Den här videon kommer att illustrera en snabb, effektiv metod för metakrylatbaserade poly (etylenglykol), som möjliggör kedja polymeriseringar och hydrogel syntes. Det kommer att visa hur man på motsvarande sätt införa metakrylamid funktioner till peptider, detalj gemensamma analysmetoder för att bedöma funktion effektivitet, ge förslag på felsökning och avancerade ändringar, och visar typiska hydrogel karakteriseringsmetoder.
En av de viktigaste fördelarna med att använda poly (etylenglykol) (PEG) makromererna i hydrogel bildning är syntetiskt mångsidighet. Möjligheten att dra av en stor variation av PEG-molekylvikter och konfigurationer (arm nummer, armlängd, och förgrening mönster) ger forskare god kontroll över vilket hydrogel strukturer och egenskaper, inklusive Youngs modul och maskstorlek. Den här videon kommer att illustrera en snabb, effektiv, lösningsmedelsfritt, mikrovågsassisterad metod för metakrylatbaserade PEG prekursorer i poly (etylenglykol) dimetakrylat (PEGDM). Denna syntesmetod ger välbehövliga utgångsmaterial för applikationer inom drug delivery och regenerativ medicin. Den visade metoden är överlägsen traditionella methacrylation metoder eftersom det är betydligt snabbare och enklare samt mer ekonomisk och miljövänlig användning av mindre mängder av reagens och lösningsmedel. Vi kommer också att visa en anpassning av denna teknik för att på-harts methacrylamid funktionalisering av peptider. Denna on-harts metod tillåter N-terminalen av peptider som skall funktionaliseras med metakrylamid-grupper före avskyddning och klyvning från hartset. Detta möjliggör selektiv tillsats av metakrylamid-grupper till N-terminalen av peptiderna medan aminosyror med reaktiva sidogrupper (t ex primär amin av lysin, primär alkohol av serin, sekundära alkoholer av treonin och fenol av tyrosin) förblir skyddade, förebygga funktion på multipla ställen. Denna artikel kommer detalj vanliga analysmetoder (proton-NMR-spektroskopi (H-NMR) och Matrix Assisted laserdesorptionsjonisering Time of Flight masspektrometri (MALDI-TOF)) för att bedöma effektiviteten i de funktionalise. Vanliga fallgropar och föreslog felsökningsmetoder kommer att tas upp, som vilje modifieringar av teknik som kan användas för att ytterligare trimma makromer funktionalitet och resulte hydrogel fysiska och kemiskaegenskaper. Användning av syntetiserade produkter för bildandet av hydrogel för drug delivery-och cell-material interaktionsstudier kommer att demonstreras, med särskild uppmärksamhet ägnas åt att modifiera hydrogelkomposition att påverka maskstorlek, kontrollerar hydrogel styvhet och läkemedelsdosering.
Poly (etylenglykol) (PEG) hydrogel är vanliga biomaterial som används inom regenerativ medicin och drogleveransapplikationer 1-3. Dessa hydrogeler erbjuder betydande fördelar jämfört med andra biomaterial. PEG-hydrogeler är syntetiska, som erbjuder en hög grad av kontroll över tekniska egenskaper såsom elasticitetsmodul och nedbrytningshastighet jämfört med deras naturliga biomaterial motsvarigheter 1. Eftersom de är syntetiskt framställda, har PEG betydligt mindre sats till sats variabilitet kontra naturligt framställda material 4. På grund av den kemiska sammansättningen av PEG, är dessa hydrogeler är mycket hydrofila, är resistenta mot proteinadsorption och biokompatibel 3. Detta motstånd mot proteinadsorption tillåter PEG hydrogel för att fungera som ett "oskrivet blad", gör det möjligt för forskare att förhöra och studera specifika biologiska eller kemiska faktorer (droger, biomolekyler, cellvidhäftnings peptider, etc.) och de specifika roller dessa factors spela i att kontrollera cell-och / eller vävnadsbeteende.
Klicka här för att visa en större bild .
Figur 1: Exempel på poly (etylenglykol) (PEG) arkitekturer A) Linjär PEG B) 4-armad PEG med en pentaerytritol kärna C) 8-armad PEG med en hexaglycerol kärna D) 8-armad PEG med en…. tripentaerytritol kärna. n är antalet PEG upprepas på varje arm. Varje upprepning har en molekylvikt av 44 g / mol, därför n kan beräknas från den totala molekylvikten och strukturen / arm #.
