बड़े पैमाने पर माप प्रोटीन की जांच के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है. मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण (MALDI) मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) ऐसे निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इसके प्रमुख लाभ लवण, डिटर्जेंट और contaminants के लिए सहनशीलता है. यहाँ हम MALDI एमएस द्वारा 100 केडीए से बड़ा प्रोटीन के विश्लेषण के लिए एक सुलभ दृष्टिकोण को दर्शाता है.
प्रभावी रूप से प्रोटीन की जनता का निर्धारण (संरचनात्मक जीव विज्ञान की जांच के लिए जैसे) कई जैविक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है. सटीक जन दृढ़ संकल्प एक प्रोटीन प्राथमिक दृश्यों की शुद्धता का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता है, परिवर्तन और / या बाद translational संशोधनों, संभव प्रोटीन गिरावट, नमूना एकरूपता, और लेबलिंग के मामले में आइसोटोप समावेश की डिग्री (जैसे 13 सी लेबलिंग की उपस्थिति ).
Electrospray आयनीकरण (ईएसआई) मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) व्यापक रूप से विकृत प्रोटीन की जन निर्धारण के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन अपनी क्षमता का नमूना बफर की रचना से प्रभावित है. विशेष रूप से, लवण, डिटर्जेंट, और contaminants की उपस्थिति गंभीर रूप से ईएसआई एमएस द्वारा प्रोटीन विश्लेषण के प्रभाव को नजरअंदाज. मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण (MALDI) एमएस इसकी वजह से नमक सहिष्णुता और डाटा अधिग्रहण और interpreta की सादगी के लिए एक आकर्षक विकल्प हैtion. इसके अलावा, बड़ी विषम प्रोटीन (बड़ी से 100 केडीए) की बड़े पैमाने पर दृढ़ संकल्प के कारण ईएसआई स्पेक्ट्रा में मौजूद हैं जो उच्च आरोप राज्य वितरण ओवरलैपिंग के अभाव के MALDI एमएस द्वारा आसान है.
यहाँ हम उड़ान (TOF) की MALDI समय से 100 केडीए से बड़ा प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए एक सुलभ दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं. हम दो matrices (यानी 2,5-dihydroxybenzoic एसिड और α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड) के मिश्रण और नमूना बयान के लिए दृष्टिकोण के रूप में पतली परत पद्धति की उपयोगिता का उपयोग कर लाभ दर्शाते हैं. हम भी लेजर ऊर्जा की जांच के लिए इस्तेमाल किया मानकों की मैट्रिक्स और विलायक पवित्रता की महत्वपूर्ण भूमिका पर चर्चा, और अधिग्रहण के समय की. कुल मिलाकर, हम MALDI एमएस द्वारा 100 केडीए से बड़ा बरकरार प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए एक नौसिखिया के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करते हैं.
स्ट्रक्चरल बायोलॉजी उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन 1 के उत्पादन पर निर्भर करता है और इसलिए प्रोटीन विश्लेषण 2,3 के लिए कुशल और विश्वसनीय तकनीक के साथ युग्मित किया जाना चाहिए. संरचनात्मक जीव विज्ञान के एक संस्थान के भीतर हमारे मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) प्रयोगशाला में हम प्रोटीन की प्राथमिक अनुक्रम की पुष्टि करने की जरूरत है, परिवर्तन और posttranslational संशोधनों की उपस्थिति का मूल्यांकन, प्रोटीन की गिरावट, नमूना एकरूपता, और समस्थानिक लेबलिंग की गुणवत्ता (जैसे deuterated परमाणु चुंबकीय अनुनाद के अध्ययन के लिए प्रोटीन 4). संरचनात्मक जीव लचीला भागों से संरचनात्मक रूप से कठोर डोमेन भेद करने के लिए सीमित proteolysis उपयोग करते हैं, हम मज़बूती से एमएस का उपयोग ऐसे छोटा प्रोटीन चिह्नित करने के लिए की जरूरत है.
Biomolecules एमएस से विश्लेषण कर रहे हैं, तो दो संभावित दृष्टिकोण धीरे इस तरह के भारी और अस्थिर अणुओं ionise के लिए उपयोग किया जाता है. Electrospray आयनीकरण (ईएसआई) से सीधे अणुओं ionisesतरल चरण 5, मैट्रिक्स की मदद से desorption लेजर आयनीकरण (MALDI) biomolecules पराबैंगनी अवशोषित कार्बनिक अणुओं (यानी मैट्रिक्स अणु) 6 के साथ सह सघन रहे हैं कि आवश्यकता है.
