Dieses Video wird eine schnelle, effiziente Methode, um Poly (Ethylenglycol) Methacrylat veranschaulichen, so dass Kettenpolymerisationen und Hydrogel-Synthese. Es wird gezeigt, wie Methacrylamids Funktionalitäten ähnlich vorstellen in Peptide, Detail gemeinsamen analytischen Methoden zur Funktionalisierung Effizienz zu bewerten, bieten Anregungen zur Problembehebung und erweiterte Modifikationen und zeigen typische Hydrogel Charakterisierungstechniken.
Einer der Hauptvorteile der Verwendung von Poly (ethylenglycol) (PEG)-Makromeren in Hydrogelbildung synthetisch vielseitig. Die Möglichkeit, aus einer Vielzahl von PEG Molekulargewichte und Konfigurationen zu ziehen (Arm Zahl-, Arm-Länge und Verzweigungsmuster) bietet Forschern eine strenge Kontrolle über entstandene Hydrogel Strukturen und Eigenschaften, einschließlich der E-Modul und Maschenweite. Dieses Video wird eine schnelle, effiziente, lösungsmittelfrei, Mikrowellen-unterstützte Methode, um PEG-Vorläufern in Poly (Ethylenglycol) Dimethacrylats (PEGDM) Methacrylat illustrieren. Dieses synthetische Methode bietet dringend benötigte Ausgangsstoffe für Anwendungen in der Medikamentenabgabe und der regenerativen Medizin. Die nachgewiesene Methode ist den herkömmlichen Methoden Methacrylierung wie es ist deutlich schneller und einfacher sowie kostengünstiger und umweltfreundlich, mit kleineren Mengen von Reagenzien und Lösungsmittel. Wir werden auch eine Anpassung dieser Technik für on-Harz methacr demonstrierenylamid Funktionalisierung von Peptiden. Diese auf dem Harz erlaubt es, den N-Terminus von Peptiden mit Methacrylamid-Gruppen vor der Entfernung der Schutzgruppen und Abspaltung vom Harz funktionalisiert werden. Dies ermöglicht die selektive Zugabe von Methacrylamid-Gruppen an den N-Termini der Peptide während Aminosäuren mit reaktiven Seitengruppen (z. B. primäre Amin von Lysin-, primären Alkohol von Serin, Threonin sekundärer Alkohole und Phenol von Tyrosin) geschützt bleiben, verhindert Funktionalisierung an mehreren Stellen. Dieser Artikel wird ausführlich gemeinsamen analytischen Methoden (Protonenkernresonanz-Spektroskopie (; H-NMR) und Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation Time of Flight-Massenspektrometrie (MALDI-ToF)), um die Effizienz der Funktionalisierung zu beurteilen. Häufige Fehlerquellen und Methoden zur Problembehandlung vorgeschlagen werden angesprochen, ebenso wie Modifikationen der Technik, die zu weiteren Melodie Macromer Funktionalität genutzt werden kann und die daraus resultierenden Hydrogel physikalischen und chemischenEigenschaften. Verwendung von Syntheseprodukte für die Bildung von Hydrogelen für Drug-Delivery-und Zellstoffwechselwirkungsstudien nachgewiesen werden kann, mit besonderem Augenmerk auf die Änderung Hydrogel-Zusammensetzung zu Maschenweite beeinflussen, Controlling Hydrogel Steifigkeit und Wirkstofffreisetzung bezahlt.
