इस प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति के प्रदर्शन के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन<em> बगल में</emएकल अणु संकल्प में एकल कक्षों में mRNAs गिनती के लिए> संकरण (मछली).
बगल में संकरण में प्रतिदीप्ति (मछली) विधि एक देशी सेलुलर वातावरण में न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. यहाँ हम एक खमीर कोशिकाओं में mRNAs की संख्या यों तो मछली का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. कोशिकाओं ब्याज की किसी भी हालत में हो गई है और उसके बाद तय की और प्रवेश के योग्य बनाया जा सकता है. बाद में, फ्लोरोसेंट रंगों को संयुग्मित कई एकल असहाय deoxyoligonucleotides mRNAs लेबल और कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता है. एकल mRNA अणुओं से विवर्तन सीमित प्रतिदीप्ति सेल प्रति mRNAs की संख्या की पहचान और गिनती करने के लिए एक जगह का पता लगाने एल्गोरिथ्म का उपयोग मात्रा निर्धारित है. उत्तरी blots, RT-पीसीआर और जीन अभिव्यक्ति प्रोटीन की अधिक मानक मात्रा का ठहराव तरीकों थोक आबादी में औसत mRNAs के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, मछली एकल अणु संकल्प में एकल कक्षों में गिनती और इन mRNAs का स्थानीयकरण दोनों की सुविधा.
थोक माप तकनीक का उपयोग करना, यह परख एकल कक्षों 1 भीतर टेप या transcriptional गतिविधि की संख्या के लिए संभव नहीं है. जीन अभिव्यक्ति के संवाददाताओं के रूप में ब्याज के प्रमोटरों द्वारा संचालित फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रयोग कुछ हद तक इस मुद्दे के समाधान है, लेकिन गुना करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए आवश्यक समय जल्दी गतिशीलता को धुंधला कर सकते हैं. लंबे समय रहते फ्लोरोसेंट प्रोटीन भी mRNA के जन्मों रिपोर्ट नहीं कर सकते हैं. मछली विधि एकल अणु संकल्प के साथ, नाभिक में प्रतिलेखन दीक्षा से एकल कक्षों में बाद में परिपक्वता और क्षय के लिए, इसके पूरा जीवन चक्र के दौरान परख mRNA के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
डीएनए तत्वों की जांच के लिए radiolabeled शाही सेना जांच में इस्तेमाल किया न्यूक्लिक एसिड दृश्यमान करने के लिए सीटू प्रयोगों में मूल. ये मेंढक Xenopus laevis 2 और माउस ऊतक 3 में उपग्रह डीएनए के अंडाशय में राइबोसोमल डीएनए visualizing शामिल थे. सीटू अनुभव में पहली फ्लोरोसेंटiment विशेष डीएनए दृश्यों 4 की जांच के लिए एक fluorophore साथ चिह्नित एक शाही सेना अणु इस्तेमाल किया. बगल में शाही सेना दृश्यमान करने के लिए फ्लोरोसेंट जांच के पहले आवेदन चिकन मांसपेशियों के ऊतकों संस्कृति 5 में actin जीन अभिव्यक्ति का दृश्य था. अभी हाल ही में नवोदित खमीर में, मछली खमीर चयापचय चक्र 6 के दौरान प्रतिलेखन में दोलनों की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है, सेल चक्र प्रगति 7, और पिंजरे का बँटवारा 8 के दौरान mRNA टेप के स्थानिक स्थानीयकरण दौरान mRNAs का क्षय. मछली अधिक सब खमीर जीन के आधे से अधिक का गठन जो अनिवार्यता से लिखित जीन में uncorrelated उतार चढ़ाव uncorrelated प्रतिलेखन दीक्षा 9 से उठता है कि दिखाने के लिए खमीर में इस्तेमाल किया गया है. गैर खमीर प्रजातियों में, मछली माउस आंत 10 में स्टेम सेल मार्कर की पहचान करने के लिए और सेल भाग्य का अधूरा अंतर्वेधन सी. में स्टोकेस्टिक जीन अभिव्यक्ति के उतार चढ़ाव से परिणाम कर सकते हैं कि यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैएलिगेंस भ्रूण 11.