यह (50 पीपीएम ≤) उच्च सटीकता के साथ बड़े पैमाने पर दृढ़ संकल्प की अनुमति देता है, क्योंकि ईएसआई समय की उड़ान (TOF) एमएस तरल क्रोमैटोग्राफी के लिए युग्मित बरकरार प्रोटीन के विश्लेषण के लिए एक नियमित तकनीक बन गया है. हालांकि, यह (नमक और डिटर्जेंट के लिए विशेष रूप से) नमूना बफर की रचना करने के लिए और analyte संकेत के दमन के कारण, कभी कभी खत्म करने के लिए मुश्किल हो जाता है, जो contaminants (यानी पॉलिमर) के लिए काफी संभावना है.
MALDI-TOF एमएस इसके प्रदर्शन को कम बफर घटकों, डिटर्जेंट और contaminants से प्रभावित है क्योंकि ईएसआई एमएस करने के लिए एक कारगर विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है, और अनुक्रम सत्यापन के लिए (500 पीपीएम ≤) पर्याप्त सटीकता के साथ बरकरार प्रोटीन जन दृढ़ संकल्प की अनुमति देता है. Protei के बादn पाचन, MALDI-TOF एमएस भी तथाकथित "पेप्टाइड जन फिंगरप्रिंटिंग 'से आगे प्राथमिक अनुक्रम पुष्टि करने के लिए प्राप्त पेप्टाइड्स का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.
हमारे हाथ में, 100 केडीए से बड़ा और कारण (संशोधन या truncations के लिए) विषम हैं जो बरकरार प्रोटीन, की बड़े पैमाने पर दृढ़ संकल्प, ईएसआई एमएस द्वारा की तुलना में MALDI एमएस द्वारा आसान है. इस ईएसआई स्पेक्ट्रा में मौजूद ओवरलैपिंग आरोप राज्य के वितरण की कमी के कारण है. इसके अलावा, MALDI प्रक्रिया analyte आकार 7, ऐसी विधि पैदावार उच्च संवेदनशीलता के आश्रित नहीं है क्योंकि एक बायोमोलिक्यूल जन 100 केडीए ऊपर है. बरकरार प्रोटीन की उल्लेखनीय विश्लेषण 1980 के अंत और 1990 के 8-11 की शुरुआत के बीच घर में बने उपकरणों का उपयोग किया गया.
यह नमूना तैयार करने के लिए कम समय की आवश्यकता है और interferen के लिए कम संभावना है क्योंकि MALDI-TOF भी प्रोटीन के नमूने की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शन उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैआम दोष (जैसे लवण) के कारण CES. MALDI एमएस द्वारा एक पहले, त्वरित मूल्यांकन के बाद, एक नमूना आगे उच्च सटीकता के साथ अपने बड़े पैमाने पर निर्धारित करने के लिए ईएसआई-TOF से विश्लेषण किया जा सकता है. इसके अलावा, MALDI ईएसआई की तुलना में कम शुल्क युक्त आयनों उत्पन्न करता है और इसलिए अधिक सरल MALDI डेटा है प्राप्त करने और व्याख्या. यह संरचनात्मक जीव विज्ञान में काम कर रहे छात्रों को सिर्फ एक संक्षिप्त प्रशिक्षण के बाद उनके पुनः संयोजक प्रोटीन का विश्लेषण करने की अनुमति देता है.
मैट्रिक्स और मैट्रिक्स बयान (जैसे सूखे छोटी बूंद 8 और पतली परत 12-16,17,18) के लिए तकनीक का इस्तेमाल: दो महत्वपूर्ण कारकों MALDI स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता प्रभावित करते हैं. एक एकल जैविक मैट्रिक्स [जैसे sinapinic एसिड (एसए) 19-21 या α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड (α-CHCA) 14,22,23] अक्सर बरकरार प्रोटीन और पार से जुड़े प्रोटीन परिसरों की एमएस परीक्षा के लिए प्रयोग किया जाता है . Α-CHCA का प्रयोग, CHAIT समूह पहले से पी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुतपूर्व घुलनशील और झिल्ली प्रोटीन 14,15 के MALDI विश्लेषण करने के लिए एक अति पतली परत reparing. हाल ही में, Gorka एट अल. मैट्रिक्स के रूप में 24 α-CHCA का उपयोग पेप्टाइड और प्रोटीन की MALDI विश्लेषण में सुधार करने के लिए ग्रेफाइट आधारित लक्ष्य कोटिंग सचित्र.
