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Biology

प्रतिदीप्ति का प्रयोग mRNA अणुओं के दृश्य और विश्लेषण doi: 10.3791/50382 Published: June 14, 2013

Summary

इस प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति के प्रदर्शन के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन

Abstract

बगल में संकरण में प्रतिदीप्ति (मछली) विधि एक देशी सेलुलर वातावरण में न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. यहाँ हम एक खमीर कोशिकाओं में mRNAs की संख्या यों तो मछली का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. कोशिकाओं ब्याज की किसी भी हालत में हो गई है और उसके बाद तय की और प्रवेश के योग्य बनाया जा सकता है. बाद में, फ्लोरोसेंट रंगों को संयुग्मित कई एकल असहाय deoxyoligonucleotides mRNAs लेबल और कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता है. एकल mRNA अणुओं से विवर्तन सीमित प्रतिदीप्ति सेल प्रति mRNAs की संख्या की पहचान और गिनती करने के लिए एक जगह का पता लगाने एल्गोरिथ्म का उपयोग मात्रा निर्धारित है. उत्तरी blots, RT-पीसीआर और जीन अभिव्यक्ति प्रोटीन की अधिक मानक मात्रा का ठहराव तरीकों थोक आबादी में औसत mRNAs के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, मछली एकल अणु संकल्प में एकल कक्षों में गिनती और इन mRNAs का स्थानीयकरण दोनों की सुविधा.

Introduction

थोक माप तकनीक का उपयोग करना, यह परख एकल कक्षों 1 भीतर टेप या transcriptional गतिविधि की संख्या के लिए संभव नहीं है. जीन अभिव्यक्ति के संवाददाताओं के रूप में ब्याज के प्रमोटरों द्वारा संचालित फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रयोग कुछ हद तक इस मुद्दे के समाधान है, लेकिन गुना करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए आवश्यक समय जल्दी गतिशीलता को धुंधला कर सकते हैं. लंबे समय रहते फ्लोरोसेंट प्रोटीन भी mRNA के जन्मों रिपोर्ट नहीं कर सकते हैं. मछली विधि एकल अणु संकल्प के साथ, नाभिक में प्रतिलेखन दीक्षा से एकल कक्षों में बाद में परिपक्वता और क्षय के लिए, इसके पूरा जीवन चक्र के दौरान परख mRNA के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

डीएनए तत्वों की जांच के लिए radiolabeled शाही सेना जांच में इस्तेमाल किया न्यूक्लिक एसिड दृश्यमान करने के लिए सीटू प्रयोगों में मूल. ये मेंढक Xenopus laevis 2 और माउस ऊतक 3 में उपग्रह डीएनए के अंडाशय में राइबोसोमल डीएनए visualizing शामिल थे. सीटू अनुभव में पहली फ्लोरोसेंटiment विशेष डीएनए दृश्यों 4 की जांच के लिए एक fluorophore साथ चिह्नित एक शाही सेना अणु इस्तेमाल किया. बगल में शाही सेना दृश्यमान करने के लिए फ्लोरोसेंट जांच के पहले आवेदन चिकन मांसपेशियों के ऊतकों संस्कृति 5 में actin जीन अभिव्यक्ति का दृश्य था. अभी हाल ही में नवोदित खमीर में, मछली खमीर चयापचय चक्र 6 के दौरान प्रतिलेखन में दोलनों की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है, सेल चक्र प्रगति 7, और पिंजरे का बँटवारा 8 के दौरान mRNA टेप के स्थानिक स्थानीयकरण दौरान mRNAs का क्षय. मछली अधिक सब खमीर जीन के आधे से अधिक का गठन जो अनिवार्यता से लिखित जीन में uncorrelated उतार चढ़ाव uncorrelated प्रतिलेखन दीक्षा 9 से उठता है कि दिखाने के लिए खमीर में इस्तेमाल किया गया है. गैर खमीर प्रजातियों में, मछली माउस आंत 10 में स्टेम सेल मार्कर की पहचान करने के लिए और सेल भाग्य का अधूरा अंतर्वेधन सी. में स्टोकेस्टिक जीन अभिव्यक्ति के उतार चढ़ाव से परिणाम कर सकते हैं कि यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैएलिगेंस भ्रूण 11.