यहाँ वर्णित मछली विधि संदेशों mRNA को डाई लेबल, एकल असहाय डीएनए जांच hybridizing से काम करता है. कोशिकाओं imaged हैं और mRNAs एक स्थान का पता लगाने एल्गोरिथ्म का उपयोग गिने जाते हैं. एकल असहाय जांच एक डीएनए सिंथेसाइज़र के साथ उत्पन्न और तब लेबल (सिंगर जांच के रूप में यहां तक कहा गया है) या पूर्व लेबल जांच (Stellaris जांच) 12,13 रूप में व्यावसायिक रूप से आदेश दिया जा सकता है. सिंगर और Stellaris जांच के बीच एक बड़ा अंतर Stellaris जांच (~ 20 बीपी) के रूप में राज एट अल द्वारा वर्णित जांच में केवल एक लेबल के साथ कम कर रहे हैं, जबकि सिंगर जांच कर रहे हैं अब (~ 50 बीपी) और मल्टी लेबल है 14. इसके अतिरिक्त, Stellaris दृष्टिकोण सिंगर (क्रमशः जीन प्रति ~ 30 बनाम 5 जांच) की तुलना में जीन के अनुसार कई और अधिक जांच का उपयोग करता है. नीचे हम जांच के किसी भी प्रकार के उपयोग का वर्णन करता है कि एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. धारा 2 में, हम एमिनो एलिल thymidine युक्त जांच डब्ल्यू लेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदानएक चुना Cy डाई रबर. एकल mRNA के स्थानों की पहचान करने के लिए आवश्यक कम्प्यूटेशनल कदम का अवलोकन धारा 7 में प्रदान की जाती है.
तिथि करने के लिए, मछली मुख्य रूप से एक कम throughput विधि से किया गया है. Cy3, Cy3.5, और Cy5 रंगों के उपयोग से एक एक समय में तीन से एकल कक्षों में जांच कर सकते हैं जीनों की संख्या की सीमा. कुछ अतिरिक्त जांच विकसित किया गया है (Stellaris) लेकिन अलग पहचाना जांच की संख्या अभी भी सबसे अधिक सात पर है. इस सीमा को दरकिनार करने के लिए, कई fluorophores का उपयोग करते हुए मिश्रित लेबलिंग रणनीतियों अलग mRNA प्रजातियों 19,20 के लिए बारकोड बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. सबसे हाल ही में, Lubeck और कै एक खमीर कोशिकाओं 19 में मछली के साथ एक साथ 32 विभिन्न प्रजातियों यों के लिए ऑप्टिकल और वर्णक्रमीय बारकोडिंग इस्तेमाल किया. हाल ही में इस मिश्रित दृष्टिकोण की एक सीमा है कि यह सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के उपयोग की आवश्यकता है. बारकोड वाले जांच अंतर करना आवश्यक विश्लेषण भी काफी जटिल है.
हम Cy3 और Cy3.5 मछली प्रयोगों के लिए Cy5 के लिए बेहतर हो पाया है. Cy5 डाई की सीमाओं में से एक अपनी संवेदनशीलता हैphotobleaching के लिए. हालांकि, Stellaris हाल ही में photobleaching के लिए प्रतिरोधी के रूप में प्रचारित कर रहे हैं कि Cy5 वेरिएंट विकसित की है, और इस तकनीकी समस्या को दूर कर सकते हैं. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जांच के लिए कीमतों में भविष्य में कमी करनी चाहिए, हालांकि, जांच के सेट $ 1000 प्रति – यह भी है कि मछली ध्यान देने योग्य लागू करने के लिए एक महंगा तरीका है और सिंगर और Stellaris दोनों जांच आम तौर पर 700 डॉलर खर्च करते हैं. अभिकर्मकों और कुशल लेबलिंग के बख्शते कीमत में कम रेंज के लिए नीचे सिंगर जांच लाता है.
प्रमुख तकनीकी चुनौतियों में से एक परिष्कृत स्थान का निर्धारण एल्गोरिदम के कार्यान्वयन की आवश्यकता है जो एक बनाम कई जांच धब्बे की जुदाई है. इस विशिष्ट प्रयोगात्मक सेटअप के लिए छवि विश्लेषण मापदंडों धुन करने के लिए व्यापक मैन्युअल समीक्षा ले सकते हैं. प्रासंगिक MATLAB के कार्यों के साथ हमारे कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन की एक रूपरेखा प्रोटोकॉल की धारा 7 में प्रदान की जाती है. यह समस्या कुछ हद तक ही है जो Stellaris जांच से क्रमशः समाप्त होता है जांच के अनुसार एक लेबल. इसलिए यह एक संकेत को देखने के लिए कई जांच की colocalization की आवश्यकता है.