2,5-dihydroxybenzoic एसिड (DHB) और α-CHCA 25: यहाँ, हम दो matrices के एक मिश्रण का उपयोग, MALDI-TOF एमएस द्वारा बरकरार प्रोटीन के विश्लेषण के लिए एक सरल प्रोटोकॉल उपस्थित थे. हम व्यवस्थित बरकरार प्रोटीन के नियंत्रण के लिए, एसए और α-CHCA matrices की तुलना DHB-CHCA मिश्रण के प्रदर्शन का मूल्यांकन किया. मैट्रिक्स मिश्रण एक बेहतर समाधान (प्रोटीन चोटियों बहुत तेज हैं आईई) की अनुमति देता है. इसके अलावा, तीव्र कई आरोपों आयनों की मौजूदगी (यानी एम 2 एच + 2, एम 3 एच 3 +, आदि) अक्षीय MALDI-TOF उपकरणों का संकल्प कार्यभार कम द्रव्यमान में अधिक है क्योंकि (एक अधिक सटीक जन दृढ़ संकल्प सक्षम बनाता हैमी / z) 26. यह 100 केडीए से बड़ा प्रोटीन की आणविक वजन निर्धारण के लिए विशेष रूप से उपयोगी है.
उच्च संवेदनशीलता भी DHB-CHCA मिश्रण (MALDI लक्ष्य पर देखा प्रोटीन के 0.5 pmoles) का उपयोग कर पहुँच जाता है.
हम ऊपर उल्लेख किया है, MALDI साधन का उपयोग करते समय विचार किया जाना चाहिए कि एक महत्वपूर्ण कारक मैट्रिक्स बयान है. Laugesen एट अल. सूखे छोटी बूंद बयान का उपयोग, पहली बार 25 के लिए DHB-CHCA मिश्रण के उपयोग का प्रस्ताव रखा. हम पहली परत एसीटोन में भंग α-CHCA द्वारा बनाई है जहां पतली परत विधि का उपयोग करते हैं, तथापि, हम बेहतर परिणाम (जैसे बहुत अधिक संवेदनशीलता) मनाया. पतली परत विधि 12,27 पहले 15 एक जौव वीडियो में वर्णित किया गया था जो MALDI लक्ष्य, पर मैट्रिक्स क्रिस्टल का एक सजातीय बुनियाद के गठन का तात्पर्य. फिर, नमूना अंत में इस बुनियाद पर जमा है, औरअतिरिक्त मैट्रिक्स (नीचे देखें) जमा है. इस अनुच्छेद में, हम भी MALDI लक्ष्य पर नमूना जमा करने के लिए वर्णन कैसे, लेकिन यह भी लक्ष्य 15 साफ करने के लिए, recrystallize के लिए, और matrices तैयार करते हैं.
हम सब (विशेष रूप से, संरचनात्मक जीव) के वैज्ञानिकों को बरकरार प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक जानकारी एक तेजी से और सरल तरीके से उत्पादित प्रोटीन की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने की जरूरत है, जो है और जो उपलब्ध कराने के उद्देश्य समाप्त करने के लिए MALDI-TOF एमएस के साथ इतना परिचित नहीं हैं. 1990 के मध्य 28 में भविष्यवाणी की, एमएस जीव को अपनी पहुंच में वृद्धि हुई है, के रूप में जैविक अनुसंधान पर एक बढ़ा प्रभाव पड़ा है. हम दी गयी जानकारी मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग शुरू करना चाहते हैं जो जीव और वैज्ञानिकों के लिए MALDI-TOF सुलभ बनाने के लिए उपयोगी हो जाएगा उम्मीद है.
हम एक MALDI-TOF उपकरण का उपयोग कर, 100 केडीए से बड़ा आणविक भार के साथ बड़े बरकरार प्रोटीन की उच्च गुणवत्ता जन स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए एक विस्तार प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया. नमूना तैयार करने के विषय में महत्वपूर्ण पहलुओं की संख्या को ध्यान से जन स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता में सुधार के क्रम में विचार किया जाना चाहिए. Matrices और विलायकों में मौजूद सभी contaminants विलायक वाष्पीकरण के बाद MALDI लक्ष्य पर केंद्रित कर रहे हैं क्योंकि matrices और उच्च शुद्धता की विलायकों महत्वपूर्ण महत्व के हैं. MALDI matrices की शुद्धता बढ़ाने के लिए आदेश में यह (ऊपर देखें) शास्त्रीय recrystallization तरीकों का उपयोग कर उन्हें शुद्ध करने के लिए संभव है. हम भी हौसले मैट्रिक्स क्रिस्टलीकरण उन्नति और मैट्रिक्स गिरावट से बचने के लिए (कम से कम सप्ताह में एक बार) matrices के समाधान की तैयारी करने की सलाह देते हैं.
