Nøjagtig masse målinger udgør et vigtigt skridt i forbindelse med undersøgelsen af proteiner. Matrix-assisteret laser desorption / ionisering (MALDI) massespektrometri (MS) kan anvendes til en sådan bestemmelse og dens centrale fordel er tolerance over for salte, rengøringsmidler og forurenende stoffer. Her har vi illustrere en tilgængelig fremgangsmåde til analyse af proteiner større end 100 kDa ved hjælp af MALDI-MS.
Effektivt bestemme masser af proteiner er afgørende for mange biologiske undersøgelser (f.eks for Strukturel Biologi undersøgelser). Nøjagtig masse bestemmelse gør det muligt at vurdere rigtigheden af protein primære sekvenser tilstedeværelsen af mutationer og / eller post-translationelle modifikationer, den mulige proteinnedbrydning, prøve homogenitet, og graden af isotop inkorporering i tilfælde af mærkning (f.eks 13C mærkning ).
Electrospray ionization (ESI) massespektrometri (MS) er almindeligt anvendt til massebestemmelse af denaturerede proteiner, men dets effektivitet er påvirket af sammensætningen af prøvebuffer. Især tilstedeværelsen af salte, rengøringsmidler og forurenende stoffer alvorligt underminerer effektiviteten af protein analyse af ESI-MS. Matrix-assisteret laser desorption / ionisering (MALDI) MS er et attraktivt alternativ på grund af dens salt tolerance og enkelhed erhvervelse og fortolkning af datation. Endvidere skal den masse beslutsomhed af store heterogene proteiner (større end 100 kDa) er lettere ved MALDI-MS på grund af fraværet af overlappende høj ladning statslige distributioner som er til stede i ESI spektre.
Her præsenterer vi en tilgængelig metode til at analysere proteiner større end 100 kDa ved MALDI-time søgning (TOF). Vi illustrerer fordelene ved anvendelse af en blanding af to matricer (dvs. 2,5-dihydroxybenzoesyre og α-cyano-4-hydroxykanelsyre) og nytten af det tynde lag fremgangsmåde som metode til prøve deposition. Vi diskuterer også den kritiske rolle af matricen og solvens renhed af de standarder, der anvendes til kalibrering af laseren energi og af købet tid. Samlet giver vi nødvendige oplysninger til en novice til analyse intakte proteiner større end 100 kDa ved MALDI-MS.
Strukturel biologi bygger på produktion af proteiner af høj kvalitet 1 og skal derfor kobles med effektive og pålidelige teknikker til proteinanalyse 2,3. I vores massespektrometri (MS) laboratorium i et institut for strukturel biologi vi nødt til at bekræfte den primære sekvens af proteiner, evaluere forekomsten af mutationer og posttranslationelle modifikationer, nedbrydning af proteiner, prøve homogenitet, og kvaliteten af isotopisk mærkning (f.eks deutereret proteiner til nukleare magnetiske resonans undersøgelser 4). Da strukturelle biologer bruger begrænset proteolyse at skelne strukturelt stive domæner fra fleksible dele, vi skal pålideligt karakterisere sådanne trunkerede proteiner ved hjælp af MS.
Når biomolekyler analyseres ved MS, er to mulige tilgange udnyttes til blødt ioniserer sådanne tunge og labile molekyler. Electrospray ionization (ESI) ioniserer molekyler direkte fravæskefase 5, matrix-assisteret laser desorption ionisering (MALDI), at biomolekyler er co-krystalliseret med ultraviolet-absorberende organiske molekyler (dvs. matrixmolekyler) 6.
ESI time-of-flight (TOF) MS koblet til væskekromatografi er blevet en rutine teknik til analyse af intakte proteiner, fordi det giver massebestemmelse med høj nøjagtighed (≤ 50 ppm). Men det er ganske modtagelig for sammensætningen af prøvebuffer (især salte og detergenter) og forurenende stoffer (dvs. polymerer), der undertiden er vanskeligt at fjerne, der forårsager undertrykkelse af analytten signal.
