Nøyaktig massemåling representerer et viktig skritt i løpet av etterforskningen av proteiner. Matrix-assistert laser desorpsjon / ionisering (MALDI) massespektrometri (MS) kan bli brukt for denne bestemmelse, og dens viktigste fordelen er toleransen til salter, vaskemidler og forurensninger. Her vil vi illustrere en tilgjengelig metode for analyse av proteiner som er større enn 100 kDa ved MALDI-MS.
Effektivt å bestemme masser av proteiner er avgjørende for mange biologiske studier (bl.a. for strukturbiologi undersøkelser). Nøyaktig masse bestemmelse gjør det mulig å evaluere riktigheten av protein primære sekvenser, tilstedeværelsen av mutasjoner og / eller post-translasjonelle modifikasjoner, den mulige proteinnedbrytning, prøven homogeniteten, og graden av isotop inkorporering i tilfelle av merking (f.eks 13 C merking ).
Elektrospray ionisasjon (ESI) massespektrometri (MS) er mye brukt for masse bestemmelse av denaturerte proteiner, men dens effektivitet påvirkes av sammensetningen av prøvebuffer. Spesielt nærvær av salter, vaskemidler og forurensninger sterkt svekker effektiviteten av proteinanalyse ved ESI-MS. Matrix-assistert laser desorpsjon / ionisering (MALDI) MS er et attraktivt alternativ, på grunn av sin salttoleranse og enkelheten av datainnsamling og tolkningersjon. Videre er massen bestemmelse av store heterogene proteiner (større enn 100 kDa) lettere ved MALDI-MS på grunn av fravær av overlappende høye kostnader staten fordelinger som er til stede i ESI-spektra.
Her presenterer vi en tilgjengelig metode for å analysere proteiner større enn 100 kDa av MALDI-time of Flight (TOF). Vi illustrerer fordelene ved å bruke en blanding av to matriser (dvs. 2,5-dihydroksybenzosyre og α-cyano-4-hydroxycinnamic syre) og nytten av det tynne laget Fremgangsmåte tilnærming for prøve deponering. Vi diskuterer også den kritiske rollen som matrisen og væske renhet, av standardene som brukes til kalibrering, av laser energi, og av oppkjøpet tid. Samlet gir vi informasjon som er nødvendig for en nybegynner for å analysere intakte proteiner større enn 100 kDa av MALDI-MS.
Strukturell biologi er avhengig av produksjonen av høy kvalitet proteiner 1, og derfor må være kombinert med effektive og pålitelige teknikker for proteinanalyse 2,3. I vår massespektrometri (MS) innenfor laboratorie et institutt for strukturell biologi trenger vi å bekrefte primære sekvens av proteiner, evaluere nærværet av mutasjoner og modifikasjoner posttranslational, nedbrytning av proteiner, prøven homogeniteten, og kvaliteten av isotopisk merking (f.eks deuterert proteiner for kjernemagnetisk resonans-studier 4). Siden strukturelle biologer bruker begrenset proteolyse å skille strukturelt stive domener fra fleksible deler, trenger vi å pålitelig karakterisere slike avkortede proteiner ved hjelp av MS.
Når biomolekyler ble analysert ved MS, er to mulige tilnærminger benyttes for å mykt ionisere slike tunge og labile molekyler. Electro ionisering (ESI) ioniserer molekylene direkte fravæskefase 5, matrix-assistert laser desorpsjon ionisering (MALDI) krever at biomolekyler er co-krystallisert med ultrafiolett-absorberende organiske molekyler (dvs. matrise molekyler) 6.
ESI time-of-flight (TOF) MS koplet til væskekromatografi er blitt en rutinemessig teknikk for analyse av intakte proteiner, fordi den tillater massebestemmelse med høy nøyaktighet (≤ 50 ppm). Det er imidlertid ganske utsatt for sammensetningen av prøvebuffer (spesielt salter og vaskemidler), og til forurensninger (dvs. polymerer) som er noen ganger vanskelig å fjerne, slik at undertrykkelse av analytten signal.