मैट्रिक्स बयान दृष्टिकोण स्पेक्ट्रा के अंतिम गुणवत्ता के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. ऊपर वर्णित है, पतली परत विधि हमारे विधि ओ हैएफ चुनाव 12. इसके अलावा, हम पहली परत जमा करने के लिए दृष्टिकोण अनुकूलित. मैट्रिक्स एक संतृप्त समाधान प्राप्त करने के लिए एसीटोन में भंग कर रहा है, जब propanone विलायक का तेजी से वाष्पीकरण की अनुमति देता है, लेकिन यह भी नियंत्रित करने के लिए पहली परत का आकार बहुत कठिन बना देता है. हम आपको जल्दी से लक्ष्य पर जमा जो एक न्यूनतम मात्रा प्राप्त करने के लिए matrix_acetone समाधान में डुबकी उस छोटे ब्रश के रूप में एक GELoader टिप का उपयोग कर सुझाव देते हैं. पहली परत के आकार के किसी भी तरह MALDI मौके के अंतिम आकार को नियंत्रित करता है: इस मामले में नमूना एकाग्रता एक बड़े मौके के मामले में की तुलना में अधिक है क्योंकि एक छोटी सी जगह (व्यास की यानी 0.5-0.75 मिमी) बेहतर है. एक छोटी सी जगह प्राप्त करने के पहले एक जौव वीडियो 15 में प्रस्तावित अल्ट्रा पतली परत दृष्टिकोण से अलग है. Fenyo बारे में एट अल. पतली परत समाधान सभी एक विंदुक टिप की ओर का उपयोग MALDI लक्ष्य में फैला हुआ है. यह दृष्टिकोण विशिष्ट मानदंडों को पूरा करना चाहिए, जो पतली परत परीक्षण की आवश्यकता(विलायक वाष्पीकरण की जैसे गति). कसौटी मिले नहीं है, MALDI लक्ष्य धोया जाना चाहिए और एक नया पतली परत तैयार किया जाना चाहिए. यह एक नौसिखिया के लिए तैयारी काफी श्रमसाध्य बनाता है. इसके अलावा, थाली पर नमूना / मैट्रिक्स मिश्रण के बयान Fenyo बारे एट अल. तैयारी हमारे दृष्टिकोण की तुलना में थोड़ा अधिक कठिन बना रही है, एक शून्य रेखा और TFA 15 का उपयोग करते हुए एक कपड़े धोने कदम का उपयोग अतिरिक्त विलायक की आकांक्षा आवश्यक है की आवश्यकता है.
मैट्रिक्स और नमूना के बीच मात्रा अनुपात MALDI-TOF द्वारा बरकरार प्रोटीन का एक सफल विश्लेषण के लिए काफी महत्वपूर्ण है. विभिन्न अनुपात के परीक्षण के बाद हम एक 1:1 के अनुपात का उपयोग करने के लिए सुझाव देते हैं. एक अलग मैट्रिक्स: नमूना अनुपात की वजह से शायद inhomogeneous क्रिस्टलीकरण के लिए, स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता में समझौता कर सकता है. मैट्रिक्स और नमूना जमा कर रहे हैं जिस क्रम में भी महत्वपूर्ण है. मैट्रिक्स पतली परत जमा करने के बाद, नमूना जमा किया जाता है और तुरंत samp से पहले (के बादLe स्पॉट) सूखी हो जाती है CHCA_DHB मिश्रण में जोड़ा जाता है. यह प्रक्रिया अकेले नमूना दो मैट्रिक्स परतों के बीच जमा है जहां "सैंडविच विधि" 27 के रूप में परिभाषित किया गया है. एक विकल्प के रूप में, CHCA_DHB समाधान और नमूना 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में मिलाया जा सकता है और फिर CHCA पतली परत 12 पर देखा. यह उच्च गुणवत्ता स्पेक्ट्रा में जिसके परिणामस्वरूप क्रिस्टल का एक समरूप परत के साथ एक स्थान अर्जित करता है. इस तेज पीक उत्पादन कर सकते हैं, लेकिन माप संवेदनशीलता (यानी कम तीव्र चोटियों) समझौता हो सकता है;: एक बड़े पैमाने पर कम से कम 100 केडीए, DHB की एकाग्रता के साथ प्रोटीन विश्लेषण (CHCA जैसे 60:40 DHB) बढ़ाया जा सकता है.