PEG-prekursorer finns med en mängd olika arkitekturer och molekylvikter (Figur 1 ). Variation av arkitektur (arm #) och etylenglykol upprepningar (n) av PEG kan användas för att styra egenskaperna hos hydrogel nätverk bildade av dessa makromerer. Omodifierad PEG innehåller terminala hydroxylgrupper som måste ersättas med en alternativ funktion för att underlätta kovalent tvärbindning via polymerisationer, den mest vanligen använda tvärbindningsstrategi för PEG hydrogel, innan bildandet av hydrogel nätverk. Det finns en mängd olika kemiska grupper som kan ingå i PEG-makromerer att underlätta polymerisation och nätverkstvärbindning (akrylat, metakrylat, vinyleter, norbomen, etc.). Trots olika terminal funktioner tillgängliga för att underlätta tvärbindning, finns det bara två mekanismer som polymerisering kan inträffa: steg-och chain-tillväxt (eller en blandning av de två, mixed-mode).
g2.jpg "width =" 600px "/>
Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2:.. Teoretisk hydrogel nätverk schema A) Traditionella kedja tillväxt polymerisationsresultat i heterogena nätverk som innehåller tät poly (metakrylat) tvärbindande regioner och ökad nätverks nonidealities såsom loopar, oreagerade prekursorer och permanenta förvecklingar B) Steg-tillväxt polymerisationsresultat i signifikant mer homogena nätverksstrukturer (ej skalenlig).
Funktioner som tvärbinder via kedja-tillväxt polymerisation inte kräver närvaro av en extra tvärbindningsmedel. Men kedjan-polymeriserade hydrogeler producerar heterogena nätverksstrukturer som innehåller täta tvärbindningsregioner (Figur 2A) 1. Däremot steg-tillväxt polymerisation requires användning av ett tvärbindningsmedel eller sam-monomer, som är reaktiv med de terminala funktionella grupperna i PEG makromerer. Eftersom de terminala funktionella grupperna på PEG endast kan reagera med tvärbindningsmedlet och tvärbindningsmedlet kan endast reagera med de terminala funktionella grupperna på PEG resulterar detta i större nätverksstruktur homogenitet (figur 2B) 1. Steg-tillväxt polymerisationer också vanligtvis leder till högre omvandling av funktionella grupper, minska mängden oreagerade prekursorer och potential för immun / inflammatoriska reaktioner på grund av lösliga, oregistrerade makromerer 1. Mixed-mode polymerisationsmetoder har också utvecklats som kombinerar både steg-och chain-tillväxt polymerisation genom användning av makromerer som kan både själv reagerar (chain-tillväxt) och reagerar med ett tvärbindningsmedel (steg-tillväxt). Detta ger hydrogeler med egenskaperna för varje polymerisation mekanism, och kan användas för att framställa mer komplexa, olika nätstrukturer än enderasteg-eller enbart 1 kedja tillväxtnätverk.
Medan det finns en uppsjö av funktionella grupper, vilka kan användas för att funktionalisera PEG och underlätta hydrogel formation, metakrylater och norbornener är några av de vanligaste kedja-och steg-tillväxt polymerisationsbetingelser molekyldelar, respektive. Båda dessa funktioner erbjuder utmärkt Spatiotemporal kontroll över nätverks polymerisation, och när den används för att kapsla in celler, dessa nätverk stöder hög total cellöverlevnads 5-7. Dimetakrylat funktionaliserad PEG (PEGDM) tvärbindning via kedjepolymerisering och tillåter inkorporeringen av biomolekyler eller andra faktorer genom sampolymerisation med akrylat-, metakrylat-, eller på liknande sätt-functionalized biomolekyler 5,6. PEGDM hydrogeler har betydande fördelar jämfört med alternativa chain-tillväxt polymerisationssystem såsom akrylat funktionalis PEG (PEGDA). Med traditionella metoder, kan PEGDA syntetiseras snabbare än PEGDM; hoWever, med hjälp av mikrovågsassisterad syntes är PEGDM syntes ännu effektivare. PEGDA ofta syntetiseras i övernatt 8 eller 24-hr 9-reaktioner, men kan också syntetiseras i fyra timmar vid förhöjda temperaturer 10. PEGDM är också traditionellt syntetiseras genom att reagera över natten 11 eller under 24 timmar 5, med vissa metoder utökning av reaktionstiden till 4 dagar 12. Använda mikrovågsassisterad metod demonstreras här, kan PEGDM framställas