Poly (Ethylenglycol) (PEG)-Hydrogele sind häufig Biomaterialien in der regenerativen Medizin und Drug-Delivery-Anwendungen 3.1 verwendet. Diese Hydrogele bieten erhebliche Vorteile gegenüber anderen Biomaterialien. PEG-Hydrogele sind synthetische und bietet ein hohes Maß an Kontrolle über technischen Eigenschaften wie E-Modul und Abbaurate im Vergleich zu ihren natürlichen Gegenstücke ein Biomaterial. Da sie synthetisch abgeleitet werden, hat PEG deutlich weniger von Charge zu Charge Variabilität gegenüber natürlich gewonnenen Materialien 4. Aufgrund der chemischen Zusammensetzung des PEG, sind diese stark hydrophile Hydrogele, resistent gegen Proteinadsorption und biokompatiblen 3. Dieser Widerstand gegen Proteinadsorption erlaubt PEG-Hydrogele als ein "unbeschriebenes Blatt" zu handeln, so dass die Forscher befragen und untersuchen spezifische biologische oder chemische Faktoren (Drogen, Biomoleküle, Zelladhäsion Peptide, etc.) und die spezifischen Rollen, die diese factors spielen bei der Kontrolle der Zell-und / oder Gewebeverhalten.
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Abbildung 1: Beispiele für Poly (ethylenglycol) (PEG)-Architekturen A) lineare PEG B) 4-arm PEG mit einem Kern Pentaerythrit C) 8-Arm-PEG mit einem Hexaglycerin Kern D) 8-Arm-PEG mit einem…. Tripentaerythritol Kern. n ist die Anzahl von PEG wiederholt an jedem Arm. Jede Wiederholung ein Molekulargewicht von 44 g / mol, also n von dem Gesamtmolekulargewicht und die Struktur / Arms berechnet werden.
PEG-Vorstufen sind mit einer Vielzahl von Architektur und Molekulargewichte (Abbildung 1 ). Verändern der Architektur (Arms) und Ethylenglykol Wiederholungen (n) von PEG verwendet werden, um Eigenschaften des Hydrogels Netzwerke aus diesen Makromeren gebildet steuern. Unmodifizierten PEG endständige Hydroxylgruppen, die mit einer alternativen Funktionalität ersetzt werden müssen, um eine kovalente Vernetzung durch Polymerisation, die am häufigsten eingesetzten Vernetzungsstrategie für PEG-Hydrogele vor der Bildung des Hydrogels Netzwerken zu erleichtern. Es gibt eine Vielzahl von chemischen Gruppen, die in PEG-Makromere eingebaut ist, um die Polymerisation und Vernetzung Netzwerk (Acrylat-, Methacrylat-, Vinylether-, Norbornen, etc.) erleichtern. Trotz der Vielfalt der terminalen Funktionalitäten zur Verfügung, um die Vernetzung zu erleichtern, gibt es nur zwei Mechanismen, durch die Polymerisation auftreten können: Schritt-und Kettenwachstum (oder ein Gemisch der beiden, Mixed-Mode).
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Abbildung 2:.. Theoretische Hydrogel-Netz schema A) Traditionelle Kettenwachstumspolymerisation Ergebnisse in heterogenen Netzwerken mit dichten Poly (methacrylat) Vernetzungs Regionen und erhöhte Netzwerkidealitäten wie Schleifen, nicht umgesetztes Vorläufer und Dauer Verstrickungen B) Schritt-für Wachstum Polymerisation Ergebnisse in deutlich homogenere Netzwerkstrukturen (nicht maßstabsgetreu).
