Summary
ここでは、単一のレンチウイルスベクターを用いたプログラミング末梢血の3-4 mlから人間性IPSCの生成のためのシンプルで効果的なプロトコルを示しています。容易に入手可能な血液細胞の再プログラミングすることは、より広い研究コミュニティがアクセスすることによって、IPSCの技術の利用を促進することを約束します。
Abstract
4つの転写因子の異所性発現は、あるOct4、Klf4の、Sox2、およびCMYCを通して、人間の体細胞は、いわゆる人工多能性幹細胞（性IPSC）1-4を生成し 、多能性状態に変換することができます。患者固有性IPSCは、胚性幹細胞（ESC）を囲む、可能な免疫拒絶を回避したい倫理的な問題を欠いている。したがって、性IPSCは疾患モデル研究、薬理学的化合物のスクリーニング、及び再生治療5のためのかなりの注目を集めている。
私たちは、山中因子6をコードする単一のポリシストロン切除可能レンチ幹細胞カセット（STEMCCA）を使用して異なる肺疾患の患者から導入遺伝子を含まない人間性IPSCの発生を示している。これらIPSC行は皮膚線維芽細胞、再プログラムのために使用される最も一般的な細胞型から生成された。通常は、線維芽細胞を得ることがパンチ生検、細胞の膨張が続く肌を必要とするいくつかの通路のための文化の中での。重要なのは、グループの数は性IPSC 7月9日にヒト末梢血細胞の再プログラム化を報告している。ある研究では、STEMCCAベクトルのTet誘導性バージョンが血液細胞を同時にリバーステトラサイクリントランスアクチベーターをコードして恒常的に活性なレンチウイルスに感染していることが必要とされ、9を採用した。線維芽細胞とは対照的に、末梢血細胞が大幅に患者の不快感や苦痛を減らし、低侵襲の手順を介して収集することができます。構成単切除可能ベクターを用いて血液細胞を再プログラミングするためのシンプルで効果的なプロトコルは、より広範な研究コミュニティがアクセスすることによって、IPSC技術の応用を促進することがあります。さらに、末梢血細胞の再プログラミングすることは皮膚生検を回避すべきで個人からの性IPSCの生成ができるようになります（ すなわち 。瘢痕異常）または起因する既存の疾患状態preventiにパンチ生検にngのアクセス。
ここでは、構成的に4因子を発現する単一フロックス化、切除可能レンチウイルスベクターを用いた末梢血単核細胞（PBMC）から人間性IPSCの世代のためのプロトコルを示しています。 STEMCCAレンチウイルスで形質導入される前を含む培地アスコルビン酸、SCFは、IGF-1、IL-3およびEPOの10,11に記載されているように採取直後または解凍PBMCは9日間に展開されます。次いで、細胞をMEFの上にプレーティングとESCのようなコロニーが2週間後に感染可視化することができる。最後に、選択されたクローンを増殖させ、多能性マーカーSSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81の発現のためにテストされています。このプロトコルは、血液の容易にアクセス可能な4ミリリットルから人間性IPSCの生成のための信頼性のある方法論を提供し、シンプル、堅牢で非常に一貫しています。
Protocol
1。末梢血単核細胞（PBMC）の単離と拡大
0日目
- クエン酸ナトリウムのBDバキュテイナーCPTの細胞調製チューブに末梢血4mlを描く。チューブ8〜10回転倒し、室温で30分間1800×gで遠心分離します。理想的には、このステップは、採取後2時間以内に行う必要があります。
- 滅菌15mlコニカル遠心管に軟膜（ゲルバリアーとプラズマとの間の細胞層）をピペッティングにより単核細胞（MCS）を収集します。 15分間、300×gで数回、遠心反転、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で10mlに総量を持参してください。
- 滅菌した10mlのPBSに細胞を再懸濁し、細胞数を実行します。 10分間、300×gで滅菌15mlコニカル遠心管と遠心分離機に1〜2×10 6個の細胞を移す。
- 拡張培地2ml（EM）（50μg/ mlのASCOを含むQBSF-60幹細胞培地で細胞を再懸濁rbic酸、50 ng / mlで、SCF、10 ng / mlのIL-3、2 U / mlのEPOは、40 ng / mlで、IGF-1、1μMのデキサメタゾンおよび100μg/ mlのprimocinまたは1％ペニシリン/ストレプトマイシン）とに転送12ウェルプレートのウェル1。 5％CO 2インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートします。
- 300×で残った細胞を遠心 10％DMSOを含有FBS中で10分間凍結〜2×10 6細胞/バイアル用グラム。
- 凍結PBMCを使用して、プロトコルを起動するには、10分間、300×gでQBSF媒体および遠心分離機10mlに細胞の1バイアルを解凍します。 EMの2ミリリットル中に細胞を再懸濁し、12ウェルプレートの1ウェルに移す。 5％CO 2インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートします。
3日目、6日目
- 滅菌済み15 mlコニカルチューブに細胞を移し、付着細胞を収集するQBSF-60幹細胞培地1mlで一度よく洗ってください。
- 10分間300 xgで細胞を遠心分離します。