i en 5 minuters reaktion. Medan PEGDM har långsammare reaktionskinetik än PEGDA 13, är tvärbindningsreaktionen för PEGDM fortfarande snabbt, inträffar inom några minuter, och uppnår större makromer omvandling än PEGDA som den ökade hydrofobiciteten hos metakrylatgrupp ökar funktionell grupp aggregering i lösning och därmed öka sannolikheten för radikal överföring och metakrylat omställning 14. PEGDM hydrogel är också förknippade med ökad cell livskraft och tillväxtjämfört med PEGDA hydrogel, sannolikt på grund av minskning av reaktionshastigheten vid en viss tidpunkt, vilket minskar radikalt koncentration och oreagerade makromerer nuvarande 14. Tiol-en-polymerisationer, såsom de med användning av norbornen-funktionaliserad PEG (PEGN) bildar hydrogeler via steg-tillväxt polymerisation, och kräver användning av PEGN och ett tvärbindningsmedel som innehåller i genomsnitt mer än två funktionella grupper. Sedan thiyl radikaler reagerar med norbornen-kol-kol-dubbelbindningar, multi-tiol-innehållande tvärbindningsmedel som vanligen används för att tvärbinda PEGN hydrogeler, som möjliggör facile inkorporering av peptider med cystein aminosyror funktionaliteter 7. Medan det finns många andra kemiska sammansättningar som reagerar via steg-tillväxt polymerisation (Michael-additionsreaktioner såsom tiol-akrylat 15 och tiol-vinylsulfon 16, "klicka" reaktioner såsom alkynen-azid 17 etc), tiol-norbomen hydrogeler är mycket vanligt, eftersom belastningen frånden norbornen ringen avsevärt ökar reaktionshastigheten och minskar risken för att den norbornen dubbelbindningen som undergår kedjepolymerisering 7.
Beslutet mellan metakrylat, norbomen, eller suppleant funktionalisering för att underlätta hydrogel bildningen bygger till stor del på det tillvägagångssätt. Till exempel har kedja-tillväxt polymeriserad PEGDM nätverk visats som väl lämpad för att styra cell lokalisering i utvecklingen av en vävnadstekniska periostet 18,19. Steg-tillväxt polymeriserade PEG-nät är bättre lämpade för inkorporering av peptidsekvenser för att underlätta enzymatiskt lyhörd hydrogel nedbrytning på grund av lättheten att införlivandet av enzymsubstratsekvenser med hjälp av tiol (cystein) som innehåller peptider och norbornen funktion makromerer 20. Om forskningsfrågan ska hanteras bäst med hjälp av steg-tillväxt hydrogel, Fairbanks et al. Ger en detaljerad beskrivning av norbornene funktion strategi för PEG-7. Denna uppsats kommer detalj hur PEG och peptidsekvenser kan funktionaliseras (med en metakrylat för PEG, och en metakrylamid för peptider) för kedjan polymerisationsreaktionerna.
Traditionellt är PEGDM produceras genom att reagera PEG med metakryloyl-klorid och trietylamin i diklorometan. Reaktionen tillåts att fortskrida vid rumstemperatur över natten 11 eller under 24 timmar 5, med några metoder, som sträcker sig reaktionstiden till 4 dagar 12 före filtrering, utfällning i dietyleter, och samling. Även om många variationer av denna metod finns, alla är tidsödande, kräver en stor mängd kemiska syntesmaskiner och är inte miljövänliga, eftersom de inbegriper användning av relativt stora mängder av högrena reagens och lösningsmedel. För att kringgå dessa begränsningar, Lin-Gibson et al. Utvecklat en mikrovågsassisterad, lösningsmedelsfri metod att functionalize PEG med te rminal metakrylatgrupper (Figur 3A) 12. I denna reaktion de terminala alkoholgrupper av PEG reagera med en av karbonylgrupperna atomer av metakrylsyra-anhydrid för bildning av en karboxylgrupp. Detta genererar PEGDM produkt, med metakrylsyra som en sidoprodukt. Denna syntes har många av de karakteristiska fördelarna med mikrovågssyntes, inklusive minskad reaktionstid och lösningsmedelsfria syntesmetoder 21. Den mikrovågssyntes är att föredra framför de tidigare diskuterade metoder eftersom det är betydligt snabbare, kräver mindre omfattande syntesutrustning (t.ex. glas, reaktionsplattor), och använder mindre total reagens och lösningsmedel mängder som lösningsmedel behövs bara för produktrening / insamling och inte för syntes, vilket gör det mer ekonomiskt och miljövänligt.