यहाँ वर्णित मछली विधि संदेशों mRNA को डाई लेबल, एकल असहाय डीएनए जांच hybridizing से काम करता है. कोशिकाओं imaged हैं और mRNAs एक स्थान का पता लगाने एल्गोरिथ्म का उपयोग गिने जाते हैं. एकल असहाय जांच एक डीएनए सिंथेसाइज़र के साथ उत्पन्न और तब लेबल (सिंगर जांच के रूप में यहां तक कहा गया है) या पूर्व लेबल जांच (Stellaris जांच) 12,13 रूप में व्यावसायिक रूप से आदेश दिया जा सकता है. सिंगर और Stellaris जांच के बीच एक बड़ा अंतर Stellaris जांच (~ 20 बीपी) के रूप में राज एट अल द्वारा वर्णित जांच में केवल एक लेबल के साथ कम कर रहे हैं, जबकि सिंगर जांच कर रहे हैं अब (~ 50 बीपी) और मल्टी लेबल है 14. इसके अतिरिक्त, Stellaris दृष्टिकोण सिंगर (क्रमशः जीन प्रति ~ 30 बनाम 5 जांच) की तुलना में जीन के अनुसार कई और अधिक जांच का उपयोग करता है. नीचे हम जांच के किसी भी प्रकार के उपयोग का वर्णन करता है कि एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. धारा 2 में, हम एमिनो एलिल thymidine युक्त जांच डब्ल्यू लेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदानएक चुना Cy डाई रबर. एकल mRNA के स्थानों की पहचान करने के लिए आवश्यक कम्प्यूटेशनल कदम का अवलोकन धारा 7 में प्रदान की जाती है.

Protocol

आंकड़े 1 और 2 मछली प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और मछली छवियों बढ़ाता के लिए इस्तेमाल किया छवि विश्लेषण पाइपलाइन का समर्थन कर रहे हैं.

1. तैयार करने के लिए समाधान

नीचे * समाधान सिंगर जांच के साथ उपयोग के लिए कर रहे हैं. Stellaris जांच का उपयोग करते हैं, तो संकरण बफर और धो बफर दोनों में "10% formamide" के साथ "40% formamide" की जगह. संकरण बफर करने के लिए अतिरिक्त परिवर्तन Stellaris जांच का उपयोग करते समय (1) 1 ग्राम Dextran सल्फेट जोड़ने और (2) 10 मिलीग्राम ssDNA शामिल नहीं करते हैं.

बफर बी

8 मिली 1 एम 2 के.एच. पीओ 4
41.5 मिलीलीटर 1M कश्मीर 2 4 HPO
Sorbitol 109.3 छ

Spheroplasting बफर

890 μl बफर बी
100 μl वीआरसी
10 μl 25,000 यू / एमएल Lyticase
2 μl β-mercaptoethanol

<मजबूत> संकरण बफर (10 मिलीलीटर, अंतिम मात्रा)

10 मिलीग्राम ई. कोलाई tRNA
10 मिलीग्राम ssDNA *
100 μl 200 मिमी वीआरसी शेयर
50 मिलीग्राम / एमएल BSA के 40 μl
1 मिलीलीटर 20X एसएससी
4 मिलीलीटर 40% Formamide *
Nuclease मुफ्त पानी (10 मिलीलीटर अंतिम मात्रा के लिए)
1 ग्राम Dextran सल्फेट *

* संकरण बफर सुविधा के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 मिलीलीटर aliquots में रखा जा सकता है.

(50 मिलीलीटर, अंतिम मात्रा) बफर धो

5 मिलीलीटर 20X एसएससी
20 मिलीलीटर 40% Formamide *
Nuclease मुफ्त पानी (50 मिलीलीटर अंतिम मात्रा के लिए)

बफर लेबलिंग

1.06 ग्राम सोडियम कार्बोनेट
100 मिलीलीटर DEPC जल
पीएच 9

2. जांच लेबलिंग (सिंगर जांच केवल)

हम एक अबी oligonucleotide संश्लेषण उपकरण का उपयोग कर घर में संश्लेषण द्वारा इन जांच प्राप्त करते हैं. Typicसहयोगी, 4-5 ~ 50 बीपी oligonucleotides के अधिमानतः 10 कम से कम 8 + बीपी के अलावा दूरी पर कई thymidines के लिए एमिनो एलिल thymidine प्रतिस्थापन, ब्याज की जीन के मुताबिक़ हैं कि संश्लेषित कर रहे हैं. सीवाई रंगों का उपयोग करते समय, क्योंकि ओजोन को उनकी संवेदनशीलता का, हम एक ओजोन मुक्त सुविधा में काम करते हैं.