मछली कोशिकाओं फिक्सिंग जरूरी है, क्योंकि यह समय के साथ ट्रैकिंग व्यक्ति की कोशिकाओं की सुविधा नहीं है. इससे पहले, हम व्यक्तिगत पाचन साइक्लिंग खमीर आबादी 6 में जीन अभिव्यक्ति की गतिशीलता के पुनर्निर्माण के लिए मछली स्नैपशॉट डेटा का उपयोग किया. मेटाबोलिक साइक्लिंग पूर्व भूखे, निरंतर संस्कृतियों में मनाया जाता है, और ऑक्सीजन की खपत में जनसंख्या चौड़ा सामूहिक दोलनों की विशेषता है. इन दोलनों ऑक्सीजन की खपत के विभिन्न चरणों में सब खमीर जीनों में से आधे के लिए होती है कि टेप के जीनोम चौड़ा दोलनों के साथ जुड़े रहे हैं. हम चयापचय साइक्लिंग unsynchronized निरंतर खमीर संस्कृतियों में मौजूद था, तो यह निर्धारित करने की मांग की. अगर मौजूद है, तुल्यकालिक आबादी में विरोधी सहसंबद्ध हैं कि टेप भी सहसंबद्ध टेप के लिए unsynchronized एकल कक्षों, और इसके विपरीत में विरोधी सहसंबद्ध किया जाना चाहिए.
ईएनटी "समय में mRNA उत्पादन की गतिशीलता को फिर से संगठित करने के लिए>, मनाया स्नैपशॉट डेटा अंतर्निहित व्यवहार की एक मॉडल से उम्मीद है की तुलना में क्या किया जाना चाहिए. इस तरह जब तक सैद्धांतिक सीमाएं हैं" जीन अभिव्यक्ति डेटा की फोटो "निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अंतर्निहित जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता और जो मॉडल के प्रकार के 21 प्रतिष्ठित किया जा सकता है. चयापचय चक्र डेटा, बजाय सीधे अस्थायी दोलनों की उपस्थिति दिखाने के लिए, सांख्यिकीय माप थोक माइक्रोएरे के अनुरूप सेल स्वायत्त oscillatory कार्यक्रम वास्तव में नहीं है कि पुष्ट करने के लिए लागू किया गया माप.The authors have nothing to disclose.
इस शोध अनुदान GM046406 (DB के लिए) से और मात्रात्मक जीवविज्ञान के लिए जनरल मेडिकल साइंसेज सेंटर (GM071508) के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था. RSM के लिए NSF ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप से धन स्वीकार करता है. एमएनएम एक लुईस-Sigler फैलोशिप द्वारा समर्थित है. हम चयापचय चक्र परियोजना के लिए अपने योगदान के लिए उपयोगी विचार विमर्श और पूर्व सदस्यों Allegra Petti और निकोलाई Slavov लिए Botstein प्रयोगशाला के सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं. हम हमें मछली विधि के साथ शुरू हो रही के लिए डैनियल Zenklusen और रॉबर्ट सिंगर धन्यवाद.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Vanadyl Ribonucleoside Complex | NEB | S1402S | |
Lyticase | Sigma | L5263 | |
E. coli tRNA | Roche | 1010954001 | |
BSA (RNase free) | Ambion | ||
Beta-mercaptoethanol | Fisher | 03446l | |
DAPI, dilactate | Sigma | D9564 | |
PBS 10X (RNase free) | Ambion | AM9624 | |
Triton X-100 | Shelton Scientific | ||
Dextran sulfate | Sigma | D6001 | Or equivalent |
Saline-sodium citrate (SSC) 20X | VWR | 82021-484 | |
Formamide (deionized) | Ambion | AM9342 | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
Alpha-D-glucose | Sigma | 158968 | For GLOX solution |
1 M Tris-HCl, pH 8.0 | Ambion | AM9855G | |
100% Ethanol | |||
Glucose oxidase | Sigma | G0543 | For GLOX solution |
Catalase | Sigma | C3155 | For GLOX solution |
Concanavalin A | MP Biomedicals | 150710 | |
Polylysine (0.01%) | Sigma | P8920 | |
Coverslips | Warner Instruments | Cs-18R15 | |
Prolong Gold Mounting Medium | Invitrogen | P36934 | |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | QIAGEN | 28304 | |
FISH Probes | Biosearch Technologies | Custom order for your desired mRNA sequence | |
Glass bottom 96-well plates | Nunc | 265300 | Alternative to coverslips |
12-well plates | BD Falcon | 351143 | |
Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes | GE Healthcare | monofunctional NHS-ester | |
EQUIPMENT | |||
Plasma-Preen I Cleaner | Terra Universal | 9505-00 | Controller (Cat #9505-17 optional) |
Vacuum Pump | Alcatel | 205SDMLAM | For operating Plasma-Preen |
Widefield Fluorescence Microscope | Olympus | IX81 | Or equivalent |
100X objective | Olympus | 1-UB617R | |
Light Source | X-Cite | XCT 10-A | Or equivalent |
Filter Sets | Chroma | U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR. | |
Cooled CCD or EMCCD Camera | Hamamatsu | C4742-98-24ER |