0px "/>
Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3:. Funktionalise Schema A) Poly (etylenglykol) bringas att reagera med 10x molöverskott metakrylsyra-anhydrid för att framställa poly (etylenglykol) metakrylat B) Samma metod kan användas för att funktionalisera den N-terminalen av peptidsekvenser som bildar en. metakrylamid funktion peptid. Genom att utföra denna procedur innan klyvning av peptiden från hartset, kan selektiv funktionalisering av N-terminalen utföras som sidogrupper aminosyra förblir skyddad. n: antal PEG upprepar i makromeren (n = 45,5, 227 och 455, respektive, för 2, 10 och 20 kDa linjär PEG används). R1-RN: aminosyrasidokedjor. PG1 till PGN: sidokedjeskyddsgrupper. TFA: trifluorättiksyra. TIPS: triisopropylsilan. Dodt: 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol. H2O: vatten.
Den mikrovågsassisterad methacrylation metod har nyligen anpassats av vår grupp att funktionalisera N-terminalen av peptider med metakrylamid-grupper (figur 3B) för att underlätta peptid införlivande i en mängd olika polymerer och polymera nätverk. Vid denna reaktion reagerar den primära aminen i N-terminalen av peptiden med karbonylgruppen atom på metakrylsyra-anhydrid för att bilda en amid. Detta genererar metakrylamid funktion peptid, med metakrylsyra produceras som en biprodukt. Vid användning av detta förfarande för att funktionalisera N-terminalen av peptidsekvenserna är det viktigt att aminosyror som innehåller reaktiva sidokedjor (primära aminer (lysin), alkoholer (serin, treonin) och fenoler (tyrosin)) skyddas under funktionalisering, och grupper är bara klyvs efter metakrylamid inkorporering.
Denna artikel kommer att visa båda dessa microave assisterade metoder för att syntetisera PEGDM och funktionalisera på-harts peptidsekvenser, belyser vanliga fallgropar och föreslå felsökningsmetoder. I denna artikel kommer metoder för att utföra analytisk kemiska tekniker som vanligtvis används för att bedöma produktfunktion vara detaljerad, och förslag och resurser för att utföra mer avancerade ändringar kommer att ges. Typiska resultat kommer att demonstreras, som omfattar användning av syntetiserade PEGDM bildar hydrogel nätverk, utnyttja de bildade hydrogelerna att styra frisättningen av en modell drog, och anställa funktion peptider för att underlätta cell-hydrogel interaktioner. Särskild uppmärksamhet kommer att ägnas åt att karakterisera hydrogel maskstorlek och diskutera hur hydrogelkomposition kan ställas in för att påverka det underliggande fysiska egendom, vilket i sin tur styr bulkmaterialegenskaper såsom styvhet och läkemedelsfrisättningsprofil.
De metoder som tidigare illustrerats är ovärderliga för syntesen av PEGDM och metakrylamid funktionalisering av peptider eller andra aminhaltiga föreningar. Dessa material kan sedan användas för regenerativ medicin och läkemedelsadministreringsapplikationer. På grund av den hydrofila naturen hos PEG-hydrogeler som bildats från PEG-makromerer har en hög vattenhalt som liknar många vävnader i kroppen 2. Denna kvalitet gör PEG mycket resistenta mot proteinadsorption och därför inert i kroppen 3. Emellertid kan den hygroskopiska naturen hos PEG bli besvärande under funktionalisering. Om vatten är närvarande i den PEG-provet under methacrylation förfarandet kommer metakrylsyraanhydrid reagerar preferentiellt med vatten för att producera metakrylsyra och dålig funktionalisering av PEG kommer att resultera.