  1. ~ 5 जांच प्राप्त करते हैं और 100 μl पानी में resuspend - Nanodrop पर चेक सांद्रता.
  2. कितने जांच / जीन, 10 ग्राम oligonucleotides / जीन की कुल गठबंधन पर निर्भर करता है (उदाहरण के लिए 5 जांच / जीन, तो 2 ग्राम / जांच चाहते हैं).
  3. QIAquick Nucleotide हटाने किट प्रोटोकॉल के अनुसार जांच को शुद्ध करने के QIAquick स्तंभों का प्रयोग करें.
  4. बफर पी.एन. संयुक्त जांच और मिश्रण की मात्रा कुल 10 खंडों में जोड़ें.
  5. QIAquick स्तंभ के लिए नमूना लागू करें - कुल मात्रा 750 μl से अधिक है, प्रत्येक स्पिन में मात्रा के आधे का उपयोग दो बार नीचे स्पिन
  6. 1 मिनट के लिए खड़े हैं.
  7. 6000 rpm पर 1 मिनट अपकेंद्रित्र.
  8. 750 μl बफर पीई के साथ धोएं.
  9. अपकेंद्रित्र6000 rpm पर 1 मिनट.
  10. सूखे के लिए 13,000 rpm पर 1 मिनट के लिए के माध्यम से प्रवाह और फिर स्पिन स्तंभ के निपटान के.
  11. एच 2 ओ पीएच 7.0 और 8.5 के भीतर है और झिल्ली पर सीधे रखा जाता है सुनिश्चित करें - नए microcentrifuge ट्यूब और 50 μl एच 2 हे के साथ elute डीएनए में जगह QIAquick स्तंभ.
  12. 1 मिनट के लिए खड़े हैं.
  13. डीएनए elute करने के लिए 13,000 rpm पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
  14. 45 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए Lyophilize
  15. Resuspend 10 μl लेबलिंग बफर में गोली और डाई को छू बिना डाई की ट्यूब को जोड़ने.
  16. एक और 10 μl लेबलिंग बफर के साथ दोहराएँ.
  17. भंवर और डाई और डीएनए की ट्यूब नीचे स्पिन.
  18. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब कवर और लेबल करने के लिए आर टी ओ / एन में अंधेरे में रहते हैं.
  19. QIAquick Nucleotide हटाने किट प्रोटोकॉल दोहराएँ. दो मतभेदों के साथ प्रदर्शन करते हैं:
    - जांच के लिए 200 μl पी.एन. बफर जोड़ें और कॉलम 2x के माध्यम से लेबल जांच डाल दिया.
    - क्षालन से पहले किसी भी स्वाधीन डाई दूर धोने के क्रम में बफर पीई के साथ 3 washes प्रदर्शन करना.
  20. वायु सेनाआतंकवाद क्षालन NanoDrop के माध्यम से एकाग्रता प्राप्त करते हैं. लेबलिंग दक्षता आम तौर पर एकल असहाय डीएनए की ~ 0.25 pmol / एनजी है.

3. Coverslip तैयारी

  1. प्लाज्मा आत्मसंतुष्ट होना निर्वात चैम्बर में (स्लाइड पर प्लेस coverslips के http://www.plasmapreen.com/ ) (बेहतर सेंटर के करीब).
  2. माइक्रोवेव में निर्वात चैम्बर रखो और इसे सील कर दिया जाता है सुनिश्चित करें.
  3. पंप पर मुड़ें पहले तो पंप शुरू कर दिया है केवल एक बार शून्य पर बारी.
  4. माइक्रोवेव चालू है, और प्लाज्मा दिख रहा है के बाद 5 सेकंड बंद करो.
  5. पंप तो वैक्यूम बंद करें.
  6. निर्वात चैम्बर से बाहर खींचो और संदंश (गिर गया है कि उन लोगों को फिर से साफ किया जाना चाहिए) के साथ coverslips हटा दें.
  7. जगह 12 अच्छी तरह प्लेटें में साफ ऊपर की ओर coverslips.