MALDI-TOF MS udgør et effektivt alternativ til ESI-MS, fordi dens resultater er mindre påvirket af bufferkomponenter, rengøringsmidler og forurenende stoffer, og giver intakt protein masse beslutsomhed med tilstrækkelig nøjagtighed (≤ 500 ppm) for sekvens validering. Efter Protein fordøjelse, MALDI-TOF MS kan også anvendes til at analysere de opnåede peptider til yderligere bekræftelse primære sekvens af såkaldte "peptide mass fingerprinting".
I vores hænder, massebestemmelse af intakte proteiner, som er større end 100 kDa og heterogene (på grund af ændringer eller trunkeringer), er lettere ved MALDI-MS end ved hjælp af ESI-MS. Dette skyldes manglen på overlappende ladningstilstand distributioner stede i ESI spektre. Eftersom MALDI proces er ikke afhængig af analysanden størrelse 7 sådanne metode giver høj følsomhed, når et biomolekyle masse er over 100 kDa. Bemærkelsesværdig analyser af intakte proteiner blev udført ved hjælp af hjemmelavede instrumenter mellem slutningen af 1980'erne og begyndelsen af 1990'erne 8-11.
MALDI-TOF kan også anvendes som screeningsværktøj til at vurdere kvaliteten af protein prøver, fordi den kræver mindre tid til prøveforberedelse og er mindre modtagelige for FORSTYRRELces på grund af fælles urenheder (fx salte). Efter en første, hurtig evaluering af MALDI-MS, kan en prøve yderligere analyseres ved ESI-TOF at bestemme dens masse med højere nøjagtighed. Desuden MALDI genererer ioner, der indeholder færre afgifter end ESI og dermed erhverve og fortolke MALDI data mere ligetil. Dette giver eleverne arbejder i strukturel biologi til at analysere deres rekombinante proteiner lige efter en kort uddannelse.
To vigtige faktorer har indflydelse på kvaliteten af MALDI spektre: matricen og den anvendte teknik til matrixaflejring (f.eks tørret dråbe 8 og tyndt lag 12-16,17,18). En enkelt organisk matrix [f.eks sinapininsyre (SA) 19-21 eller α-cyano-4-hydroxykanelsyre (α-CHCA) 14,22,23] bruges ofte til MS undersøgelse af intakte proteiner og tværbundne protein-komplekser . Brug α-CHCA, Chait gruppe tidligere præsenteret en detaljeret protokol for preparing en ultra tyndt lag før MALDI analyse af opløselige og membranproteiner 14,15. For nylig Gorka et al. Illustreret grafit-baserede Målovertræksvægten at forbedre MALDI analyse af peptider og proteiner ved α-CHCA som matricen 24.
Her præsenterer vi en simpel protokol til analyse af intakte proteiner ved MALDI-TOF MS, udnytte en blanding af to matricer: 2,5-dihydroxybenzoesyre (DHB) og α-CHCA 25. Vi systematisk evalueret udførelsen af DHB-CHCA mix i forhold til SA og α-CHCA matricer, til kontrol af intakte proteiner. Matrixblandingen tillader en bedre opløsning (dvs. protein toppe er meget skarpere). Desuden er tilstedeværelsen af intense flere gebyrer ioner (dvs. M +2 H 2 +, M +3 H 3 +, etc.) giver mulighed for en mere nøjagtig massebestemmelse fordi opløsningen aksiale MALDI-TOF instrumenter er højere ved lavere masse og ladning (m / z) 26. Dette er særligt nyttigt til bestemmelse af molekylvægt af proteiner er større end 100 kDa.
Højere følsomhed er også nået ved hjælp af DHB-CHCA blanding (0,5 pmol af protein spottet på MALDI mål).
Som vi har nævnt ovenfor, en vigtig faktor, der bør overvejes, når du bruger MALDI instrument er matrix deposition. Foreslået Laugesen et al. Anvendelsen af DHB-CHCA blandingen for første gang 25, udnytte den tørrede dråber deposition. Men vi observeret bedre resultater (f.eks meget højere følsomhed), når vi udnyttet det tynde lag metode, hvor det første lag er dannet af α-CHCA opløst i acetone. Det tynde lag metoden 12,27 indebærer dannelsen af en homogen undergrund af matrix-krystaller på MALDI mål, som blev beskrevet i en Jove video tidligere 15. Derefter prøven aflejres på dette substrat, og endeligyderligere matrix belægningen (se nedenfor). I denne artikel vil vi også illustrere, hvordan at deponere prøven på MALDI mål, men også hvordan man kan rense målet 15, at rekrystallisere og forberede matricer.
