Summary
Здесь мы покажем простой и эффективный протокол для генерации ИПСК человека с 3-4 мл периферической крови с помощью одной лентивирусов вектор перепрограммирования. Перепрограммирование доступны клеток крови обещает ускорить использование ИПСК технологий, сделав их доступными для более широкого научного сообщества.
Protocol
1. Выделение и расширение мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК)
День 0
- Нарисуйте 4 мл периферической крови в BD Vacutainer CPT сотовых Подготовка труб с цитрат натрия. Обратить трубки 8 до 10 раз и центрифуге при 1800 мкг в течение 30 мин при комнатной температуре. В идеале, этот шаг должен быть сделано в течение 2 часов после сбора.
- Сбор мононуклеарных клеток (ТК) с помощью пипетки Баффи пальто (слой клеток между гелем барьер и плазма) в стерильный 15 мл коническую трубку центрифуги. Принесите общим объемом до 10 мл стерильной фосфатно-солевом буфере (PBS), переверните несколько раз, и центрифуги при 300 х г в течение 15 мин.
- Ресуспендируют клеток в 10 мл стерильной PBS и выполнять клеток. Передача от 1 до 2х10 6 клеток в стерильную 15 мл коническую трубку центрифуги и центрифугируют при 300 х г в течение 10 мин.
- Ресуспендируют клеток в 2 мл расширение среды (EM) (QBSF-60 Stem Cell среде, содержащей 50 мкг / мл AscoRBIC кислота, 50 нг / мл SCF, 10 нг / мл IL-3, 2 ед / мл EPO, 40 нг / мл IGF-1, 1 Дексаметазон мкМ и 100 мкг / мл primocin или 1% Pen / Strep) и передать одну лунку в 12-луночный планшет. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.
- Центрифуга оставшиеся клетки при 300 х г в течение 10 мин и заморозить ~ 2x10 6 клеток / флакон в FBS, содержащей 10% ДМСО.
- Чтобы начать протокол, используя замороженные РВМС, оттаивать 1 флакон клеток в 10 мл QBSF среднего и центрифуги при 300 х г в течение 10 мин. Ресуспендируют клеток в 2 мл ЭМ и трансфер в одну лунку в 12-луночный планшет. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.
ДЕНЬ 3 и 6 день
- Передача клетки в стерильный 15 мл коническую трубку и промыть хорошо, как только с 1 мл QBSF-60 Stem Cell Средний собирать прилипшие клетки.
- Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 10 мин.
- Ресуспендируют клеток в 2 мл ЭМ и трансфер в одну лунку в 12-Луночный планшет. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.
2. Transduction МНПК с STEMCCA лентивирус
День 9
- Передача клетки в стерильный 15 мл коническую трубку и промыть хорошо, как только с 1 мл QBSF-60 Stem Cell Средний собирать прилипшие клетки.
- Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 10 мин.
- Ресуспендируют клеток в 1 мл свежей EM, содержащий 5 мкг / мл полибрен и STEMCCA лентивирус (MOI = 1 до 10) и трансфер в одну лунку в 12-луночный планшет. (Протокол описания производства лентивирусные частиц можно найти на http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
- Побочные пластины на 2250 оборотов в минуту при 25 ° C в течение 90 мин.
- После спина, добавить дополнительно 1 мл свежего EM , содержащий 5 мкг / мл полибрен на общую сумму 2 мл среды и инкубировать пластины в 37 ° C,5% СО 2 инкубатора.
ДЕНЬ 10
- Передача клетки в стерильный 15 мл коническую трубку и промыть хорошо, как только с 1 мл QBSF-60 Stem Cell Средний собирать прилипшие клетки.
- Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 10 мин.
- Ресуспендируют клеток в 2 мл ЭМ и передавать на 1 лунку в 12-луночный планшет. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.
3. Покрытие трансдуцированных клеток на MEFs
ДЕНЬ 11
- Пальто скважины 6-луночный планшет с 0,1% желатина и пластины инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) на 2x10 5 клеток / лунку в MEF среды (IMDM, содержащей 10% FBS, 1% Non-незаменимые аминокислоты, 100 мкМ β- меркаптоэтанол, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг / мл primocin или 1% Pen / Strep). Подготовка 3 скважины на инфекцию.