4. फिक्सेशन प्रक्रिया

  1. कम से कम मीडिया में चारों ओर 0.1-0.2 की एक आयुध डिपो 600 के लिए खमीर के लिए आगे बढ़ें. कोशिकाओं के 10 मिलीलीटर पर्याप्त के लिए पैदावारआर ~ 10 अलग hybridizations.
  2. विकास मीडिया (संस्कृति के 10 मिलीलीटर 1 मिलीलीटर 37% formaldehyde) को सीधे 1/10 मात्रा 37% formaldehyde जोड़ें और 45 मिनट के लिए बैठते हैं.
  3. एक microcentrifuge ट्यूब (1 मिनट के लिए 13,000 rpm पर स्पिन कर सकते हैं) में 1 मिलीलीटर बर्फ ठंड बफर बी के साथ 2x धो लें.
  4. Spheroplasting बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
  5. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. सबसे कोशिकाओं (यानी चरण उज्ज्वल नहीं) काले होते हैं जब तक कोशिकाओं खुर्दबीन के नीचे हर कुछ मिनट की जाँच करें.
  6. कम गति (~ 3500 आरपीएम) में कताई, बर्फ ठंड बफर बी के साथ 2x धो लें.
  7. , 70% EtOH के 1 मिलीलीटर जोड़ें धीरे resuspend और 4 में रात भर छोड़ डिग्री सेल्सियस (-20 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए स्टोर कर सकते हैं).

5. संकरण प्रक्रिया

  1. संकरण समाधान तैयार: संकरण बफर के 100 μl के लिए, तो जांच के 1-3 μl, भंवर और अपकेंद्रित्र जोड़ें. सिंगर जांच जांच सेट प्रति 8-10 एनजी कुल (यानी प्रति जीन) का उपयोग करें. हम 3 अलग से एक साथ 3 जीन पर निर्भर imaged हैअलग लेबल जांच सेट.

इसे खोलने से पहले कमरे के तापमान को संकरण समाधान गर्म करने के लिए सुनिश्चित करें.

Stellaris जांच के लिए, यह 1 μl 1:10 के प्रत्येक, 1:20, 1:50 और एक इष्टतम है जो देखने के लिए जांच की 1:100 काम कर dilutions जोड़कर 4 अलग संकरण प्रतिक्रियाओं शुरू करने की सिफारिश की है. Stellaris जांच का कार्य करना dilutions के संकरण बफर में तैयार कर रहे हैं.

  1. अपकेंद्रित्र (बाद के सभी चरणों के लिए, 3500 rpm, 5 मिनट) तय कोशिकाओं (उदाहरण के लिए 200 μl) और इथेनॉल दूर aspirate.
  2. धीरे संकरण बफर के रूप में एक ही प्रतिशत formamide जिसमें 1 मिलीलीटर धो बफर में resuspend. 2-5 मिनट के लिए खड़े हैं.
  3. नमूना और aspirate धोने बफर अपकेंद्रित्र, तो संकरण समाधान जोड़ने. कोमल झटकों के साथ अंधेरे में सेते हैं, 37 ओ / एन डिग्री सेल्सियस

नोट: निम्न प्रक्रिया coverslips पर / इमेजिंग कोशिकाओं को लागू करने के लिए है. W के लिएदेखने के विकल्प प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों मेहतर समाधान सहित 96 अच्छी तरह प्लेटें में / इमेजिंग कोशिकाओं ashing http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.