Därför är en av de viktigaste åtgärder som kan vidtas för att säkerställa ett framgångsrikt methacrylation av PEG eller peptiden att bibehålla vattenfrirous reaktionsbetingelser. Den rekommenderade steget att torka allt glas innan användning är avsedd att förhindra vattenförorening. Närvaron av vatten i provet kan ses i NMR-analys, som en bred topp vid 1,7 ppm (fig 4). Om dålig methacrylation observeras även efter torkning allt glas, kan kemikalier torkas över natriumsulfat eller andra torkmedel (molekylsiktar etc.) före användning. Destillationen kan också användas för att avlägsna vatten och renar metakrylsyraanhydrid före användning, och azeotropisk destillation kan användas för att torka PEG 23. I extrema fall kan syntesen utföras i en handskbox för att ytterligare säkerställa ett adekvat vattenfria betingelser. En andra omgång av methacrylation, enligt samma förfarande, kan också utföras för att öka funktionalisering. Eftersom det alltid finns en risk att ytterligare rundor av funktionalisering kommer att krävas, bör man i steg 1,7 och 1,9 för att snabbt samla PEGDM genom vakuumfiltrering. Vakuumfiltrering under längre tid än som är absolut nödvändigt ökar exponeringen av PEG till luft, vilket ökar möjligheten för vatten adsorption.
Även om den procentuella överskottet av metakrylsyraanhydrid till funktionella hydroxylgrupper är oförändrad, vilket ökar PEG funktion (t.ex. arm #) på PEG gångaren är i allmänhet förknippas med en minskning i procent funktion uppnådda (opublicerade resultat, Benoit lab). För att preemptively upp denna minskning av funktion effektivitet, eller om särskilda svårigheter uppstår uppnå tillräckligt hög funktionalisering, varaktighet mikro reaktionen kan ökas, förutsatt att mikrovågsugnen intervallet bibehålls på 30 sek. Medan 10 molärt överskott är vanligen tillräcklig, kan mängden metakrylsyra-anhydrid som används i reaktionen även ökas för att öka den procentuella funktionalisering uppnås 12.
Det är viktigt att denytterligare fällningssteg (1.9) utföras för att uppnå goda NMR signaler. Även om det är frestande att utföra den andra utfällningen samma dag som syntes, torkning av provet över natten innan omfällning har befunnits underlätta avlägsnandet av överskott av metakrylsyraanhydrid och metakrylsyra. Provberedning är också viktigt för att uppnå ren NMR-spektra, och därför prover bör beredas med hjälp av rekommenderade förhållanden. Figur 4 visar representativa 1 H-NMR-resultat för korrekt funktion PEGDM. Genom att analysera förhållandet mellan terminal metakrylat protoner till central PEG protoner var PEGDM fast besluten att på lämpligt sätt funktionalis. MALDI provberedning är lika viktiga för att uppnå en tydlig läsning. MALDI är särskilt känslig för förekomsten av salter och hög koncentration i proverna. Om en tydlig MALDI läsning (en intensitet över 50 godtyckliga enheter (AU) med en hög signal: brus-förhållande) inte kan erhållas, prov solution bör spädas 1:100 i MALDI lösningsmedel innan de kombineras med matrislösningen och omanalyseras. Figur 5 visar representativa MALDI-TOF resultat efter rätt peptidfunktionalisering, klyvning, och provberedning. Klyvning av ett litet prov av hartset före funktionalisering (figur 5A) visar korrekt syntes av peptiden GKRGDSG, med korrekt metakrylamid funktionalisering av den peptid som visas i figur 5B.
Även funktionalisering av på-harts peptider är ett relativt stabilt förfarande, klyvnings villkor som krävs för varje sekvens kräver ofta tuning. För längre sekvenser där många aminosyror har skyddade sidokedjor (> 30 aminosyror långa, eller> 15 aminosyror med skyddsgrupper), bör ökas varaktigheten av klyvning med en timme. Men om klyvning tiden förlängs för mycket, kan peptidbindning klyvning leda till följd av långvarig surt exponering. MALDI ana lys kan vara till stor hjälp för att avslöja eventuella fel som uppstått i peptidsyntes eller klyvning. En observerade minskningen under förväntade molekylvikter kan tyda på att aminosyror (s) har inte riktigt par, eller att peptidfraktione inträffade (se tabell 2 för källor för vanligt förekommande förändringar i molekylvikt). Om den observerade molekylvikten är högre än väntat med vikten av en skyddsgrupp som används, är det troligt att klyvning och avskyddning var otillräcklig och peptiden bör recleaved för ytterligare tid.
