Denne protokollen beskriver en eksperimentell prosedyre for å utføre Fluorescens<em> In situ</em> Hybridisering (FISH) for telling mRNA i enkeltceller på enkelt-molekyl oppløsning.
Fluorescens in situ hybridisering (FISH)-metoden gjør det mulig å detektere nukleinsyrer i den innfødte cellulære miljø. Her gir vi en protokoll for bruk av FISH å tallfeste antall mRNA i enkle gjærceller. Cellene kan dyrkes i en hvilken som helst tilstand av interesse og deretter fiksert og gjort gjennomtrengelig. Deretter er flere single-strandet deoxyoligonucleotides konjugert til fluorescerende fargestoffer brukes til å merke og visualisere mRNA. Diffraksjon-begrenset fluorescens fra enkelt mRNA molekyler kvantifiseres ved hjelp av en spot-algoritme for å identifisere og telle antall mRNA per celle. Mens de mer vanlige kvantifisering metoder for nordlige blotter, RT-PCR og genuttrykk microarrays gir informasjon om gjennomsnittlig mRNA i bulk befolkningen, letter FISH både telling og lokalisering av disse mRNA i enkeltceller på enkelt-molekyl oppløsning.
Ved hjelp av bulk måleteknikker, er det ikke mulig å analysere antallet transkripter eller transkripsjonelle aktivitet innen enkeltceller en. Ved hjelp av fluoriserende proteiner drevet av arrangører av interesse som journalister av genuttrykk kan løse dette problemet til en viss grad, men den tiden som kreves for fluorescerende proteiner for å kaste tilslører tidlig dynamikk. Langlivede fluorescerende proteiner kan heller ikke rapportere mRNA levetid. FISH metode kan anvendes for å bestemme mRNA under sin livssyklus, fra transkripsjons-initierings i kjernen til påfølgende modning og forråtnelse i enkle celler, med enkelt-molekyl oppløsning.
Den opprinnelige in situ eksperimenter for å visualisere nukleinsyrer brukt radiomerket RNA prober å sondere DNA-elementer. Disse inkluderte visualisere ribosomal DNA i eggstokkene av frosken Xenopus laevis 2 og satellitt DNA i mus vev tre. Den første fluorescerende in situ kompetanseiment brukt et RNA molekyl som er merket med en fluorofor å sondere bestemte DNA-sekvenser fire. Den første søknaden av fluorescerende prober for å visualisere RNA in situ var visualisering av aktin genuttrykk i kylling muskelvev kultur fem. Mer nylig, i spirende gjær, har fisken har vært brukt til å undersøke oscillasjoner i transkripsjon under gjær metabolske syklus 6, nedbrytning av mRNA under cellesyklusprogresjon 7, og romlig lokalisering av mRNA transkripter i løpet av mitose 8.. FISH har vært brukt i gjær å vise at ukorrelerte svingninger i constitutively transkriberte gener, som utgjør mer enn halvparten av alle gjær gener, oppstår fra uncorrelated transkripsjon initiering ni. I ikke-gjær arter, har FISH blitt brukt til å identifisere stamcelletransplantasjon markører i musen tarmen 10 og for å fastslå at ufullstendig penetrans av celle skjebner kan skyldes stokastiske genuttrykk svingninger i C.elegans embryoer 11.
FISH metoden beskrevet her fungerer ved hybridizing dye-merket, single-strandet DNA prober til mRNA meldinger. Celler er avbildes og mRNA tellet ved bruk av en flekk-oppdage algoritme. Single-strandet prober kan genereres med en DNA synthesizer og deretter merket (her kalt Singer prober) eller bestilles kommersielt som pre-merkede prober (Stellaris prober) 12,13. En stor forskjell mellom Singer og Stellaris sonder er at Singer sonder er lengre (~ 50 bp) og er multi-merket mens Stellaris sonder er korte (~ 20 bp) med bare én etikett per probe, som beskrevet av Raj et al 14. I tillegg benytter den Stellaris tilnærming mange flere prober pr gen enn det tilsvarende Singer (~ 30 mot 5 prober pr gen, henholdsvis). Nedenfor gis en protokoll som beskriver bruken av enten type sonde. I kapittel 2 gir vi en protokoll for merking av amino-allyl thymidine som inneholder prober wed en valgt Cy fargestoff. En oversikt over de beregningsorientert skritt som kreves for å identifisere enslige mRNA flekker er gitt i § 7.
Til dags dato har FISH primært vært en lav-throughput metode. Bruken av Cy3, Cy3.5, og Cy5 fargestoffer begrenser antall gener kan man undersøke i enkeltceller til tre på en gang. Noen ytterligere sonder har blitt utviklet (Stellaris), men antallet kan skjelnes prober er likevel høyst syv. For å omgå denne begrensningen, har kombinatoriske merking strategier bruker flere fluorophores blitt brukt til å lage strekkoder for ulike mRNA arter 19,20. Nå nylig, brukte Lübeck og Cai optisk og spektral barcoding å kvantifisere 32 forskjellige arter samtidig med FISH i enkle gjærceller 19. En begrensning av denne siste kombinatorisk tilnærming er det krever bruk av super-oppløsning mikroskopi. Analysen nødvendig for å skille de strekkode prober er også ganske komplisert.