  1. अगले दिन, या पहले, स्वच्छ (प्रक्रिया देखें) और 5 मिनट के लिए 150 μl 0.01% पाली एल Lysine के साथ कवर फिसल जाता है इलाज. महाप्राण, DH 2 हे के साथ 3x धो और सूखी, सूखा.
  2. सुबह में, नमूना के लिए धोने बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ने धीरे resuspend, अपकेंद्रित्र और महाप्राण, फिर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर धो बफर और सेते की एक और 1 मिलीलीटर में resuspend.
  3. 2X एसएससी + 0.1% हिलनेवाला पर आरटी पर ट्राइटन X-100 15 मिनट से धो लें.
  4. यह बढ़ते पहले आरटी को आने की अनुमति देने के लिए फ्रीजर के माध्यम से बाहर बढ़ते लो.
  5. हिलनेवाला पर आरटी 15 मिनट में 1X एसएससी के साथ धोएं.
  6. पीबीएस (0.1 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम) और 150 μl में resuspend कोशिकाओं में DAPI पतला.
  7. साफ / पाली lys-trea पर प्लेस समाधान12 अच्छी तरह से थाली में टेड कवर फिसल जाता है, कम से कम 30 मिनट अबाधित.
  8. समाधान निकालें (आप एक बैकअप के रूप में एक अतिरिक्त कवर पर्ची पर जगह हो सकते हैं) और 1 मिलीलीटर 1X पीबीएस के साथ 3x धो लो.
  9. एक स्लाइड (Invitrogen P36934) पर सोने के बढ़ते मध्यम लम्बा के 3 μl रखें. आप मध्यम बढ़ते के सूखने से बचने के लिए कई कवर फिसल जाता है, तो एक समय में यह एक कार्य करें.
  10. चिमटी से पकड़ रखा है, जबकि 12 अच्छी तरह से थाली में coverslip के लिए ~ 0.5 मिलीलीटर इथेनॉल जोड़ें, सूखी कवर पर्ची और हवा निकाल देते हैं.
  11. मध्यम बढ़ते पर पर्ची सेल साइड नीचे कवर और अंधेरे में कड़ा कई घंटे या ओ / एन चलो रखें.
  12. नेल पॉलिश के साथ किनारों को सील और इमेजिंग के लिए आगे बढ़ें.

6. ओलिंप नौवीं-81 उल्टे माइक्रोस्कोप अवलोकन के साथ कोशिकाओं के इमेजिंग

  1. छवि अधिग्रहण के लिए हम Slidebook (बुद्धिमान imaging.com) सॉफ्टवेयर और एक 100X, 1.45 एनए, TIRFM तेल उद्देश्य उपयोग. क्रोमा फिल्टर सेट (अभिकर्मकों देखें): धारावाहिक GFP, DAPI, Cy3, Cy3.5 और Cy5 इमेजिंग के लिए.
  2. DAPI फिल्टर का प्रयोग करेंखोजने के लिए और कोशिकाओं ध्यान केंद्रित करने के लिए.
  3. संदर्भ बिंदु के रूप में सेट करें.
  4. कुल दूरी 0.2 माइक्रोन आकार (25 विमानों) के साथ 5 माइक्रोन है जहां संदर्भ बिंदु के आसपास छवियों का एक z ढेर ले लो. प्रत्येक डाई चैनल (यानी हर जांच सेट) के लिए दोहराएँ.
  5. छवि विश्लेषण के लिए एक 16 बिट झगड़ा के रूप में निर्यात करें.

7. छवि विश्लेषण अवलोकन (सिंगर जांच)

नीचे हम हम MATLAB में मछली छवियों का विश्लेषण करने के लिए उपयोग कम्प्यूटेशनल विधियों की एक रूपरेखा प्रदान करते हैं. इस्तेमाल किया प्रासंगिक MATLAB के कार्यों को सही पर bracketed रहे हैं. एल्गोरिदम और थ्रेसहोल्ड वर्तमान सिंगर शैली जांच से डेटा के लिए देखते हैं. Stellaris शैली जांच का प्रयोग विशेष रूप से अंतिम छानने कदम (7.8) के लिए कुछ समायोजन की आवश्यकता होगी.

सेल पहचान 15

  1. DAPI छवियों 16 पर एक वैश्विक सीमा का उपयोग कर पृष्ठभूमि से अलग कोशिकाओं [graythresh].
  2. विस्तारित मॅक्सिमा समारोह [आईएम का उपयोग नाभिक को पहचानेंextendedmax].
  3. एक जल एल्गोरिथ्म के लिए बीज के रूप में नाभिक का उपयोग कर खंड कोशिकाओं [वाटरशेड].

प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल में स्पॉट का पता लगाएं

  1. पृष्ठभूमि को सामान्य और शोर अनुपात करने के लिए संकेत सुधार Tophat परिवर्तन प्रदर्शन करना [bwmorph].
  2. प्रत्येक स्थान के लिए में फोकस परत (z-विमान में) की पहचान करने के लिए मॅक्सिमा खोजें [imregionalmax].
  3. एक रेडियल ढाल करने के लिए एक रेखीय फिट मॉडल का उपयोग संभावित स्पॉट फ़िल्टर.