Funktionalitäten, die über Kettenwachstums-Polymerisation vernetzen erfordern nicht die Anwesenheit eines zusätzlichen Vernetzers. Allerdings Ketten polymerisiert Hydrogele heterogenen Netzwerkstrukturen, die dichte Vernetzung Regionen (2A) ein. Im Gegensatz dazu Stufenwachstums Polymerisation Erforres die Verwendung eines Vernetzungsmittels oder Co-Monomer, das mit den endständigen funktionellen Gruppen der reaktiven PEG-Makromere ist. Da die endständigen funktionellen Gruppen an der PEG kann nur reagieren mit dem Vernetzungsmittel und das Vernetzungsmittel kann nur mit den terminalen funktionellen Gruppen des PEG reagieren, führt dies zu größeren Netzwerkstruktur Homogenität (2B) 1. Schritt-für Wachstum Polymerisationen in der Regel auch zu höheren Umwandlung von funktionellen Gruppen führen, die Verringerung der Menge an nicht umgesetzten Ausgangsstoffen und Potenzial für Immun / Entzündungsreaktionen durch lösliche, nicht eingetragene Macromere ein. Mixed-Mode-Polymerisation Methoden wurden entwickelt, die sowohl die Schritt-und Kettenwachstums Polymerisation durch die Verwendung von Makromeren, die sowohl selbst reagieren können (Kettenwachstum) und mit einem Vernetzer (Schritt-Wachstum) reagieren zu kombinieren. Dies erzeugt Hydrogele mit Charakteristiken jedes Polymerisationsmechanismus und können komplexere, verschiedene Netzstrukturen verwendet werden als entwederSchritt-oder alleine ein Kettenwachstums Netzwerken.
Zwar gibt es eine Vielzahl von funktionellen Gruppen, die verwendet werden können, um PEG zu funktionalisieren und Hydrogel-Bildung zu erleichtern, sind einige der häufigsten Ketten und Stufenwachstums-Polymerisation Reste jeweils Methacrylate und Norbornene. Beide Funktionalitäten bieten hervorragende raumzeitliche Kontrolle über Netzwerk-Polymerisation, und wenn verwendet, um Zellen zu verkapseln, diese Netzwerke zu unterstützen hohe Gesamtzelllebensfähigkeit 7.5. Dimethacrylat funktionalisierte PEG (PEGDM) Vernetzungs über Ketten Polymerisation und ermöglicht die Aufnahme von Biomolekülen oder anderen Faktoren durch Copolymerisation mit Acrylat-, Methacrylat-oder ähnlich funktionalisierten Biomolekülen 5,6. PEGDM Hydrogele weisen deutliche Vorteile gegenüber alternativen Kettenwachstumspolymerisation Systeme wie Acrylat-funktionalisiertes PEG (PEGDA). Mit traditionellen Methoden kann PEGDA schneller hergestellt werden als PEGDM; hoWever, mit Mikrowellen-unterstützte Synthese ist PEGDM Synthese noch effizienter. PEGDA ist oft über Nacht in 8 oder 24 h 9 Reaktionen synthetisiert, kann aber auch in vier Stunden bei erhöhten Temperaturen 10 synthetisiert werden. PEGDM traditionell auch durch Reaktion über Nacht für 11 oder 24 h 5 synthetisiert, mit der einige Methoden zur Verlängerung der Reaktionszeit auf 4 Tagen 12. Mit dem Mikrowellen-unterstützte Methode, die hier gezeigt hat, kann PEGDM in einem 5-min-Reaktion hergestellt werden. Während PEGDM langsamer Reaktionskinetik als PEGDA 13 ist die Vernetzungsreaktion noch zur schnellen PEGDM in Minuten auftritt, und erreicht eine höhere Umwandlung als Makromer PEGDA als die erhöhte Hydrophobie der Methacrylatgruppe erhöht funktionelle Gruppe Aggregation in Lösung, wodurch die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen Radikalüber-und Methacrylat-Umwandlung 14. PEGDM Hydrogele sind ebenfalls mit einem erhöhten Zelllebensfähigkeit und Wachstum verbundenPEGDA-Hydrogele im Vergleich zu, wahrscheinlich wegen der Abnahme der Reaktionsgeschwindigkeit zu einem bestimmten Zeitpunkt, die Radikalkonzentration und 14 nicht umgesetzte vorliegenden Makromeren reduziert. Thiol-En-Polymerisation, wie sie mit Norbornen-funktionalisierte PEG (PEGN) bilden Hydrogele durch Stufenwachstum-Polymerisation und die Verwendung von PEGN und ein Vernetzungsmittel, das durchschnittlich mehr als zwei funktionelle Gruppen enthalten. Da Thiylradikalen reagieren mit Norbornen Kohlenstoff-Doppelbindungen, multi-thiol enthaltenden Vernetzer werden üblicherweise verwendet, um PEGN Hydrogele zu vernetzen, was eine leichte Einarbeitung von Peptiden mit Cystein Aminosäuren Funktionalitäten 7. Zwar gibt es zahlreiche andere Chemikalien, die über Stufenwachstum-Polymerisation reagieren (Michael-Additionsreaktionen wie Thiol-Acrylat 15 und Thiol-Vinylsulfon 16 "auf" Reaktionen wie Alkin-Azid-17 etc.), Thiol-Norbornen-Hydrogele sehr häufig, wie der Stamm ausdie Norbornenring die Reaktionsgeschwindigkeit deutlich erhöht und verringert die Chance der Norbornen-Doppelbindung unterzieht Kette 7 Polymerisation.