Aminosyradeletion | MW förändring (g / mol) | Okluvna Protecting Groups | x; "> MW förändring (g / mol)Vanligt förekommande joner | MW förändring (g / mol) | |
Ala | -71 | Acetyl | 42 | Cl – | 35 |
Arg | -158 | Allyl | 40 | K + | 39 |
Asn | -114 | Alloc | 85 | Mg 2 + | <td style = "width: 64px;"> 24|
ASP | -115 | Boc | 100 | Na * | 23 |
Cys | -103 | Fmoc | 223 | ||
Gin | -128 | OtBu | 56 | ||
Glu | -129 | Pbf | 252 | ||
Gly | -57 | tBu | 56 | ||
Hans | -137 | Trt | 242 | ||
Lie | -113 | ||||
Leu | DTH: 64px; "> -113|||||
Lys | -128 | ||||
Met | -131 | ||||
Phe | -147 | ||||
-97 | |||||
Ser | -87 | ||||
Thr | -101 | ||||
Trp | -186 | ||||
-147 | |||||
Val | -99 |
Tabell 2. Vanligast observerade förändringar i peptidmolekylvikt.
Makromerer framställda med användning av mikrovågsassisterade methacrylation metoder kan användas i ett antal regenerativ medicin eller läkemedelsleveransapplikationer. De funktionaliserade peptider och PEGDM syntetiserade här kan också införlivas i polymerer med användning av nitroxid-medierad polymerisation (NMP), Atom Transfer Radical Polymerisation (ATRP) eller kallufts Addition-Fragmentering Transfer (RAFT) metoder 24. Hydrogel-nät kan även framställas i närvaro av celler, som tidigare visats i JoVE artikel av Khetan och Burdick 22. Detta kräver ofta införlivandet av cellvidhäftnings peptider såsom RGD-eller extracellulära matrixmolekyler, som PEG ensam inte ger cell-material interaktioner kritiska för överlevnad och funktion av vissa celltyper 25. Peptider, till exempel, kan syntetiseras med användning av traditionella fastfas-peptidsyntes och funktionaliserad såsom beskrivits här för att möjliggöra inkorporering i hydrogel-nätverk. Såsom framgår av fig 6, införande av det metakrylamid-functionalized celladhesion peptid GK RGDS G i hydrogeler (0,5 mM) underlättar adhesion av humana mesenkymala stamceller (MSC) till PEG-hydrogel-ytor, vilket ökar antalet kopplade och sprider celler (Figur 6B ), jämfört med PEG hydrogeler utan cellvidhäftningspeptid ( <strong> Figur 6A). Däremot har tidigare arbete visat att cellmaterialet interaktioner ytterligare genom införandet av 3.400 Da PEG distanser mellan självhäftande peptider och hydrogel nätverk, för att minska peptid-grinsteriskt hinder. Utan införande av det spacer kan celler interagerar med PEG-hydrogeler via ospecifika proteiner som adsorberar till peptiden, snarare än genom grinförmedlad interaktion med peptider 26. För att införliva denna PEG spacer och undvika icke-specifika interaktioner, kan peptider konjugeras till monofunctionalized PEG via N-hydroxisuccinimidyl-aktiverade estrar, såsom beskrivs av Hern och Hubbell 26.
Tillämpningar av hydrogel nätverk kräver god kontroll över materialegenskaper. En betydande fördel med att PEG-hydrogeler är en hög grad av kontroll över dessa egenskaper. Till exempel, molekylvikten, arm nummer och vikt-% av PEG som användes i bildning av hydrogel-nätverk kan ändras för att fins tune egenskaper för specifika tillämpningar. Detta medger god kontroll över hydrogelen maskstorlek (ξ), som styr hydrogel svällningsförhållandet (Q) och styvhet (elasticitetsmodulen, E). Detta illustreras i figur 7A och kvantifieras i Figur 8, där ökande PEG-makromeren molekylvikt resulterar i en ökning av hydrogel maskstorlek (figur 8A) och en minskning i hydrogel styvhet (figur 8B).