उपाय मौके तीव्रता और फिल्टर एकल बनाम एकाधिक जांच के संकेत

  1. पहले से पहचान में फोकस परत और अनुमान तीव्रता 17 में हाजिर करने के लिए एक 2 डी गाऊसी प्रोफ़ाइल फिट.
  2. एक सीमा (हिस्टोग्राम के आधार पर) का उपयोग कमजोर स्पॉट बाहर फिल्टर. सिंगर प्रकार जांच के लिए यह महत्वपूर्ण है, लेकिन Stellaris जांच के लिए बहुत कम है.
  3. प्रत्येक कक्ष में स्पॉट गणना.

Representative Results

चित्रा 3 मछली छवियों से गणना की और एकल कक्षों में मौजूद mRNAs की संख्या निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया ठेठ हिस्टोग्राम से पता चलता है. माइक्रोस्कोपी आधारित शाही सेना मात्रा का ठहराव का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि एक टेप के स्थानीयकरण के बारे में जानकारी प्राप्त कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, हम एक inducible CBF1 एलील (चित्रा 4) के साथ एकल कक्षों में mRNAs की पहचान करने के लिए मछली का इस्तेमाल किया. कई mRNA अणुओं प्रतिलेखन के स्थल पर उपस्थित होते हैं, क्योंकि हम नाभिक के भीतर प्रतिलेखन साइटों की उपस्थिति और स्थान की पहचान करने में सक्षम हैं.

विभिन्न जीनों का लेबल mRNAs के लिए विभिन्न रंगों का उपयोग करके, एक ही कक्ष में कई mRNA प्रजातियों यों कर सकते हैं. इस प्रदर्शन, खमीर कोशिकाओं α-कारक और सोर्बिटोल की उपस्थिति में incubated रहे थे. FUS1 प्रतिलेखन (Quasar670 डाई, लाल) α-पहलू से प्रेरित है. STL1 प्रतिलेखन (कैसर 570 डाई, हरा) बाह्य परासारिता में वृद्धि से प्रेरित है ( चित्रा 4 सिंगर जांच के साथ मछली का एक उदाहरण है. चित्रा 5 Stellaris जांच के साथ मछली का एक उदाहरण है.

चित्रा 1
चित्रा 1. मछली प्रयोगात्मक प्रक्रिया के योजनाबद्ध. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. छवि विश्लेषण पाइपलाइन के योजनाबद्ध. अंतिम स्पॉट दाएँ आकृति में निर्धारित कर रहे हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. सिंगर जांच का उपयोग कर एक विशेष जीन के लिए हाजिर तीव्रता के हिस्टोग्राम

चित्रा 4
4 चित्रा. सिंगर मछली प्रक्रिया के प्रतिनिधि परिणाम है. इस प्रयोग में, CBF1 प्रतिलेखन एक inducible प्रमोटर 18 के साथ सक्रिय है. नाभिक DAPI साथ नीले दाग रहे हैं. CBF1 mRNAs Cy3 लेबल जांच के साथ टैग कर रहे हैं. व्हाइट तीर नाभिक में CBF1 प्रतिलेखन साइटों की उपस्थिति पर प्रकाश डाला. एकल mRNA टेप cytoplasm में दिखाई दे रहे हैं.

चित्रा 5
चित्रा 5. Stellaris मछली प्रक्रिया के प्रतिनिधि परिणाम है. माता खमीर कोशिकाओं को एक साथ 30 एनजी / एमएल α-कारक और 10 मिनट के लिए sorbitol 0.75 एम के संपर्क में थे और एक साथ FUS1 (कैसर 670, लाल) और STL1 (कैसर 570, हरा) टेप के लिए जांच कर रहे थे. प्रकाश डाला बॉक्स में, हम एक सेल फेरोमोन को ही जवाब देने (FUS1 शुरू साइट, लाल) और एक अन्य मुख्य रूप से (हरा, STL1 शुरू साइट) sorbitol का जवाब देने के देख सकते हैं.