Die Entscheidung zwischen Methacrylat, Norbornen, oder alternative Funktionalisierung Hydrogelbildung erleichtern, ist weitgehend von der Ansatz. Zum Beispiel sind Kettenwachstums polymerisierten PEGDM Netzwerke nachgewiesen als gut geeignet, um die Zelllokalisierung in der Entwicklung eines Tissue-Engineering Periost 18,19 steuern. Stufenwachstums polymerisiert PEG-Netzwerke sind für den Einbau von Peptidsequenzen enzymatisch ansprechenden Hydrogel Abbau erleichtern besser geeignet, wegen der Leichtigkeit der Einarbeitung des Enzym-Substrat-Sequenzen unter Verwendung von Thiol (Cystein) und Norbornen enthaltenden Peptiden funktionalisierten Makromere 20. Wenn die Forschungsfrage wird am besten durch den Einsatz von Stufenwachstums Hydrogele angesprochen werden, Fairbanks et al. Liefert eine detaillierte Beschreibung des Norbornennene Funktionalisierung Strategie für PEG-7. Dieses Papier wird ausführlich, wie PEG-und Peptid-Sequenzen funktionalisiert werden können (mit einem Methacrylat für PEG und eine Methacrylamids für Peptide) für Ketten Polymerisationsreaktionen.
Traditionell wird PEGDM durch Umsetzung mit PEG Methacryloylchlorid und Triethylamin in Dichlormethan hergestellt. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur über Nacht für 11 oder 24 h fortschreiten 5, bei einigen Verfahren die Reaktionsdauer verlängert bis 4 Tage 12 vor der Filtration, Fällung in Diethylether und Sammlung. Während viele Variationen dieses Ansatzes bestehen, sind alle zeitaufwendig, erfordern eine große Auswahl an chemischen Synthesetechnik und sind nicht umweltfreundlich, da sie die Verwendung von relativ großen Mengen von hochreinen Reagenzien und Lösungsmittel umfassen. Um diese Einschränkungen zu umgehen, Lin-Gibson et al. Entwickelte eine Mikrowellen-unterstützte, lösemittelfreie Methode, um mit PEG te funktionalisieren rminal Methacrylatgruppen (3A) 12. Bei dieser Reaktion, die endständige Alkoholgruppen des PEG mit einer der Carbonylgruppen Atome des Methacrylsäureanhydrid umgesetzt, um eine Carboxylgruppe zu bilden. Dies erzeugt das Produkt PEGDM mit Methacrylsäure als Nebenprodukt. Diese Synthese hat viele der charakteristischen Vorteile der Mikrowellensynthese, einschließlich der Verringerung der Reaktionszeit und lösungsmittelfreie Synthese-Verfahren 21. Die Mikrowellensynthese ist bevorzugt, die zuvor diskutierten Verfahren, wie es ist wesentlich schneller, benötigt weniger umfangreichen Synthesegeräte (z. B. Glaswaren, Reaktionsplatten) und verwendet insgesamt weniger Reagenz und als Lösungsmittel Lösungsmittelmengen werden nur für die Produktreinigung / Sammlung und nicht erforderlich für Synthese, so dass es wirtschaftlich und umweltfreundlich.