- EMの2ミリリットル中に細胞を再懸濁し、12の1つのウェルに移すウェルプレート。 5％CO 2インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートします。
2。 STEMCCAレンチウイルスによる末梢血単核細胞の形質導入
DAY 9
- 滅菌済み15 mlコニカルチューブに細胞を移し、付着細胞を収集するQBSF-60幹細胞培地1mlで一度よく洗ってください。
- 10分間300 xgで細胞を遠心分離します。
- 5ポリブレンとSTEMCCAレンチウイルスのμg/ mlの（MOI = 1から10）、12ウェルプレートのウェル1への転送を含む新鮮なEMの1ml中に細胞を再懸濁する。 （レンチウイルス粒子の産生を記述するプロトコルがで見つけることができますhttp://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ ）
- 90分間25℃で2250 rpmで皿回しをする。
- スピンした後、新鮮なEMの追加の1ミリリットルを追加 、2mlの培地の合計ポリブレンの5μg/ mlを含有し、37℃でプレートをインキュベート5％CO 2インキュベーター。
10日目
- 滅菌済み15 mlコニカルチューブに細胞を移し、付着細胞を収集するQBSF-60幹細胞培地1mlで一度よく洗ってください。
- 10分間300 xgで細胞を遠心分離します。
- EMの2ミリリットル中に細胞を再懸濁し、12ウェルプレートの1ウェルに移す。 5％CO 2インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートします。
3。メッキのMEFに形質導入細胞
11日目
- コート2×10 5細胞で0.1％のゼラチンと板不活性化されたマウス胚性線維芽細胞（MEF）を持つ/ウェルのMEF培地（IMDMを10％FBS、1％非必須アミノ酸を含む、100μMのβ-6ウェルプレートのウェルメルカプトエタノール、2mM L-グルタミン、100μg/ mlのprimocinまたは1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。感染当たり3ウェルを準備します。
12日目
- 滅菌済み15 mlコニカルチューブに細胞を移し接着した細胞を収集するQBSF-60幹細胞培地1mlで一度よく洗ってください。
- EM培地（50μg/ mlのアスコルビン酸、50 ng / mlのSCF、10 ng / mlのILで使用したのと同じ濃度で10 ng / mlのbFGFは、アスコルビン酸および成長因子を含むMEF培地3mlに細胞を再懸濁-3、2 U / mlのEPOは、40 ng / mlで、IGF-1、1μMデキサメタゾン）。
- MEFを含む6ウェルプレートのウェルあたりの細胞のプレート1ミリリットル。 /ウェルの培地を2.5mlの合計のためのbFGF、アスコルビン酸、および増殖因子とMEF培地の1.5 mlを加える。
- 25℃で500rpmで皿回しをする℃で30分間。 37℃、5％CO 2インキュベーター中で静置します。
14日目
- 10 ng / mlのbFGFおよび50μg/ mlのアスコルビン酸（無成長因子）を含むのMEF培地2.5 mlで一日おきに細胞を養う。各フィードで浮遊細胞を吸引して廃棄します。
- （通常週1回）、必要に応じて追加のMEFを追加します。
- かつて小さなコロニーが送り細胞がヒト胚性幹細胞（hESCの）培地（DMEM/F12含む20％ノックアウト血清代替、1％非必須アミノ酸、100μMのβ-メルカプトエタノール、2mMのL-グルタミンの2ミリリットルとの毎日、現れる、100μg/ mlのprimocinまたは1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10 ng / mlのbFGF）の。
4。ピッキングとIPSCクローンの拡大
〜DAY 30から40
- 12ウェルプレート不活性化されたMEFを含む1ml /ウェルのhESCの培地プラスStemolecule Y27632の10μM（ROCK阻害剤）との事前作成の個々のウェルに各コロニーを拾う。
- 唯一のhESC培地1ml（NO ROCK阻害剤）で、その後毎日の細胞を養う。
5。多能性マーカーのための免疫蛍光染色
- 染色はミリポアキット "ES細胞マーカーサンプルキット"を使用し、製造業者のプロトコールに従って行った。
6。 INTEGの切除格STEMCCAベクトル
- カセットを再プログラミングの切除は、Cre-IRES-Puroの発現ベクターをトランスフェクション後および6に記載されているように簡単なピューロマイシンによる選択を利用して達成されています。
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Representative Results