Til slut vi sigter mod at give alle de nødvendige oplysninger for at analysere intakte proteiner til forskere (især strukturelle biologer), der har brug for at evaluere kvaliteten af producerede proteiner i en hurtig og enkel måde, og der ikke er så fortrolige med MALDI-TOF MS. Som forudsagt i midten af 1990'erne 28 MS har haft en øget effekt på biologisk forskning, som dens tilgængelighed for biologer er steget. Vi håber, at de oplysninger, vi forudsat, vil være nyttigt at MALDI-TOF tilgængelig for biologer og forskere, der gerne vil begynde at bruge massespektrometri.
Vi præsenterede en detaljeret protokol til at opnå høj kvalitet massespektre af store intakte proteiner med molekylvægte større end 100 kDa, under anvendelse af et MALDI-TOF-instrument. Et antal kritiske aspekter vedrørende forberedelse prøve bør nøje overvejes for at forbedre kvaliteten af den masse spektre. Matricer og opløsningsmidler med høj renhed er af afgørende betydning, fordi alle de forurenende stoffer i de matricer og opløsningsmidler er koncentreret om MALDI-målet efter solvent fordampning. For at øge renheden af MALDI matricer er det muligt at rense dem ved hjælp af klassiske omkrystallisation metoder (se ovenfor). Vi anbefaler også, at frisk forberede matricer løsninger (mindst en gang om ugen) for at afhjælpe den matrix krystallisering og for at undgå matrixnedbrydning.
Matricen deposition fremgangsmåde er meget kritisk for den endelige kvalitet af spektrene. Som beskrevet ovenfor er det tynde lag metode er vores metode of. valg 12. Desuden optimeres vi fremgangsmåde til afsætning af det første lag. Når matrixen er opløst i acetone til opnåelse af en mættet opløsning, den propanon muliggør hurtig afdampning af opløsningsmidlet, men gør størrelsen af det første lag er meget vanskeligt at kontrollere også. Vi foreslår at bruge en GELoader tip som lille pensel, som du dypper i matrix_acetone løsning for at få et minimum volumen, som du hurtigt deponere på målet. Størrelsen af det første lag på en måde styrer den endelige størrelse af MALDI stedet: en lille plet (dvs. 0,5-0,75 mm i diameter) er at foretrække, fordi i dette tilfælde koncentrationen af prøven er højere end i tilfælde af en stor plet. Erhvervelse af en lille plet adskiller sig fra den ultra-tynde lag tilgang tidligere foreslået i en JOVE video 15. I Fenyo et al. Det tynde lag løsningen er spredt over hele MALDI mål ved hjælp af den side af en pipettespids. Denne tilgang kræver afprøvning af tynde lag, som bør opfylde specifikke kriterier(Fx hastigheden af fordampning af opløsningsmidlet). Hvis kriteriet ikke er opfyldt, bør MALDI mål vaskes og et nyt tyndt lag skal være forberedt. Dette gør forberedelse ganske arbejdskrævende for en nybegynder. Desuden aflejring af prøven / matrix-blanding på pladen kræver aspiration af overskydende opløsningsmiddel ved hjælp af et vakuum linje og et vasketrin hjælp TFA 15 er nødvendig, hvilket gør Fenyo et al. Forberedelse lidt mere vanskeligt end vores tilgang.