Den underliggande fysiska kännetecken som styr bulk beteende i dessa hydrogel nät, maskstorlek, beräknas med hjälp av Flory-Rehner ekvation 16. För att utföra denna beräkning, är det volymetriska svällningsförhållandet (Q) först beräknas enligt ekvation 4:
(4)
där ρ s är densiteten för vatten (1 g / ml), är ρ p densitet av PEG (1,12 g / ml), M är mellan svälld massa av hydrogelen och M D torr massa av hydrogel (ofta mäts efter frysning och lyofilisering av hydrogeler). Molekylvikten mellan tvärbindningar (Mc, i g / mol) beräknas sedan från ekvation 5:
(5)
där Mn är talmedelvärdet för molekylvikt av PEG (i g / mol), är den specifika volymen hos polymeren , V är en den molära volymen av vatten (18 ml / mol), är V 2 jämvikts polymerens volymfraktion av hydrogelen
( ) Och X 1 </sub> är polymer-lösningsmedelsinteraktionsparameter för PEG och vatten (0.426) 16. Antalet bindningar mellan tvärbindningar (n) beräknas sedan från ekvation 6:
(6)
där N ^ är antalet bindningar i PEG-repeat (3) och M r är MW av PEG-upprepningen (44 g / mol) 27. Detta medger att root-mean-square end-to-end-avstånd av polymerkedjan (I nm) ska beräknas enligt ekvation 7:
(7)
där L är den genomsnittliga bindningslängden (0,146 nm, beräknat baserat på CC-och CO-bindningslängder) och C n är det karakteristiska förhållandet mellan polymeren (4,0 för PEG) 28. Finellt, maskstorlek av hydrogelen kan beräknas från ekvation 8:
(8)
Hydrogel egenskaper kan på liknande sätt justeras genom att justera mängden av PEG som används vid bildning av hydrogeler. Minskning av viktprocenten av PEG-makromeren resulterar i en ökning av hydrogel med en maskstorlek, som därefter minskar hydrogel styvhet. Figur 7B illustrerar och Figur 9 kvantifierar hur viktprocenten av PEG som används i hydrogelen bildning kan användas för att styra maskstorlek (figur 9A) och resulte hydrogel styvhet (Figur 9B). Som substrat stelhet har visat sig påverka cell beteenden såsom stamcellsdifferentiering 29, är förmågan att tätt styra styvhet en viktig egenskap i hydrogel tillverkning.
Hydrogeler kan även användas för att kontrol drug delivery. Såsom visas i figur 7A och visas i figur 10, att öka molekylvikten av PEG-makromerer ökar maskstorlek av hydrogelen nätverk och därefter öka frisättningen av inkapslat modelläkemedel, bovint serumalbumin (BSA). Medan hydrogel prover i studien förstördes vid t = 195 timmar för att möjliggöra mätning av hydrogel våt-och torrmassor för maskstorlek beräkningar, är det vår erfarenhet att fortsatt BSA frigivning skulle ske hade proverna inkuberats under längre tidsperioder. Den ofullständiga frisättning av BSA observeras i figur 10 är inte oväntat, eftersom andra grupper har också rapporterat att BSA är resistent mot diffusion inom PEG hydrogel-nätverk 30. Ofullständig frisättning av inkapslat protein kan bero på vätebindning mellan proteiner och PEG-makromerer, eller kovalent bindning mellan den metakrylat-gruppen på PEG och primära aminogrupper på lysinrester i BSA 31 </supp>. Dessutom är BSA benägna att aggregering och disulfidbindningsbildning över tiden, vilket kan öka sin effektiva Stokes radie och hindra dess frisättning från hydrogel. Som kedje-tillväxt hydrogeler, såsom dessa PEGDM hydrogeler, är benägna att nätverks nonidealities och heterogena hydrogel maskstorlek (figur 2A), är det också möjligt att en del av det inkapslade BSA finns i regioner av hydrogel som har betydligt mindre mask storlek än det totala genomsnittet i gelén, förhindrar dess release. Även ofullständiga, nonFickian release (data visas ej) av inkapslat BSA observerades i detta fall, kontrollerad enligt Ficks lag frisättning av många andra modell droger, inklusive insulin och ovalbumin, har visat genom att använda liknande PEGDM hydrogel 30. Dessutom Watkins och Anseth har använt konfokal laserscanningsmikroskopi för att visa att frisättning av fluorescerande molekyler från liknande hydrogeler modelleras acceptabelt med enligt Ficks lag diffusion migthods 32.