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Figur 3:.. Funktionalisierung Schemata A) Poly (ethylenglycol) ist mit 10fach molaren Überschuß Methacrylsäureanhydrid, um Poly (ethylenglycol) methacrylat B) Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, um den N-Terminus der Peptid-Sequenzen funktionalisiert werden umgesetzt, wodurch ein Methacrylamid funktionalisierten Peptids. Durch Ausführen dieser Prozedur vor der Abspaltung des Peptids von dem Harz kann eine selektive Funktionalisierung der N-Terminus als Aminosäure-Seitengruppen geschützt bleiben durchgeführt werden. n: Anzahl der PEG wiederholt in Makromer (n = 45,5, 227 und 455, jeweils für die 2, 10 und 20 kDa linearen PEG verwendet werden). R1 bis RN: Aminosäure-Seitenketten. PG1 PGN: Seitenkettenschutzgruppen. TFA: Trifluoressigsäure. Tipps: Triisopropylsilan. Dodt: 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol. H 2 O: Wasser.
Die Mikrowellen-unterstützte Methacrylierung Methode wurde kürzlich von unserer Gruppe geeignet ist, die N-Terminus von Peptiden mit Methacrylamid-Gruppen (3B) zu funktionalisieren, um Peptid Einbau in eine Vielzahl von Polymeren und Polymernetzwerke zu ermöglichen. Bei dieser Reaktion wird das primäre Amin des N-Terminus des Peptids reagiert mit dem Carbonyl-Atom am Methacrylsäureanhydrid, um ein Amid zu bilden. Dies erzeugt das Methacrylamid funktionalisierten Peptid, mit Methacrylsäure als Nebenprodukt erzeugt. Bei Verwendung dieses Verfahrens, um die N-Terminus-Peptid-Sequenzen zu funktionalisieren, ist es wichtig, dass die Aminosäuren mit reaktiven Seitenketten (primären Aminen (Lysin), Alkohole (Serin, Threonin) und Phenole (Tyrosin)) während der Funktionalisierung geschützt sind, und Schutzgruppen werden nur nach Methacrylamid Einbau abgespalten.
In diesem Artikel werden diese beiden microw zeigenave-unterstützte Methoden zur Synthese und Funktionalisierung PEGDM am Harz Peptidsequenzen, Hervorhebung häufigsten Fallstricke und schlägt Methoden zur Problembehandlung. In diesem Artikel werden Methoden zur analytischen chemische Techniken, die üblicherweise zur Funktionalisierung Produkt bewerten führen detailliert, und Anregungen und Ressourcen zur Durchführung von fortgeschrittenen Änderungen gegeben. Typische Ergebnisse demonstriert werden, die unter Verwendung der synthetisierten PEGDM Hydrogel Netzwerke zu bilden, die Nutzung der gebildeten Hydrogele zur Freisetzung von einem Modell der Drogenkontrolle und den Einsatz funktionalisierter Peptide an Zell-Hydrogel-Interaktionen erleichtern. Besonderes Augenmerk wird auf die Charakterisierung Hydrogel Maschenweite und diskutieren, wie Hydrogel-Zusammensetzung kann abgestimmt werden, um dieses zugrunde liegende physikalische Eigenschaft, die wiederum steuert Schüttguteigenschaften wie Steifigkeit und Arzneimittelfreisetzungsprofil zu beeinflussen bezahlt werden.
