Fermentoren worden gebruikt voor cultuur opbrengst en productiviteit van bioengineered cellen te verhogen. Na het screenen van meerdere microbiële en dierlijke celkweek kandidaten in schudflessen, de volgende logische stap is om biomassa de geselecteerde cultuur met de vergister te verhogen. Deze video toont de installatie en bediening van een typisch benchtop bioreactor systeem.
Fermentatie systemen worden gebruikt om een optimale groei omgeving voor vele verschillende soorten celculturen. De mogelijkheid geboden door fermentoren zorgvuldig controleren temperatuur, pH en zuurstofgehalte in het bijzonder zijn ze essentieel voor efficiënte groei en grootschalige expressie van fermentatieproducten. Deze video zal kort de voordelen van de fermentor via schudfles. Het zal ook de belangrijkste componenten van een typische benchtop fermentatie systeem te identificeren en geeft basis instructie over de installatie van het schip en de kalibratie van de sondes. De kijker maakt kennis met het sterilisatieproces en getoond hoe het groeimedium te enten in het vat met cultuur. Basisbegrippen van de operatie, de bemonstering, en de oogst zal ook worden gedemonstreerd. Eenvoudige gegevensanalyse en systeem opschonen worden besproken.
Basic fermentatie technologie is een uitbreiding van de eenvoudige schudkolf techniek voor groeiende kweken. Het is ontstaan uit de wens om de groei omgevingen voor levende culturen in een meer volledige en kwantitatieve manier te beheersen. Batch cultuur schudflessen zijn meestal beperkt door onnauwkeurige controle van de temperatuur. Temperatuur uniformiteit in een bebroede shaker of warme kamer is zeer variabel, soms afdwalen 5 ° C of meer van de beoogde setpoint. Sinds de schudfles normaal geroerd bij een vaste snelheid, zuurstofopname en gasuitwisseling is beperkt. Zodra het beschikbare omgevingslicht zuurstof is uitgeput, de meeste culturen niet gedijen. Er is geen pH-regeling in schudflessen. In veel gevallen, wanneer de kweek niet beperkt uitgangsmateriaal, het zuur wordt tot het punt van aantasting van de cultuur en de ademhaling vertraagt dramatisch. Meest schudkolf culturen worden ook uitgevoerd als een "partij", hetgeen betekent dat zij slechts eenmaal op of nabij het begin van de kweken gevoed inoculation. Na deze koolstofbron wordt verbruikt, de cultuur stopt met groeien. In sommige gevallen kan het metabolisme veranderen en beginnen andere metabolieten consumeren in de kweekbouillon, soms die de kenmerken van de resulterende biomassa of eiwit. Schudkolven ook meestal media verdampingsverlies in warmere omgevingen cultuur, typisch 10% van het volume per 24 uur bij 37 ° C onderworpen Dit verlies verandert de dichtheid van de cultuur en verbiedt langere termijn werking van het systeem. Tenslotte kan de gebruiker geconfronteerd schuimende van de media na roeren. Het optreden van schuim in de bovenruimte boven de cultuur zal de gasuitwisseling en de verdere groei knie te beperken.
De basis fermentatiesysteem is ontworpen om al deze beperkingen te pakken. Zorgvuldige temperatuurregeling in fermentatievaten bereikt door het gebruik van drijvende agitatie en verwarmingsmantel. Een sensor geplaatst in het vat en feedback regeling van verwarming en koeling van deze jas meestalResultaten temperatuurregeling ± 0,1 ° C om de streefwaarde. Tafelmodel fermentors algemeen bieden controle van de pH via vloeibare reagens door een pomp. De pH-waarde wordt continu gecontroleerd in een poging om de optimale omgeving voor celgroei houden. Een goede beluchting wordt gehandhaafd door de bovengenoemde mengen waaier of de infusie van lucht of zuurstof aangevuld gas direct in de cultuur. Met afschuifgevoelige culturen, zuurstof aangevuld gas is het belangrijkste mechanisme voor het onderhoud van zuurstofgehalte in de cultuur. Meting van zuurstof in oplossing wordt gewoonlijk bereikt door een polarografische probe die niet normaal beschikbaar voor gebruik in schudkolven. Het is ook mogelijk om voer continu of periodiek toevoegen vaartuig groei in een lineaire of exponentiële wijze te handhaven. Het uitlaatgas condensor zorgt voor een koud oppervlak voor damp in de uitlaatgasstroom te condenseren, waardoor cultuur volume en dichtheid behoud. Periodieke toevoeging van antischuim oppervlakteactieve bediendeen geleidbaarheidssonde in de cultuur, waardoor schuim op het oppervlak en waardoor gasuitwisseling.