Discussion

तिथि करने के लिए, मछली मुख्य रूप से एक कम throughput विधि से किया गया है. Cy3, Cy3.5, और Cy5 रंगों के उपयोग से एक एक समय में तीन से एकल कक्षों में जांच कर सकते हैं जीनों की संख्या की सीमा. कुछ अतिरिक्त जांच विकसित किया गया है (Stellaris) लेकिन अलग पहचाना जांच की संख्या अभी भी सबसे अधिक सात पर है. इस सीमा को दरकिनार करने के लिए, कई fluorophores का उपयोग करते हुए मिश्रित लेबलिंग रणनीतियों अलग mRNA प्रजातियों 19,20 के लिए बारकोड बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. सबसे हाल ही में, Lubeck और कै एक खमीर कोशिकाओं 19 में मछली के साथ एक साथ 32 विभिन्न प्रजातियों यों के लिए ऑप्टिकल और वर्णक्रमीय बारकोडिंग इस्तेमाल किया. हाल ही में इस मिश्रित दृष्टिकोण की एक सीमा है कि यह सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के उपयोग की आवश्यकता है. बारकोड वाले जांच अंतर करना आवश्यक विश्लेषण भी काफी जटिल है.

हम Cy3 और Cy3.5 मछली प्रयोगों के लिए Cy5 के लिए बेहतर हो पाया है. Cy5 डाई की सीमाओं में से एक अपनी संवेदनशीलता हैphotobleaching के लिए. हालांकि, Stellaris हाल ही में photobleaching के लिए प्रतिरोधी के रूप में प्रचारित कर रहे हैं कि Cy5 वेरिएंट विकसित की है, और इस तकनीकी समस्या को दूर कर सकते हैं. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जांच के लिए कीमतों में भविष्य में कमी करनी चाहिए, हालांकि, जांच के सेट $ 1000 प्रति - यह भी है कि मछली ध्यान देने योग्य लागू करने के लिए एक महंगा तरीका है और सिंगर और Stellaris दोनों जांच आम तौर पर 700 डॉलर खर्च करते हैं. अभिकर्मकों और कुशल लेबलिंग के बख्शते कीमत में कम रेंज के लिए नीचे सिंगर जांच लाता है.

प्रमुख तकनीकी चुनौतियों में से एक परिष्कृत स्थान का निर्धारण एल्गोरिदम के कार्यान्वयन की आवश्यकता है जो एक बनाम कई जांच धब्बे की जुदाई है. इस विशिष्ट प्रयोगात्मक सेटअप के लिए छवि विश्लेषण मापदंडों धुन करने के लिए व्यापक मैन्युअल समीक्षा ले सकते हैं. प्रासंगिक MATLAB के कार्यों के साथ हमारे कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन की एक रूपरेखा प्रोटोकॉल की धारा 7 में प्रदान की जाती है. यह समस्या कुछ हद तक ही है जो Stellaris जांच से क्रमशः समाप्त होता है जांच के अनुसार एक लेबल. इसलिए यह एक संकेत को देखने के लिए कई जांच की colocalization की आवश्यकता है.

मछली कोशिकाओं फिक्सिंग जरूरी है, क्योंकि यह समय के साथ ट्रैकिंग व्यक्ति की कोशिकाओं की सुविधा नहीं है. इससे पहले, हम व्यक्तिगत पाचन साइक्लिंग खमीर आबादी 6 में जीन अभिव्यक्ति की गतिशीलता के पुनर्निर्माण के लिए मछली स्नैपशॉट डेटा का उपयोग किया. मेटाबोलिक साइक्लिंग पूर्व भूखे, निरंतर संस्कृतियों में मनाया जाता है, और ऑक्सीजन की खपत में जनसंख्या चौड़ा सामूहिक दोलनों की विशेषता है. इन दोलनों ऑक्सीजन की खपत के विभिन्न चरणों में सब खमीर जीनों में से आधे के लिए होती है कि टेप के जीनोम चौड़ा दोलनों के साथ जुड़े रहे हैं. हम चयापचय साइक्लिंग unsynchronized निरंतर खमीर संस्कृतियों में मौजूद था, तो यह निर्धारित करने की मांग की. अगर मौजूद है, तुल्यकालिक आबादी में विरोधी सहसंबद्ध हैं कि टेप भी सहसंबद्ध टेप के लिए unsynchronized एकल कक्षों, और इसके विपरीत में विरोधी सहसंबद्ध किया जाना चाहिए.