Medan de hydrogel som bildas i denna studie är icke nedbrytbara, är nedbrytningen nätverk annan parameter som kan införlivas i och stämmas inom dessa nätverk. Att tillhandahålla kontrollerad hydrogel nedbrytning kan resultera i förändringar i cellbeteende 33, främjande av vävnadstillväxt eller värd vävnadsinväxt, eller eliminering av behovet för explantation 34. Nedbrytbara PEG-hydrogeler vanligen syntetiseras genom ringöppnande hydrolytiskt nedbrytbar d, l-laktid, glykolid, eller ε-kaprolakton-grupper på hydroxylgrupperna i PEG före methacrylation 35. Dessa tre grupper nedbrytas genom hydrolys av ester-funktioner, varvid glykolid estrar som har den största känsligheten för nedbrytning, följt av laktid och kaprolakton ester, på grund av deras varierande hydrofobicitet. Efter inkorporering av hydrolytiskt nedbrytbara grupper, kan PEG vidare funktionaliseras med hjälp av methacrylation förfarande detailed i den här artikeln, som möjliggör bildandet av hydrogel nätverk genom efterföljande radikalinitierad kedjepolymerisering 36,37. Hastigheten för nedbrytning av hydrogelpartiklar näten kan styras genom att variera identiteten av hydrolytiskt nedbrytbara grupp (glykolid, laktid, etc), och genom att variera antalet av nedbrytbara upprepningar som införts i den struktur 35,38.
Teoretiskt skulle metoderna påvisade här att användas för akryle av PEG och peptider genom att ersätta metakrylsyraanhydrid med akryl-anhydrid i steg 1,3 och 3,3, respektive. Dock är akrylsyraanhydrid mer än 20 gånger kostnaden för metakrylsyraanhydrid 39,40, vilket gör mikrovågsassisterad akryle betydligt mindre attraktiva än mikrovågsassisterad methacrylation.
Vi har visat en enkel, snabb metod för att functionalize PEG och peptider, hur man ska värdera effektiviteten av detta förfarande, och ges resurser för usjunger de syntetiserade material för att bilda hydrogel nätverk. Dessa syntetiska verktyg är mycket mångsidig i sina ansökningar, och borde vara en stapelvara i valfritt antal drug delivery-och materialforskningslaboratorier.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats delvis av Howard Hughes Med-in-Grad gemenskap (AVH), genom nystartade fonder som Dr Danielle Benoit från University of Rochester och Ortopedisk Forskning och utbildning Foundation / Musculoskeletal Transplant Foundation (fastighetsfonder / MTF). Författarna vill tacka Dr James L. McGrath för att använda sin utrustning.
3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol | Tokyo Chemical Industry Co, LTD | D2649 | CAS 14970-87-7 |
Acetonitrile | J.T. Baker | UN1648 | CAS 75-05-8 |
Amino Acids | AAPPTech | Glycine: AFG101 | CAS 29022-11-5 |
Arginine: AFR105 | CAS 154445-77-9 | ||
Asparagine: AFD105 | CAS 71989-14-5 | ||
Serine: AFS105 | CAS 71989-33-8 | ||
Anhydrous diethyl ether | Fisher Scientific | UN1155 | CAS 60-29-7 |
Citric acid | Sigma Aldrich | C1857 | CAS 77-92-9 |
Deuterated chloroform | Cambridge Isotope Laboratories Inc. | DLM-7-100 | CAS 865-49-6 |
Dichloromethane | Fisher Scientific | UN1593 | CAS 75-09-2 |
Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A1181 | CAS 7087-68-5 |
Dimethylformamide | Fisher Scientific | D119-4 | CAS 68-12-2 |
Fmoc-Gly-Wang resin | Peptides International | RGF-1301-PI | 100-200 mesh size |
Methacrylic anhydride | Alfa Aesar | L14357 | CAS 760-93-0 |
N-Methylpyrrolidone | VWR | BDH1141-4LG | CAS 872-80-4 |
On-resin peptides | Synthesized in-house | On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc. | |
O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate | AnaSpec Inc | 510/791-9560 | CAS 94790-37-1 |
Peptide Calibration Standard | Care | 206195 | |
Piperazine | Alfa Aesar | A15019 | CAS 11-85-0 |
Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear | Alfa Aesar | B22181 | CAS 25322-68-3 |
Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear | Alfa Aesar | B21955 | |
Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear | Sigma Aldrich | 81300 | JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG |
Thioanisole | Alfa Aesar | L5464 | CAS 100-68-5 |
Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | CAS 76-05-1 |
Triisopropylsilane | Alfa Aesar | L09585 | CAS 6485-79-6 |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Tokyo Chemical Industry Co, LTD | C1768 | CAS 28166-41-8 |