Het schip, met alle sondes, fittingen, waaiers, oogst pijpen en buizen, is gemonteerd en gesteriliseerd in een standaard autoclaaf. Na de laatste sonde kalibraties en stabilisatie werkomgeving, wordt de cultuur toegevoegd aan het vat. Het systeem kan dan worden gebruikt om de kweek te karakteriseren op een manier die meer kwantitatief en nauwkeuriger dan met schudflesmethode. Strakke controle van de temperatuur, pH, zuurstofgehalte, voeropname, vloeistof verdampen en schuim niveaus dragen een veel hogere biomassa en betere eiwitopbrengst.
Geroerde tank bioreactoren zijn de standaard in de biotechnologie-industrie en zijn gebruikt voor meer dan 40 jaar 1. De kleine geroerde tank is belangrijk geweest voor scale-up, schaal-down, stam optimalisatie, karakterisering en procesontwikkeling. Zij kunnen ook een belangrijke rol in de ontwikkeling van geïndividualiseerde geneeskunde 2. De kleinschaligheid bioreactor is het meest vergelijkbaar met in situ-omstandigheden voor celgroei, omdat het kan worden gecontroleerd en geoptimaliseerd gedurende een run. Meestal worden initiële experimenten uitgevoerd met schudkolven maar de omstandigheden in de bioreactor kleinschalige aanzienlijk van de schudfles. In een experiment bleek dat de voorwaarden voor een optimale groei van E. coli en productie van Green Fluorescent Protein (GFP) in de schudkolf niet vertalen naar de geroerde tank (ongepubliceerde gegevens).
Andere methoden van groeiende cellen in grote schaal met roller flessen, een Use schudplatform bioreactoren 3 en grotere single use bioreactoren met het werken volumes van 50 tot 5000 L. Elke methode biedt uitdagingen voor scale-up, maar heeft een plaats in de productie gevonden. Het eenmalig gebruik schudapparaat bioreactor is vergelijkbaar met de geroerde tank en geeft een gereguleerde omgeving. Het verschilt van de geroerde tank die menging optreedt als gevolg van een schommelende beweging golven naar cel bezinking te voorkomen en oxygenatie genereren. De hydrodynamica van deze werkwijze verschillen van de geroerde tank en het maximale beperkt tot 1000 L. De verschillen kunnen celgroei en productie van het product beïnvloeden. Andere eenmalig gebruik systemen combineren de geroerde tank met de beschikbare reactor, een platform met een minimum aan infrastructuur en bijbehorende overhead, en het vermogen voor hoge-doorvoer bioprocessing 4.
Nieuwe gebruikers van stationaire Bioreactoren kunnen moeite bepalen eerste setpoints voor pH, pO 2 en TEM hebbentemperatuur, maar gepubliceerd onderzoek kan worden verwezen naar deze informatie 5, 6, 7, 8, 9. Met bacteriële culturen name wordt aanbevolen roeren beginnen met dezelfde snelheid als de schudkolf en de temperatuur op dezelfde gewenste. Cultuur pH van afgelopen schudflessen runs kan ook gebruikt worden als uitgangspunt. Instelling van de pO 2 waarde moeilijker en wordt meestal empirisch bepaald. Echter, te beginnen met 50% pO 2 is een aanbevolen uitgangspunt.
The authors have nothing to disclose.
Dit project was steun voor een deel door de Johns Hopkins University, Bureau van de Provost via de Gateway Science Initiative.
Name | Company | Catalog Number |
LB broth | Sigma | L3022 |
ampicillin | Sigma | A1593-25G |
LB broth | Sigma | L3022 |
antifoam 204 | Sigma | A8311 |
1 M Sodium Hydroxide | Sigma | 38215-1EA-R |
Reference Buffer, pH 4.00 | Sigma | B5020 |
Reference Buffer, pH 7.00 | Sigma | B4770 |
pO2 probe electrolyte | Broadley James | AS-3140-C30-0025 |
0.45 micron filter | Cole Parmer | EW-02915-22 |
0.22 micron filter | Cole Parmer | EW-29950-40 |
Luer Lock syringe, 10 mL | Cole Parmer | EW-07940-12 |
Minifors Bioreactor | Infors HT | B-Pack 5.0 |
Air Admiral air pump | Cole Parmer | EW-79202-00 |
1175 PD Chilling circulator | VWR | 13721-204 |