Die zuvor veranschaulichten Verfahren sind von unschätzbarem Wert für die Synthese von PEGDM und Methacrylamid Funktionalisierung von Peptiden oder anderen aminhaltigen Verbindungen. Diese Materialien können dann für die regenerative Medizin und Drug-Delivery-Anwendungen verwendet werden. Aufgrund der hydrophilen Natur von PEG, PEG-Hydrogele, die aus Makromeren gebildet haben einen hohen Wassergehalt ähnlich vielen Geweben in dem Körper 2. Diese Qualität macht PEG sehr resistent gegen Proteinadsorption und somit inert in dem Körper 3. Jedoch ist die Hygroskopizität von PEG während Funktionalisierung lästig erweisen. Wenn Wasser in der Probe vorhanden ist PEG während der Methacrylierung Verfahren wird die Methacrylanhydrid bevorzugt mit Wasser reagieren zu Methacrylsäure zu produzieren, und der arme Funktionalisierung von PEG führen wird.
Daher ist einer der wichtigsten Schritte, die ergriffen werden, um erfolgreiche Methacrylierung der PEG-oder Peptid sein, um sicherzustellen, wasserfrei zu haltenrous Reaktionsbedingungen. Die empfohlene Schritt des Trocknens alle Glaswaren vor Gebrauch soll Wasserverschmutzung zu verhindern. Die Anwesenheit von Wasser in der Probe in dem NMR-Analyse ersichtlich ist, als breiter Peak bei 1,7 ppm (Abbildung 4). Wenn schlechte Methacrylierung wird auch nach dem Trocknen alle Gläser beobachtet werden, können Chemikalien über Natriumsulfat oder andere Trockenmittel (Molekularsiebe etc.) vor der Verwendung getrocknet werden. Destillation kann ebenfalls verwendet werden, um Wasser zu entfernen und zu reinigen, Methacrylsäureanhydrid vor der Verwendung, und die azeotrope Destillation zu trocknen PEG 23 verwendet werden. In extremen Fällen kann die Synthese in einer Handschuhbox durchgeführt werden, um ausreichend wasserfreien Bedingungen weiter sicherzustellen. Eine zweite Runde von Methacrylierung, nach dem gleichen Verfahren, kann auch durchgeführt werden, um Funktionalisierung zu erhöhen. Da gibt es immer eine Chance, dass zusätzliche Runden der Funktionalisierung erforderlich sein wird, sollte darauf in Schritt 1.7 und 1.9 getroffen, um schnell PEGDM sammeln durch Vakuumfiltration werden. Vakuumfiltration länger als unbedingt notwendig steigt Exposition von PEG in die Luft, die Erhöhung der Chance für die Wasseraufnahme.
Auch wenn die Über Prozent Methacrylsäureanhydrid zu Hydroxyl-funktionellen Gruppen bleibt unverändert, die Erhöhung der PEG-Funktionalisierung (zB arm #) auf der PEG-Vorstufe ist in der Regel mit einer Abnahme der Funktionalisierung Prozent erreicht (unveröffentlichte Ergebnisse, Benoit Labor) verbunden. Präventiv adressieren diese Verringerung Funktionalisierung Effizienz, oder wenn besondere Schwierigkeiten angetroffen Erzielung ausreichend hoher Funktionalisierung, die Dauer der Mikrowellenreaktion kann erhöht werden, wenn die Mikrowellen-Intervall auf 30 Sekunden lang aufrechterhalten. Während 10 molarer Überschuß ist in der Regel ausreichend ist, kann die Menge an Methacrylsäureanhydrid in der Reaktion verwendet ebenfalls erhöht, um den Prozentsatz der Funktionalisierung erreicht 12 zu erhöhen.