MALDI-TOF MS representerer et effektivt alternativ til ESI-MS fordi ytelsen er mindre påvirket av bufferkomponenter, vaskemidler og forurensninger, og lar intakt protein massebestemmelse med tilstrekkelig nøyaktighet (≤ 500 ppm) for sekvens validering. Etter Proteinkonn fordøyelse, MALDI-TOF MS kan også benyttes til å analysere de oppnådde peptider for ytterligere bekreftelse primære sekvensen ved den såkalte "peptid masse fingerprinting".
I våre hender, massebestemmelse av intakte proteiner, som er større enn 100 kD og heterogene (på grunn av endringer eller trunkeringer), er enklere ved MALDI-MS enn ved ESI-MS. Dette er på grunn av mangel på overlappende ladetilstand fordelinger som er tilstede i ESI-spektra. Dessuten, siden den MALDI prosessen er ikke avhengig av analytten størrelse 7, slik fremgangsmåte gir høy følsomhet når et biomolekyl massen er over 100 kDa. Bemerkelsesverdig analyser av intakte proteiner ble utført ved hjelp av hjemmelagde instrumenter mellom slutten av 1980-tallet og begynnelsen av 1990-tallet 8-11.
MALDI-TOF kan også brukes som screening verktøy for å vurdere kvaliteten på protein prøver fordi det krever mindre tid for prøveopparbeidelse, og er mindre utsatt for FORSTYRRELCES grunn av vanlige urenheter (f.eks salter). Etter en første, rask evaluering av MALDI-MS, kan en prøve bli ytterligere analysert av ESI-TOF å bestemme massen med høyere nøyaktighet. Videre genererer MALDI ioner som inneholder færre kostnader enn ESI og derfor anskaffe og tolke MALDI data blir mer oversiktlig. Dette gjør at studentene arbeider i strukturbiologi å analysere sine rekombinante proteiner rett etter en kort opplæring.
To viktige faktorer som påvirker kvaliteten av MALDI-spektra: matriksen og den teknikk som brukes for matrisen deponering (f.eks tørket dråpe 8 og tynt lag 12-16,17,18). En enkelt organisk matrise [f.eks sinapinic syre (SA) 19-21 eller α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (α-CHCA) 14,22,23] blir ofte brukt for MS undersøkelse av intakte proteiner og cross-linked protein komplekser . Ved hjelp av α-CHCA, Chait gruppe tidligere presentert en detaljert protokoll for preparing en ultra tynt lag før MALDI analyse av løselige og membran proteiner 14,15. Nylig Gorka et al. Illustrert grafitt-basert mål belegg for å forbedre MALDI analyse av peptider og proteiner ved hjelp av α-CHCA matriks som 24.
Her presenterer vi en enkel protokoll for analyse av intakte proteiner ved MALDI-TOF MS, å benytte en blanding av to matriser: 2,5-dihydroksybenzosyre (DHB) og α-CHCA 25.. Vi systematisk undersøkt utførelsen av DHB-CHCA blanding i forhold til de SA og α-CHCA matriser, for kontroll av intakte proteiner. Matrisen Blandingen tillater en bedre oppløsning (det vil si proteintopper er mye skarpere). Videre har nærværet av intens flere kostnader ioner (det vil si M +2 H 2 +, M +3 H 3 +, osv.) muliggjør en mer nøyaktig massebestemmelse fordi oppløsningen aksiale MALDI-TOF instrumenter er høyere ved lavere masse over kostnad (m / z) 26. Dette er spesielt nyttig for molekylvektbestemmelse av proteiner som er større enn 100 kDa.
Høyere følsomhet er også nås ved hjelp av DHB-CHCA blanding (0,5 pmol protein oppdaget på MALDI mål).
Som nevnt ovenfor, er en viktig faktor som må tas i betraktning ved hjelp av MALDI instrumentet er matrisen deponering. Laugesen et al. Foreslått bruk av DHB-CHCA blandingen for første gang, 25, ved hjelp av den tørkede dråpeavsetningen. Imidlertid ble det observert bedre resultater (f.eks mye høyere sensitivitet) når vi benyttet det tynne laget metode hvor det første lag er dannet av α-CHCA oppløst i aceton. Det tynne sjikt-metoden 12,27 innebærer dannelsen av et homogent substrat i matriks-krystaller på MALDI målet, som ble beskrevet i en jove video tidligere 15. Deretter blir prøven avsatt på dette substrat, og endeligytterligere matrise er avsatt (se nedenfor). I denne artikkelen har vi også illustrere hvordan å sette prøven på MALDI målet, men også hvordan du rengjør målet 15, til recrystallize, og forberede matrisene.
