separa tegli cellule mononucleate e di plasma di componenti del sangue più dense. Dopo la centrifugazione, le cellule mononucleari e le piastrine può essere isolato da uno strato biancastro (buffy coat), appena sotto lo strato di plasma. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Immagini rappresentative della variazioni morfologiche delle cellule in tutto il protocollo. A) GIORNO 0: cellule mononucleate sono isolate da sangue periferico e coltivate in mezzo di espansione. . 20x B) 9 ° GIORNO: dopo l'espansione in coltura per 9 giorni, 'grappolo d'uva-come' gruppi di cellule si osservano (frecce), suggerendo che le cellule sono sane e proliferare, prima di essere trasdotte. Ingrandimento 20x C) Giorno 20:. Formazione di colonie si osserva una settimana dopo la ceLLS sono placcati su MEF. Ingrandimento 10x D) Giorno 30:. HESC-come colonie IPSC mostrano una morfologia tipica e sono pronti per la raccolta e l'espansione. Ingrandimento 4x.
Figura 3. Caratterizzazione di iPSCs umane generate dal sangue. Analisi di immunofluorescenza iPSCs generati da PBMC che mostrano l'espressione dei marcatori pluripotenza SSEA-4, Tra-1-60 e Tra-1-81. Le iPSCs anche una colorazione positiva per la fosfatasi alcalina (Alk Phos).
Figura 4. IPSCs Generazione di transgene senza iPSCs. Vengono trasfettate con un plasmidecoexpressing ricombinasi Cre e un gene di resistenza alla puromicina, come descritto in Somers et al, 2010. iPSCs A) prima della transfezione. B) La morte cellulare è stata osservata dopo due giorni di selezione C puromicina) emergono nuove colonie da cellule resistenti circa 10 giorni dopo la trasfezione . D) Alcune colonie sono raccolti e ampliato, e Southern Blot viene eseguita per confermare l'escissione del transgene. 1, 3, 5 e 7: cloni IPSC prima escissione, 2, 4, 6 e 8: cloni IPSC dopo escissione. Tutte le immagini a contrasto di fase con ingrandimento 4x.
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Discussion
Abbiamo qui descrivere l'uso del vettore lentivirale STEMCCA per generare iPSCs umani da cellule mononucleate isolate da pochi ml di sangue periferico raccolto di recente. Il protocollo può essere utilizzato anche per riprogrammare congelati (PBMC ottenute direttamente dal buffy coat), un particolare di implicazioni pratiche quando utilizza cellule donatrici acquisiti da un luogo distante. Prima dell'induzione di riprogrammazione, PBMC isolate deve subire una fase critica di espansione che rende una popolazione sana proliferazione di cellule più suscettibili di riprogrammazione nucleare. Ciò è facilmente osservabile dalla presenza di 'grappolo-come' gruppi di cellule alla espansione in condizioni di coltura ematopoietiche. Quando meno di 5x10 5 cellule trasdotte, le cellule possono essere piastrate su uno o due pozzetti di una piastra da 6 pozzetti contenente MEFs. Abbiamo sperimentato una certa variabilità nel tempo necessario per osservare hESC come colonie, in alcuni casi fino a 25 giorni post-trasduzione.L'uso di inibitori ROCK è critico per migliorare la sopravvivenza e l'efficienza di clonazione momento del ritiro emergenti colonie IPSC. Notevolmente e al contrario di quanto abbiamo osservato al momento del ritiro colonie di fibroblasti riprogrammati, praticamente il 100% delle colonie raccolte da PBMC riprogrammate stabiliscono cloni stabili IPSC che possono essere espansi e crioconservati. Infine, riteniamo che la semplicità della raccolta del campione combinato con l'approccio altamente efficiente e uniforme riprogrammazione qui descritti, rappresentano una piattaforma bona fide per applicazioni in cui un gran numero di cloni IPSC devono essere generati.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questi studi sono stati finanziati in parte dal NIH UO1HL107443-01 Premio per GJM e GM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercapt–thanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
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