Forholdet volumen mellem matricen og prøven er ganske vigtigt for en vellykket analyse af intakte proteiner ved MALDI-TOF. Efter at have testet forskellige forhold foreslår vi at anvende en 1:1. En anden matrix: stikprøveproportion kan kompromittere kvaliteten af spektre, sandsynligvis på grund af inhomogen krystallisering. Den rækkefølge, som matrix og prøve deponeres er også kritisk. Efter deponering matrixen tyndt lag prøven aflejres og umiddelbart efter (før Sample spot bliver tør) tilføjes CHCA_DHB blandingen. Denne procedure er blevet defineret som "sandwich-metoden" 27, hvor prøven alene er deponeret mellem to matrixlag. Som et alternativ kan CHCA_DHB opløsning, og prøven blandes i 0,5 ml rør og derefter spottet på CHCA tynde lag 12. Dette giver en plet med en homogen lag af krystaller resulterer i høj kvalitet spektre. Ved analyse proteiner med en lavere masse end 100 kDa, koncentrationen af DHB kan øges (fx 60:40 DHB: CHCA), og det kan producere skarpere top, men kan kompromittere målingen følsomhed (dvs. mindre intense toppe).
For en korrekt kalibrering af instrumenter, er det vigtigt at deponere Kalibratoren standarder meget tæt på prøven pletter, tillader en at opnå en bedre masse nøjagtighed. A "pseudo-intern kalibrering procedure" blev tidligere foreslået 15: efter erhvervelsen af en prøve spektret kalibrant plet is laser skud og signal af kalibrant føjes til prøvens spektrum. Dette giver dig mulighed internt kalibrere prøvens spektrum ved hjælp af kalibrator toppe.
Laseren energi omhyggeligt bør kontrolleres også under spektre købet. I de fleste tilfælde højere energi øger følsomheden, men sænker opløsningen. Vi foreslår at bruge den mindst mulige laser energi uden at gå på kompromis med følsomheden af erhvervelsen. Endvidere, for at forbedre spektral kvalitet, kan man erhverve flere skud på hver prøve stedet. Normalt flere skud du erhverve (1000-2000 skud), jo højere intensitet af signalet. Ved at ramme plet med laser, er man nødt til at finde den rigtige position (dvs. "sweet spot"), da prøven ikke er homogent fordelt. Du kan optage på det samme område, indtil signalet er stigende, og derefter forsøge at finde et andet område, der indeholder prøven.
Afslutningsvis høj renhed af matricer og solvforældre, de anvendte metoder til prøven og matricer aflejring på målet, position de anvendte standarder til kalibrering, intensiteten af laser energi, tidspunktet for erhvervelsen (antal skud / spot) er kritiske faktorer, som man bør tage hensyn til, når analyse intakte proteiner ved MALDI-TOF MS.
Forfatter Bidrag
LS og EBE designet eksperimenter, udført de massespektrometri eksperimenter, analyserede data, og skrev manuskriptet.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Christophe Masselon (iRTV, CEA, Grenoble), og medlemmer af virusinfektion og Cancer Gruppe på IBS, for deres kritiske evaluering af manuskriptet og for nyttige drøftelser. Vi er taknemmelige for Cyril Dian for den slags gave af proteinet CRM1. Denne videnskabelige arbejde fandt sted i massespektrometri anlægget af Grenoble Instruct Center (ISBG, UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL). Det blev støttet af den franske infrastruktur for Integrated Strukturel Biologi Initiative (FRISBI, ANR-10-InSb-05-02), GRAL (ANR-10.-LabX-49-01) [i Grenoble partnerskab for Strukturel Biologi] og ved det franske Nationale Center for Videnskabelig Forskning (CNRS).
REAGENTS | |||
Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | |
Trizima | Sigma | T6066 | |
Micro Bio-Spin 6 chromatography columns | Bio-Rad | 732-6221 | |
Vivaspin 500 | Sartorius | VS0122 | various molecular weight cut off |
Methanol | Fluka | 14262 | |
Ethanol | Fluka | 02860 | |
KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark | 05511 | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | C8982 | |
Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
2,5-dihydroxybenzoic acid | Fluka | 39319 | |
GELoader Tips | Eppendorf | 0030 001.222 | |
Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
Formic acid | Fluka | 09676 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
Protein Standard II | Bruker Daltonics | 207234 | It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine |
Immunoglobulin G | ABSciex | GEN602151 | |
[header] | |||
EQUIPMENT | |||
Water purifier PURELAB Ultra Analytic | ELGA LabWater | 89204-052 | |
Autoflex MALDI-TOF instrument | Bruker Daltonics | ||
MALDI-TOF target | Bruker Daltonics |