For å konkludere vi tar sikte på å gi all nødvendig informasjon for å analysere intakte proteiner til forskere (særlig strukturelle biologer) som trenger å evaluere kvaliteten på produsert proteiner i en rask og enkel måte, og som ikke er så kjent med MALDI-TOF MS. Som spådd i midten av 1990-tallet 28, har MS hadde en økt betydning for biologisk forskning, som sin tilgjengelighet til biologer har økt. Vi håper at informasjonen vi blir gitt vil være nyttig å gjøre MALDI-TOF tilgjengelig for biologer og forskere som ønsker å begynne å bruke massespektrometri.
Vi har presentert en detalj protokoll for å skaffe høy kvalitet massespektra av store intakte proteiner med molekylvekter som er større enn 100 kDa, med en MALDI-TOF instrument. En rekke kritiske aspekter vedrørende prøvepreparering bør vurderes nøye for å forbedre kvaliteten på massespektra. Matriser og løsningsmidler med høy renhetsgrad er av avgjørende betydning fordi alle forurensninger som er tilstede i matrisene og oppløsningsmidler er konsentrert på MALDI målet etter inndampning oppløsningsmiddel. For å øke renheten av MALDI matrikser er det mulig å rense dem ved hjelp av klassiske metoder for omkrystallisasjons (se ovenfor). Vi anbefaler også å nystekte forbereder matrisene løsninger (minst en gang i uken) for å bøte matrisen krystallisering og for å unngå matriksdegradering.
Matriksen deponering tilnærming er svært viktig for den endelige kvalitet av spektrene. Som beskrevet ovenfor, er det tynne laget fremgangsmåte vår metode of valg 12. Videre har vi optimalisert metode for avsetning av det første lag. Når grunnmassen er oppløst i aceton for å oppnå en mettet oppløsning, lar propanon hurtig fordampning av oppløsningsmidlet, men også gjør størrelsen av det første laget er svært vanskelig å kontrollere. Vi foreslår at du bruker en GELoader tips så lite børste som du dypper i matrix_acetone løsning for å få et minimumsvolum som du raskt sette inn på målet. Størrelsen av det første laget eller annen måte styrer den endelige størrelsen av MALDI flekk: en liten flekk (dvs. 0,5 til 0,75 mm i diameter) er å foretrekke, fordi i dette tilfellet prøvekonsentrasjonen er høyere enn i tilfellet av en stor flekk. Innhenting av en liten flekk er forskjellig fra den ultra-tynt lag tilnærming tidligere foreslått i en JOVE video 15. I Fenyo et al. Det tynne laget løsningen er spredt over hele MALDI målet med siden av en pipettespiss. Denne tilnærmingen krever testing av det tynne laget som skal tilfredsstille visse kriterier(For eksempel hastighet av fordampningen løsningsmiddel). Dersom kriteriet ikke er oppfylt, må MALDI målet skal vaskes, og et nytt tynt lag skal fremstilles. Dette gjør forberedelsene ganske arbeidskrevende for en nybegynner. Videre avsetning av prøven / matriseblandingen på plate krever aspirasjon av det overskytende oppløsningsmiddel ved hjelp av en vakuumledning, og et vasketrinn ved hjelp av TFA 15 er nødvendig, noe som gjør Fenyo et al. Preparat litt vanskeligere enn vår tilnærming.