我々は、単一のレンチウイルスベクターを用いた末梢血単核細胞から人間性IPSCの生成のためのシンプルで効果的なプロトコルを示しています。 図1Aは、プロトコルの略図を示す。血液はクエン酸ナトリウムとBDバキュテイナーCPTの細胞調製チューブに採取し、遠心分離後、単核細胞はポリエステルゲルと血漿（バフィーコート）（ 図1B）との間のインターフェースから収集することができる。孤立したPBMCを、9日間培養で増殖されています。 図2は、細胞が顕著に分裂していることを示す、0日目と9日目のPBMCを比較します。 STEMCCAレンチウイルスで約10-15日後の伝達、小さな明るいコロニーの外観はまだ未定義のコロニー形態と、観察される。 hESCの培地を添加した後、hESCの様コロニーを簡単に（ 図2D）を同定することができる。これらのコロニーの一部は機械的に、拾っ拡大と特徴付けられるこのような、SSEA-4、TRA-1-60とTRA-1-81（ 図3）のような多能性マーカーの発現のために。短いピューロマイシン選択アプローチ6を使用して 、我々は、 図4に示すように一貫して導入遺伝子フリーIPSCクローンを取得することができます。
図1。末梢血から人間性IPSCの世代。 STEMCCAベクターを用いた末梢血単核細胞（PBMC）から人間性IPSCを生成するために使用されるプロトコルのA）の模式図。 EM：拡張ミディアム、GF：成長因子; RBC：赤血球、MEF：マウス胚線維芽細胞;たhESC：ヒト胚性幹細胞、全血の収集と分離のために使用されるクエン酸ナトリウムとB）は 、BDバキュテイナーCPTの細胞調製チューブ単核細胞の。ゲル障壁がtを分離する際の分離は遠心分離の間に発生彼より密度の高い血液成分から単核細胞および血漿。遠心分離した後、単核細胞と血小板はちょうどプラズマ層の下に白っぽい層（軟膜）から単離することができる。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。プロトコル全体の細胞の形態変化の代表的な画像。 A）は 0日目：単核細胞を末梢血から単離され、増殖培地で培養される。 20倍の倍率は、B）9日目：9日間の培養で拡大した後、細胞のクラスター'ブドウの房のような'が導入される前の細胞が健全であることを示唆していると増殖（矢印）が観察される。 20倍の倍率C）は 20日目：コロニー形成はCE一週間後に観察されるLLSはMEFの上にメッキされています。 10倍の倍率D）は 30日目：。IPSCコロニーは典型的な形態を示し、ピッキングと拡大のための準備が整いましたhESCのよう。 4倍。
図3。血液から生成された人間性IPSCのキャラ。多能性マーカーSSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81の発現を示すPBMCから生成された性IPSCの免疫蛍光分析。性IPSCはまた、アルカリホスファターゼ（ALKフォス）陽性染色。
図4。導入遺伝子フリー性IPSCの世代。性IPSCがプラスミドでトランスフェクトされる共発現Creリコンビナーゼおよびピューロマイシン耐性遺伝子、サマーズら 、2010に記載されているよう。）トランスフェクションの前に性IPSC。B）細胞死は、ピューロマイシン選択Cの2日後に観察される）新コロニーは、トランスフェクション後10日前後耐性細胞から出てくる、D）いくつかのコロニーを採取し、拡大し、サザンブロットは、導入遺伝子の切除を確認するために行われている。 1、3、5、7：IPSC切除前にクローン; 2、4、6、8：切除後IPSCクローン。 4倍の倍率で、すべての位相コントラスト像。
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Discussion
我々は、ここたて採取した末梢血数ミリリットルから単離された単核細胞から人間性IPSCを生成するためにSTEMCCAレンチウイルスベクターの使用を記載している。遠い場所から取得されたドナー細胞を利用する際のプロトコルはまた、重要な実用的な含意の詳細（バフィーコートから直接取得した）凍結PBMCを再プログラムするために使用することができます。プログラミングの誘導前に、隔離されたPBMCは核初期化により適した細胞の健全な増殖人口をレンダリングクリティカル拡張ステップを経る必要があります。これは簡単に造血培養条件の拡大に応じて細胞のクラスター 'ブドウの房のような'の存在によって観察される。未満、5×10 5個の細胞を形質導入された場合、細胞はMEFを含む6ウェルプレートの1つまたは2つのウェル上にメッキすることができる。私たちは、25日後に形質導入にいくつかのケースでは、hESCの様コロニーを観察するのに必要な時間内にいくつかの変動を経験している。ROCK阻害剤の使用は新興IPSCコロニーのピッキング時の生存率とクローニング効率を高めることが重要です。驚くべきことに、再プログラム線維芽細胞からのコロニーを選ぶとき、私たちが観察したこととは対照的に、拡張され、凍結保存することができる安定したIPSCクローン確立再プログラムPBMCからの厳選された植民地のほぼ100％。最後に、我々は本明細書に記載され、非常に効率的かつ一貫性のあるプログラミングアプローチと組み合わせるサンプルコレクションのシンプルさは、IPSCのクローンが大量に生成される必要があるアプリケーションのための善意のプラットフォームを表していることを信じています。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
これらの研究は、GJMとGMへのNIH UO1HL107443-01賞によって部分的に資金を供給した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercapt–thanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
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