ДЕНЬ 12
- Передача клетки в стерильный 15 мл коническую трубку и промыть хорошо, как только с 1 мл QBSF-60 Stem Cell Средний собирать прилипшие клетки.
- Ресуспендируют клеток в 3 мл MEF среде, содержащей 10 нг / мл шФРФ, а также аскорбиновая кислота и факторов роста в тех же концентрациях, используемых в EM среды (50 мкг / мл аскорбиновой кислоты, 50 нг / мл SCF, 10 нг / мл IL -3, 2 ед / мл EPO, 40 нг / мл IGF-1, 1 мкМ дексаметазон).
- Plate 1 мл клеток на лунку 6-луночный планшет, содержащий MEFs. Добавить 1,5 мл MEF сред с шФРФ, аскорбиновая кислота, и факторы роста на общую сумму в 2,5 мл среды / лунку.
- Побочные пластины на 500 оборотов в минуту при 25 ° С в течение 30 мин. Инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.
ДЕНЬ 14
- Поток клеток каждый день с 2,5 мл среды MEF, содержащий 10 нг / мл шФРФ и 50 мкг / мл Аскорбиновая кислота (без факторов роста). Аспирируйте и выбросить плавающие клетки с каждого канала.
- Добавить дополнительные MEFs по мере необходимости (обычно раз в неделю).
- Как только появляются небольшие колонии, корма клетки ежедневно с 2 мл человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), средний (DMEM/F12, содержащей 20% сыворотки Knockout замена, 1% Non-незаменимые аминокислоты, 100 мкМ β-меркаптоэтанол, 2 мМ L-глутамина , 100 мкг / мл primocin или 1% Pen / Strep и 10 нг / мл шФРФ).
4. Комплектование и расширение ИПСК клонов
~ 30-й день - 40
- Возьмите каждую колонию в отдельных скважинах из 12-луночный планшет предварительно высевали с инактивированной MEFs, содержащий 1 мл / лунку чЭСК средний плюс 10 мкМ Stemolecule Y27632 (ROCK ингибитор).
- Поток клетки далее ежедневно по 1 мл чЭСК только среду (без ингибиторов ROCK).
5. Иммунофлуоресцентного окрашивания для маркеров плюрипотентности
- Окрашивание производится с помощью комплекта "ES сотовых Маркер Sample Kit" от Millipore и следуя протоколу производителя.
6. Иссечение INTEGНоминальная STEMCCA векторного
- Иссечение перепрограммирования кассеты достигается использованием Cre-IRES-Puro выразить вектор после трансфекции и небольшая подборка Пуромицин, как описано 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы демонстрируем простой и эффективный протокол для генерации ИПСК человека от МПК с использованием одного лентивирусов вектор. Рисунок 1А показывает схематическое представление протокола. Кровь собирали в BD Vacutainer CPT сотовых Подготовка труб с цитрат натрия, и после центрифугирования, мононуклеары могут быть собраны из интерфейса между гелем полиэстера и плазмы (лейкомассы) (рис. 1б). Изолированной PBMCs затем разложить в культуре в течение 9 дней. Рисунок 2 сравнивает PBMCs в день 0 и 9-й день, показывая, что клетки заметно деления. Примерно 10-15 дней после трансдукции лентивирус STEMCCA, появление мелких ярких колониях наблюдается, с еще не определены морфологии колонии. После добавления чЭСК среды, ЭСК-подобных колоний могут быть легко идентифицированы (рис. 2D). Некоторые из этих колоний механически взял, расширены и характеризуютсядля выражения плюрипотентных маркеров, таких как SSEA-4, Тра-1-60 и TRA-1-81 (рис. 3). Использование кратких подхода к отбору Пуромицин 6, мы имеем возможность постоянно получать трансгенных без ИПСК клонов, как показано на рисунке 4.