एक सही साधन अंशांकन के लिए यह एक बेहतर जन सटीकता प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है, नमूना स्पॉट के बहुत करीब calibrant मानकों जमा करने के लिए आवश्यक है. एक "छद्म आंतरिक अंशांकन प्रक्रिया" पहले 15 सुझाव दिया गया था: एक नमूना स्पेक्ट्रम, calibrant स्पॉट मैं के अधिग्रहण के बादcalibrant की लेजर शॉट और संकेत नमूना स्पेक्ट्रम के लिए जोड़ रहे हैं. यह आपको करने के लिए आंतरिक रूप से calibrant चोटियों का उपयोग नमूना स्पेक्ट्रम जांचना अनुमति देता है.
लेजर ऊर्जा भी ध्यान से स्पेक्ट्रा अधिग्रहण के दौरान नियंत्रित किया जाना चाहिए. ज्यादातर मामलों में, उच्च ऊर्जा संवेदनशीलता बढ़ जाती है, लेकिन इस प्रस्ताव को कम करती है. हम अधिग्रहण की संवेदनशीलता समझौता किए बिना संभव न्यूनतम लेजर ऊर्जा का उपयोग कर सुझाव देते हैं. इसके अलावा, वर्णक्रमीय गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, एक प्रत्येक नमूने की मौके पर ही अधिक शॉट प्राप्त कर सकते हैं. आम तौर पर अधिक शॉट आप (1,000-2,000 शॉट्स) के अधिग्रहण, संकेत की तीव्रता अधिक है. लेजर के साथ हाजिर जब मार, एक नमूना homogenously वितरित किया जाता है के बाद से, सही स्थिति (यानी "मीठी हाजिर") खोजने की जरूरत है. आप संकेत बढ़ रही है जब तक एक ही क्षेत्र पर गोली मार, और तब नमूना युक्त एक और क्षेत्र खोजने की कोशिश कर सकते हैं.
Matrices और solv के समापन, उच्च शुद्धता मेंपिता, नमूना और लक्ष्य पर matrices के बयान के लिए इस्तेमाल किया तरीकों, अंशांकन, लेजर ऊर्जा की तीव्रता, अधिग्रहण के समय (शॉट्स / स्पॉट की संख्या) के लिए इस्तेमाल किया मानकों की स्थिति जब एक ध्यान में रखना चाहिए कि महत्वपूर्ण कारक हैं MALDI-TOF एमएस द्वारा बरकरार प्रोटीन का विश्लेषण.
लेखक योगदान
लोकसभा और EBE, प्रयोगों बनाया गया मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगों का प्रदर्शन, डेटा का विश्लेषण, और पांडुलिपि लिखा था.
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण मूल्यांकन के लिए और उपयोगी विचार विमर्श के लिए, IBS पर डॉ. क्रिस्टोफ Masselon (iRTV, सीईए, ग्रेनोबल) और वायरल संक्रमण के सदस्यों और कैंसर समूह धन्यवाद. हम प्रोटीन Crm1 की तरह उपहार के लिए सिरिल भारतीय के लिए आभारी हैं. इस वैज्ञानिक काम ग्रेनोबल आज्ञा केंद्र (; UMS 3518 CNRS-सीईए UJF-EMBL ISBG) के मास स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा में जगह ले ली. यह आर्थिक रूप से एकीकृत स्ट्रक्चरल बायोलॉजी पहल (FRISBI, ANR-10-InSb-05-02) के लिए फ्रेंच इंफ्रास्ट्रक्चर द्वारा समर्थित किया गया था, GRAL (ANR-10-LabX-49-01) [ग्रेनोबल भागीदारी के भीतर स्ट्रक्चरल बायोलॉजी के लिए] और से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए फ्रांस के राष्ट्रीय केंद्र (CNRS).
REAGENTS | |||
Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | |
Trizima | Sigma | T6066 | |
Micro Bio-Spin 6 chromatography columns | Bio-Rad | 732-6221 | |
Vivaspin 500 | Sartorius | VS0122 | various molecular weight cut off |
Methanol | Fluka | 14262 | |
Ethanol | Fluka | 02860 | |
KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark | 05511 | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | C8982 | |
Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
2,5-dihydroxybenzoic acid | Fluka | 39319 | |
GELoader Tips | Eppendorf | 0030 001.222 | |
Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
Formic acid | Fluka | 09676 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
Protein Standard II | Bruker Daltonics | 207234 | It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine |
Immunoglobulin G | ABSciex | GEN602151 | |
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EQUIPMENT | |||
Water purifier PURELAB Ultra Analytic | ELGA LabWater | 89204-052 | |
Autoflex MALDI-TOF instrument | Bruker Daltonics | ||
MALDI-TOF target | Bruker Daltonics |