Volumforholdet mellom matrisen og prøven er svært viktig for en vellykket analyse av intakte proteiner ved MALDI-TOF. Etter å ha testet ulike forholdstall foreslår vi å bruke et 1:1-forhold. En annen matrise: andel prøven kunne kompromittere kvaliteten på spektra, sannsynligvis på grunn av inhomogene krystallisering. Rekkefølgen som matrise og prøven avsettes er også kritisk. Etter deponering matrisen tynt lag, prøven avsettes og umiddelbart etter (før sample flekk blir tørr) den CHCA_DHB blandingen tilsettes. Denne fremgangsmåten er blitt definert som "sandwich-metoden" 27, hvor prøven alene er deponert mellom to matriselagene. Som et alternativ, kan den CHCA_DHB løsning og prøven blandes i 0,5 ml rør og deretter flekket på CHCA tynt lag 12.. Dette gir en flekk med et homogent sjikt av krystaller resulterer i høykvalitets-spektra. Ved analyse av proteiner med en masse lavere enn 100 kDa, konsentrasjonen av DHB kan økes (for eksempel 60:40 DHB: CHCA), og dette kan gi skarpere topp, men kan gå ut over målefølsomhet (dvs. mindre intense topper).
For en korrekt instrumentkalibrering, er det viktig å sette de Calibrant standarder svært nær de små punkter, slik at man får en bedre masse nøyaktighet. En "pseudo-intern kalibreringsprosedyren" ble tidligere foreslått 15: etter oppkjøpet av en prøve spekteret, den kalibrerings sted jegs laser skutt og signal av kalibrerings legges til prøven spekteret. Dette gjør at du kan internt kalibrere prøven spekteret ved hjelp av kalibrerings toppene.
Laseren energi bør også nøye kontrollert i løpet av spektra oppkjøpet. I de fleste tilfeller øker høyere energi-følsomheten, men senker oppløsning. Vi foreslår at du bruker minst mulig laser energi uten at det går utover følsomheten av oppkjøpet. Videre, for å forbedre spektral kvalitet, kan man skaffe flere skudd på hver prøve spot. Normalt flere skudd du erverver (1,000-2,000 skudd), jo høyere er intensiteten av signalet. Når trykket stedet med laser, må man finne riktig posisjon (dvs. "sweet spot"), siden utvalget ikke er homogent fordelt. Du kan skyte på samme område før signalet er økende, og deretter prøve å finne et annet område som inneholder prøven.
I konklusjonen, høy renhet av matriser og solventene, de metoder som brukes for prøven og matriser deponering på målet, plasseringen av standardene som brukes til kalibrering, intensiteten av laser energi, oppkjøpstidspunktet (antall skudd / spot) er kritiske faktorer som man bør ta hensyn til når analysere intakte proteiner ved MALDI-TOF MS.
Forfatter bidrag
LS og EBE designet forsøkene, utført massespektrometri eksperimenter, analysert data, og skrev manuskriptet.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Christophe Masselon (iRTV, CEA, Grenoble) og medlemmer av virusinfeksjon og Cancer Group ved IBS, for deres kritisk vurdering av manuskriptet og for nyttige diskusjoner. Vi er takknemlige for Cyril Dian for den type gave av proteinet Crm1. Dette vitenskapelige arbeidet fant sted i massespektrometri innretningen av Grenoble Instruere Centre (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL). Det ble finansielt støttet av den franske Infrastruktur for Integrert strukturbiologi Initiative (FRISBI, ANR-10-INSB-05-02), GRAL (ANR-10-LabX-49-01) [i Grenoble Partnerskap for strukturbiologi] og etter den franske nasjonale senter for vitenskapelig forskning (CNRS).
REAGENTS | |||
Trizma hydrochloride | Sigma | T3253 | |
Trizima | Sigma | T6066 | |
Micro Bio-Spin 6 chromatography columns | Bio-Rad | 732-6221 | |
Vivaspin 500 | Sartorius | VS0122 | various molecular weight cut off |
Methanol | Fluka | 14262 | |
Ethanol | Fluka | 02860 | |
KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark | 05511 | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | C8982 | |
Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
2,5-dihydroxybenzoic acid | Fluka | 39319 | |
GELoader Tips | Eppendorf | 0030 001.222 | |
Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
Formic acid | Fluka | 09676 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
Protein Standard II | Bruker Daltonics | 207234 | It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine |
Immunoglobulin G | ABSciex | GEN602151 | |
[header] | |||
EQUIPMENT | |||
Water purifier PURELAB Ultra Analytic | ELGA LabWater | 89204-052 | |
Autoflex MALDI-TOF instrument | Bruker Daltonics | ||
MALDI-TOF target | Bruker Daltonics |