ईएनटी "समय में mRNA उत्पादन की गतिशीलता को फिर से संगठित करने के लिए>, मनाया स्नैपशॉट डेटा अंतर्निहित व्यवहार की एक मॉडल से उम्मीद है की तुलना में क्या किया जाना चाहिए. इस तरह जब तक सैद्धांतिक सीमाएं हैं" जीन अभिव्यक्ति डेटा की फोटो "निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अंतर्निहित जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता और जो मॉडल के प्रकार के 21 प्रतिष्ठित किया जा सकता है. चयापचय चक्र डेटा, बजाय सीधे अस्थायी दोलनों की उपस्थिति दिखाने के लिए, सांख्यिकीय माप थोक माइक्रोएरे के अनुरूप सेल स्वायत्त oscillatory कार्यक्रम वास्तव में नहीं है कि पुष्ट करने के लिए लागू किया गया माप.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है घोषणा.

Acknowledgments

इस शोध अनुदान GM046406 (DB के लिए) से और मात्रात्मक जीवविज्ञान के लिए जनरल मेडिकल साइंसेज सेंटर (GM071508) के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था. RSM के लिए NSF ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप से धन स्वीकार करता है. एमएनएम एक लुईस-Sigler फैलोशिप द्वारा समर्थित है. हम चयापचय चक्र परियोजना के लिए अपने योगदान के लिए उपयोगी विचार विमर्श और पूर्व सदस्यों Allegra Petti और ​​निकोलाई Slavov लिए Botstein प्रयोगशाला के सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं. हम हमें मछली विधि के साथ शुरू हो रही के लिए डैनियल Zenklusen और रॉबर्ट सिंगर धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vanadyl Ribonucleoside Complex NEB S1402S
Lyticase Sigma L5263
E. coli tRNA Roche 1010954001
BSA (RNase free) Ambion
Beta-mercapt–thanol Fisher 03446l
DAPI, dilactate Sigma D9564
PBS 10X (RNase free) Ambion AM9624
Triton X-100 Shelton Scientific
Dextran sulfate Sigma D6001 Or equivalent
Saline-sodium citrate (SSC) 20X VWR 82021-484
Formamide (deionized) Ambion AM9342
Nuclease-free water Ambion AM9932
Alpha-D-glucose Sigma 158968 For GLOX solution
1 M Tris-HCl, pH 8.0 Ambion AM9855G
100% Ethanol
Glucose oxidase Sigma G0543 For GLOX solution
Catalase Sigma C3155 For GLOX solution
Concanavalin A MP Biomedicals 150710
Polylysine (0.01%) Sigma P8920
Coverslips Warner Instruments Cs-18R15
Prolong Gold Mounting Medium Invitrogen P36934
QIAquick Nucleotide Removal Kit QIAGEN 28304
FISH Probes Biosearch Technologies Custom order for your desired mRNA sequence
Glass bottom 96-well plates Nunc 265300 Alternative to coverslips
12-well plates BD Falcon 351143
Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes GE Healthcare monofunctional NHS-ester
EQUIPMENT
Plasma-Preen I Cleaner Terra Universal 9505-00 Controller (Cat #9505-17 optional)
Vacuum Pump Alcatel 205SDMLAM For operating Plasma-Preen
Widefield Fluorescence Microscope Olympus IX81 Or equivalent
100X objective Olympus 1-UB617R
Light Source X-Cite XCT 10-A Or equivalent
Filter Sets Chroma U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR.
Cooled CCD or EMCCD Camera Hamamatsu C4742-98-24ER

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References

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प्रतिदीप्ति का प्रयोग mRNA अणुओं के दृश्य और विश्लेषण<em&gt; स्वस्थानी</emमें&gt; संकरण<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
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McIsaac, R. S., Silverman, S. J., Parsons, L., Xu, P., Briehof, R., McClean, M. N., Botstein, D. Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (76), e50382, doi:10.3791/50382 (2013).More

McIsaac, R. S., Silverman, S. J., Parsons, L., Xu, P., Briehof, R., McClean, M. N., Botstein, D. Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (76), e50382, doi:10.3791/50382 (2013).

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