Denne protokol beskriver en eksperimentel procedure for udførelse af fluorescens<em> In situ</em> Hybridisering (FISH) til optælling mRNA i enkelte celler på single-molekyle opløsning.
Den Fluorescens in situ hybridisering (FISH) metode gør det muligt at detektere nukleinsyrer i det native cellulære miljø. Her giver vi en protokol for at bruge FISH at kvantificere antallet af mRNA i enkelte gærceller. Celler kan dyrkes i enhver tilstand af interesse og derefter fikseret og gjort permeable. Efterfølgende flere single deoxyoligonucleotider konjugeret til fluorescerende farvestoffer anvendes til at mærke og visualisere mRNA. Diffraktionsbegrænset fluorescens fra enkelt mRNA molekyler kvantificeres ved hjælp af et spot-afsløring algoritme til at identificere og tælle antallet af mRNA per celle. Mens de mere standardiserede kvantificering metoder nordlige blots, RT-PCR og genekspression microarrays giver oplysninger om gennemsnitlige mRNA i tørlastmarkedet befolkning, FISH letter både optælling og lokalisering af disse mRNA i enkelte celler på single-molekyle opløsning.
Bruger bulk måleteknikker, er det ikke muligt at analysere antallet af transkripter eller transkriptionel aktivitet inden enkeltceller 1.. Brug fluorescerende proteiner drevet af initiativtagerne af interesse som indberettere af genekspression kan løse dette problem til en vis grad, men den tid der kræves for fluorescerende proteiner til at folde tilslører tidlige dynamik. Langlivede fluorescerende proteiner også kan ikke rapportere mRNA levetid. FISH metode kan anvendes til at analysere mRNA under sin fuldstændige livscyklus, fra transkriptionsinitiering i kernen til efterfølgende modning og forfald i enkelte celler, med enkelt-molekyle opløsning.
Den originale in situ eksperimenter til at visualisere nukleinsyrer anvendt radiomærkede RNA-prober til sonde DNA-elementer. Disse omfattede visualisere ribosomale DNA i æggestokkene af frøen Xenopus laevis 2 og satellit DNA i musevæv 3.. Den første fluorescerende in situ experprøv dig frem brugt et RNA-molekyle mærket med en fluorofor at sonden bestemte DNA-sekvenser 4.. Den første anvendelse af fluorescerende prober til visualisering RNA in situ var visualiseringen af actin genekspression i kylling muskelvæv kultur 5.. For nylig, i spirende gær, er FISH blevet anvendt til at undersøge svingninger i transkription under gær metaboliske cyklus 6, henfaldet af mRNA'er under cellecyklusprogression 7, og rumlig lokalisering af mRNA-transkripter under mitose 8.. FISH er blevet anvendt i gær til at vise at ukorrelerede udsving i konstitutivt transkriberede gener, som udgør mere end halvdelen af alle gærgener, skyldes ukorrelerede transkriptionsinitiering 9.. I ikke-gær arter, er FISH blevet brugt til at identificere stamcelle markører i mus tarmen 10 og at fastslå, at ufuldstændig penetrans af celleskæbner kan skyldes stokastiske genekspression udsving i C.elegans embryoner 11..
FISH her beskrevne virker ved hybridisering farvning-mærkede, enkeltstrengede DNA-sonder til mRNA meddelelser. Celler afbildes og mRNA'er tælles ved hjælp af en plet-afsløring algoritme. Enkeltstrengede prober kan genereres med et DNA-synteseapparat og derefter mærket (her benævnt Singer prober) eller bestilt kommercielt som præ-mærkede prober (Stellaris prober) 12,13. En væsentlig forskel mellem sanger og Stellaris sonder er, at Singer sonder er længere (~ 50 bp) og er multi-mærket, mens Stellaris sonder er korte (~ 20 bp) med kun én etiket pr probe, som beskrevet af Raj et al 14.. Derudover Stellaris fremgangsmåde bruger mange flere prober per gen end det af Singer (~ 30 versus 5 prober per gen, henholdsvis). Nedenfor giver vi en protokol, der beskriver brugen af begge typer probe. I afsnit 2 giver vi en protokol til mærkning amino-allyl thymidin-holdige sonder wed en udvalgt Cy farvestof. En oversigt over de beregningsmæssige trin, der kræves for at identificere en enkelt mRNA spots findes i afsnit 7..
Til dato har FISH primært været lav-throughput metode. Anvendelsen af Cy3, Cy3.5, og Cy5 farvestoffer begrænser antallet af gener kan man undersøge i enkelte celler til tre ad gangen. Nogle yderligere sonder er blevet udviklet (Stellaris), men antallet af skelnelige prober er stadig højst syv. For at omgå denne begrænsning, har kombinatoriske mærkning strategier via multiple fluorforer blevet brugt til at skabe stregkoder for forskellige mRNA arter 19,20. Senest brugte Lübeck og Cai optisk og spektral barcoding at kvantificere 32 forskellige arter samtidigt med fisk i enkelte gærceller 19. En begrænsning af denne nylige kombinatorisk tilgang er det kræver anvendelse af super-opløsning mikroskopi. Analysen er nødvendig for at adskille de stregkodede prober er også ganske kompleks.