Рисунок 1. Генерация человека ИПСК из периферической крови. А) Схематическое изображение протокол, используемый для получения ИПСК человека из мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) с помощью вектора STEMCCA. Е.М.: Расширение среды; GF: факторы роста; РБК: красные кровяные клетки MEF: мышиных эмбриональных фибробластов; чЭСК: человеческих эмбриональных стволовых клеток B) BD Vacutainer CPT сотовых Подготовка труб с цитрат натрия, используемые для сбора цельной крови и разделение. мононуклеарных клеток. Разделение происходит во время центрифугирования, когда гель барьер отделяет тОн мононуклеарных клеток и плазмы из компонентов плотнее крови. После центрифугирования мононуклеарных лейкоцитов и тромбоцитов может быть изолирован от беловатого слоя (лейкомассы) только под слой плазмы. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Представитель изображения морфологических изменений клеток по всему протокола. А) День 0: мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови и культивировали в расширении среды. . 20x увеличением B) День 9: после расширения в культуре в течение 9 дней, «гроздь винограда, как« скопления клеток наблюдается (стрелки), предполагая, что клетки здоровой и пролиферирующих перед трансдуцированных. 20x увеличение C) День 20:. Образованию колоний наблюдается через неделю после сеООО высевают на MEFs. 10-кратное увеличение D) ДЕНЬ 30:. ЭСК-подобных колоний ИПСК показать типичной морфологией и готовы для сбора и расширения. 4x увеличение.
Рисунок 3. Характеристика человека ИПСК, полученные от крови. Иммунофлуоресценции анализ ИПСК, полученные от МПК показывает выражение маркеров плюрипотентности SSEA-4, Тра-1-60 и Тра-1-81. ИПСК также положительную окраску для щелочной фосфатазы (Alk Phos).
Рисунок 4. Поколение трансгенов без ИПСК. ИПСК трансфицируют плазмидыcoexpressing Cre рекомбиназой и пуромицин ген устойчивости, как описано в Сомерс и др., 2010.) ИПСК до трансфекции. B) гибель клеток наблюдается после двух дней пуромицин выбора C) Новые колонии выходят из устойчивых клеток около 10 дней после трансфекции . D) Некоторые колонии взял и расширили, и Саузерн-блоттинга проводится для подтверждения удаления трансгена. 1, 3, 5 и 7: ИПСК клонов до удаления, 2, 4, 6 и 8: ИПСК клонов после удаления. Все фазового контраста изображения на 4х увеличением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы здесь описывать использование вектора STEMCCA лентивирусов для получения ИПСК человека из мононуклеарных клеток, выделенных из нескольких миллилитров свежесобранных периферической крови. Протокол также может быть использован для перепрограммирования замороженные РВМС (полученные непосредственно из светлого сгустка крови), подробно значительные практические последствия при использовании донорских клеток, приобретенные у расстоянии. Перед индукцией перепрограммирования, изолированных МПК должен пройти важный шаг расширения, что делает здоровый пролиферирующих популяции клеток, более склонны к ядерному перепрограммирования. Это легко заметить по наличию «гроздь винограда, как« скопления клеток при расширении в кроветворных условиях культуры. Когда меньше, чем 5x10 5 клеток трансдуцированных, клетки могут быть помещены на одну или две скважины 6-луночный планшет содержащие MEFs. Мы испытали некоторую изменчивость во времени необходимо соблюдать ЭСК-подобных колоний, в некоторых случаях до 25 дней после трансдукции.Использование ингибиторов ROCK имеет решающее значение для повышения выживаемости и эффективности клонирования при выборе новых ИПСК колонии. Примечательно и в отличие от того, что мы наблюдали при выборе колоний от перепрограммировать фибробласты, практически 100% выбрали колоний от перепрограммировать PBMCs установить стабильные клоны ИПСК, который может быть расширен и криоконсервации. Наконец, мы считаем, что простота пробы в сочетании с высокоэффективной и последовательной перепрограммирования подход, описанный в настоящем документе, являются добросовестными платформой для приложений, в которых большое количество клонов ИПСК должны быть получены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эти исследования были частично финансируется за счет NIH UO1HL107443-01 Награда GJM и GM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercapt–thanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).
- Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21, 518-529 (2011).
- vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).