Vi har funnet ut at Cy3 og Cy3.5 er å foretrekke fremfor Cy5 for FISH eksperimenter. En av begrensningene til Cy5 fargestoff er dens følsomhettil photobleaching. Imidlertid har Stellaris nylig utviklet Cy5 varianter som er annonsert som mer motstandsdyktig mot photobleaching, og kan lindre dette tekniske problemet. Det er også verdt å merke seg at fisk er en kostbar metode for å implementere og at både sanger og Stellaris sonder vanligvis koster $ 700 – $ 1000 per probe sett, selv om prisene for kommersielt tilgjengelige sonder bør reduseres i fremtiden. Sparsom av reagenser og effektiv merking bringer Singer sonder ned til nedre varierer i pris.
En av de store tekniske utfordringer er separasjon av enkelt-versus multippel probe flekker, noe som krever gjennomføring av sofistikerte flekk-hetsbestemmende algoritmer. Dette kan ta omfattende manuell gjennomgang for å tune bildeanalyse parametere for bestemte eksperimentelle oppsett. Et omriss av vår beregningsorientert rørledning med relevante MATLAB funksjoner er gitt i § 7 i protokollen. Dette problemet er noe mildnet av de Stellaris sonder som har bare én etikett per probe. Det krever derfor colocalization av flere sonder for å se et signal.
Fordi FISH nødvendiggjør fikse celler, betyr det ikke lette sporing individuelle celler over tid. Tidligere brukte vi FISK snapshot data for å rekonstruere dynamikken i genuttrykk i enkelte metabolsk sykling gjær bestander seks. Metabolsk sykling er observert i pre-sultet, kontinuerlige kulturer, og er preget av befolkningen brede kollektive svingninger i oksygenforbruk. Disse svingninger er forbundet med genom-vide svingninger av transkripter som oppstår for halvparten av all gjær gener i ulike faser av oksygenforbruk. Vi ønsket å finne ut om metabolsk sykle var til stede i usynkroniserte kontinuerlige gjær kulturer. Hvis den finnes, bør karakterutskrifter som er anti-korrelert i synkrone befolkninger også være anti-korrelert i usynkroniserte enkeltceller, og vice versa for korrelerte transkripsjoner.
ent "> å rekonstruere dynamikk av mRNA produksjon i tid, må de observerte data snapshot sammenliknes med det som er forventet fra en modell av det underliggende oppførsel. Det er teoretiske begrensninger når slike" snapshot "av genekspresjon dataene kan brukes til å bestemme de underliggende genuttrykk dynamikk og hvilke typer modeller kan skilles 21. For de metabolske syklus data, snarere enn direkte viser tilstedeværelse av tidsmessige svingninger, ble statistiske målinger gjennomført for å underbygge at det er faktisk en celle autonom oscillasjon program forenlig med bulk microarray målinger.The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet med tilskudd GM046406 (til DB) og ved National Institute of General Medical Sciences Center for Kvantitativ biologi (GM071508). RSM erkjenner midler fra NSF Graduate Research Fellowship. MNM er støttet av en Lewis-Sigler Fellowship. Vi ønsker å takke medlemmene av Botstein lab for nyttige diskusjoner og tidligere medlemmer Allegra Petti og Nikolai Slavov for sine bidrag til den metabolske syklus prosjektet. Vi takker Daniel Zenklusen og Robert Singer for å få oss i gang med FISH-metoden.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Vanadyl Ribonucleoside Complex | NEB | S1402S | |
Lyticase | Sigma | L5263 | |
E. coli tRNA | Roche | 1010954001 | |
BSA (RNase free) | Ambion | ||
Beta-mercaptoethanol | Fisher | 03446l | |
DAPI, dilactate | Sigma | D9564 | |
PBS 10X (RNase free) | Ambion | AM9624 | |
Triton X-100 | Shelton Scientific | ||
Dextran sulfate | Sigma | D6001 | Or equivalent |
Saline-sodium citrate (SSC) 20X | VWR | 82021-484 | |
Formamide (deionized) | Ambion | AM9342 | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
Alpha-D-glucose | Sigma | 158968 | For GLOX solution |
1 M Tris-HCl, pH 8.0 | Ambion | AM9855G | |
100% Ethanol | |||
Glucose oxidase | Sigma | G0543 | For GLOX solution |
Catalase | Sigma | C3155 | For GLOX solution |
Concanavalin A | MP Biomedicals | 150710 | |
Polylysine (0.01%) | Sigma | P8920 | |
Coverslips | Warner Instruments | Cs-18R15 | |
Prolong Gold Mounting Medium | Invitrogen | P36934 | |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | QIAGEN | 28304 | |
FISH Probes | Biosearch Technologies | Custom order for your desired mRNA sequence | |
Glass bottom 96-well plates | Nunc | 265300 | Alternative to coverslips |
12-well plates | BD Falcon | 351143 | |
Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes | GE Healthcare | monofunctional NHS-ester | |
EQUIPMENT | |||
Plasma-Preen I Cleaner | Terra Universal | 9505-00 | Controller (Cat #9505-17 optional) |
Vacuum Pump | Alcatel | 205SDMLAM | For operating Plasma-Preen |
Widefield Fluorescence Microscope | Olympus | IX81 | Or equivalent |
100X objective | Olympus | 1-UB617R | |
Light Source | X-Cite | XCT 10-A | Or equivalent |
Filter Sets | Chroma | U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR. | |
Cooled CCD or EMCCD Camera | Hamamatsu | C4742-98-24ER |