Vi har fundet, at Cy3 og Cy3.5 er at foretrække frem Cy5 for fisk eksperimenter. En af de begrænsninger af Cy5 farvestoffet er dens følsomhedat fotoblegning. Imidlertid har Stellaris nylig udviklet Cy5 varianter, der er annonceret som mere modstandsdygtige over for fotoblegning, og kan afhjælpe dette tekniske spørgsmål. Det er også værd at bemærke, at fisk er en dyr metode til at gennemføre, og at både sanger og Stellaris sonder typisk koste $ 700 – $ 1.000 pr sonde sæt, selv om priserne for kommercielt tilgængelige sonder skal falde i fremtiden. Sparsom af reagenser og effektiv mærkning bringer Singer sonder ned til den nedre ende i pris.
En af de store tekniske udfordringer er adskillelsen af enkelte versus multiple sonde spots, som kræver gennemførelse af avancerede spot-bestemmende algoritmer. Dette kan tage omfattende manuel gennemgang at tune billedet analyseparametre til specifikke forsøgsopstillinger. En oversigt over vores beregningsmæssige pipeline med relevante MATLAB funktioner findes i afsnit 7 i protokollen. Dette spørgsmål er noget lindres ved de Stellaris prober, som kun har én etiket pr sonde. Det kræver derfor colokalisering af multiple sonder at se et signal.
Fordi FISK nødvendiggør fastsættelse celler, betyder det ikke lette sporing af individuelle celler over tid. Tidligere brugte vi FISH snapshot data til at rekonstruere dynamikken i genekspression i de enkelte metabolisk cykling gær befolkninger 6.. Metabolisk cykling er observeret i pre-udsultede, kontinuerlige kulturer og er kendetegnet ved brede befolkning kollektive svingninger i iltforbrug. Disse svingninger er forbundet med genom-dækkende svingninger af transkripter, der opstår for halvdelen af alle gærgener i forskellige faser af iltforbrug. Vi har forsøgt at bestemme, om metabolisk cykling var til stede i usynkroniserede kontinuerlige gærkulturer. Hvis til stede, bør transkripter, der er anti-korreleret i synkrone populationer også være anti-korreleret i usynkroniserede enkelte celler, og omvendt for korrelerede transkripter.
ent "> At rekonstruere dynamik af mRNA produktion i gang, skal de observerede snapshot data sammenlignes med, hvad der forventes af en model af den underliggende adfærd. Der er teoretiske begrænsninger når sådanne" snapshots "af genekspression data kan anvendes til at bestemme den underliggende genekspression dynamik og hvilke slags modeller kan skelnes 21.. For de metaboliske cyklus data, snarere end direkte viser tilstedeværelsen af tidsmæssige svingninger blev statistiske målinger gennemført for at dokumentere, at der rent faktisk er en celleautonome oscillerende program i overensstemmelse med bulk microarray målinger.The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af tilskud GM046406 (DB) og af National Institute of General Medical Sciences Center for Quantitative Biology (GM071508). RSM anerkender midler fra NSF Graduate Research Fellowship. MNM understøttes af en Lewis-Sigler Fellowship. Vi vil gerne anerkende medlemmerne af Botstein laboratorium for nyttige diskussioner og den tidligere medlemmer Allegra Petti og Nikolai Slavov for deres bidrag til den metaboliske cyklus-projektet. Vi takker Daniel Zenklusen og Robert Singer for at få os i gang med FISH-metoden.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Vanadyl Ribonucleoside Complex | NEB | S1402S | |
Lyticase | Sigma | L5263 | |
E. coli tRNA | Roche | 1010954001 | |
BSA (RNase free) | Ambion | ||
Beta-mercaptoethanol | Fisher | 03446l | |
DAPI, dilactate | Sigma | D9564 | |
PBS 10X (RNase free) | Ambion | AM9624 | |
Triton X-100 | Shelton Scientific | ||
Dextran sulfate | Sigma | D6001 | Or equivalent |
Saline-sodium citrate (SSC) 20X | VWR | 82021-484 | |
Formamide (deionized) | Ambion | AM9342 | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
Alpha-D-glucose | Sigma | 158968 | For GLOX solution |
1 M Tris-HCl, pH 8.0 | Ambion | AM9855G | |
100% Ethanol | |||
Glucose oxidase | Sigma | G0543 | For GLOX solution |
Catalase | Sigma | C3155 | For GLOX solution |
Concanavalin A | MP Biomedicals | 150710 | |
Polylysine (0.01%) | Sigma | P8920 | |
Coverslips | Warner Instruments | Cs-18R15 | |
Prolong Gold Mounting Medium | Invitrogen | P36934 | |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | QIAGEN | 28304 | |
FISH Probes | Biosearch Technologies | Custom order for your desired mRNA sequence | |
Glass bottom 96-well plates | Nunc | 265300 | Alternative to coverslips |
12-well plates | BD Falcon | 351143 | |
Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes | GE Healthcare | monofunctional NHS-ester | |
EQUIPMENT | |||
Plasma-Preen I Cleaner | Terra Universal | 9505-00 | Controller (Cat #9505-17 optional) |
Vacuum Pump | Alcatel | 205SDMLAM | For operating Plasma-Preen |
Widefield Fluorescence Microscope | Olympus | IX81 | Or equivalent |
100X objective | Olympus | 1-UB617R | |
Light Source | X-Cite | XCT 10-A | Or equivalent |
Filter Sets | Chroma | U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR. | |
Cooled CCD or EMCCD Camera | Hamamatsu | C4742-98-24ER |