Es ist wichtig, dass diezusätzliche Fällungsschritt (1.9) durchgeführt werden, um gute NMR-Signale zu erzielen. Obwohl es verlockend ist, um die zweite Fällung am selben Tag wie die Synthese durchzuführen, Trocknen der Probe über Nacht vor Umfällen wurde gefunden, daß die Entfernung von überschüssigem Methacrylsäureanhydrid und Methacrylsäure unterstützen. Probenvorbereitung ist auch wichtig für das Erreichen saubere NMR-Spektren und damit Proben sollten mit den empfohlenen Bedingungen hergestellt. Fig. 4 zeigt repräsentativ 1 H-NMR-Ergebnisse für vollständig funktionalisierten PEGDM. Durch die Analyse des Verhältnisses von Anschluß Methacrylat Protonen zentrale PEG Protonen, die PEGDM bestimmt angemessen funktionalisiert werden. MALDI-Probenvorbereitung ist für das Erreichen einer klaren Lese ähnlich wichtig. MALDI ist besonders empfindlich gegenüber der Anwesenheit von Salzen und hohen Probenkonzentrationen. Wenn eine klare MALDI Lesen (eine Intensität über 50 beliebigen Einheiten (au) mit einem hohen Signal: Rausch-Verhältnis) nicht erhalten werden können, die Probe slösung sollte 1:100 in MALDI Lösungsmittel verdünnt werden, bevor sie mit der Matrix-Lösung versetzt und erneut analysiert. Abbildung 5 zeigt, Vertreter MALDI-ToF Ergebnisse nach korrekter Peptid Funktionalisierung, Spaltung und Probenvorbereitung. Abspaltung einer kleinen Probe des Harzes vor der Funktionalisierung (5A) zeigt korrekte Synthese des Peptids GKRGDSG mit korrekten Methacrylamid Funktionalisierung des in 5B gezeigt Peptid.
Während Funktionalisierung von Peptiden auf dem Harz ist eine relativ robuste Verfahren, die für jede Sequenz erforderlich Spaltungsbedingungen erfordert häufig Tuning. Für lange Sequenzen, in denen viele Aminosäuren-Seitenketten (> 30 Aminosäuren lang ist, oder> 15 Aminosäuren mit Schutzgruppen) zu schützen, sollte die Dauer der Spaltung eine Stunde erhöht werden. Allerdings, wenn die Spaltung der Zeit zu sehr verlängert, Peptid-Bindungsspaltung kann auf langfristige sauren Belastung führen. MALDI ana Lyse in enthüllt Fehler in der Peptid-Synthese oder Spaltung traten sehr hilfreich sein. Eine beobachtete Abnahme unter dem erwarteten Molekulargewichte zeigen, dass Aminosäure (n) nicht richtig Paar oder das Peptid Fraktionierung stattgefunden (siehe Tabelle 2 für die Quellen der häufigsten beobachteten Veränderungen im Molekulargewicht). Wenn der beobachtete Molekulargewicht höher ist als die durch das Gewicht eines Schutzgruppe erwartet, ist es wahrscheinlich, dass die Spaltung und Entschützung unzureichend war und das Peptid sollte zusätzliche Zeit nachgeschnitten werden.
Aminosäure-Deletion | MW Änderung (g / mol) | Ungespaltenen Schutzgruppen | x; "> MW Änderung (g / mol)Häufig vorhandenen Ionen | MW Änderung (g / mol) | |
Ala | -71 | Acetyl | +42 | Cl – | +35 |
Arg | -158 | Allyl | +40 | K + | +39 |
Asn | -114 | Alloc | +85 | Mg 2 + | <td style = "width: 64px;"> 24|
Natter | -115 | Boc | 100 | Na + | +23 |
Cys | -103 | Fmoc | 223 | ||
Gln | -128 | OtBu | +56 | ||
Glu | -129 | Pbf | 252 | ||
Gly | -57 | tBu | +56 | ||
Seine | -137 | Trt | 242 | ||
Ile | -113 | ||||
Leu | dth: 64px; "> -113|||||
Lys | -128 | ||||
Met | -131 | ||||
Phe | -147 | ||||
-97 | |||||
Ser | -87 | ||||
Thr | -101 | ||||
Trp | -186 | ||||
-147 | |||||
Val | -99 |
Tabelle 2. Häufig beobachtete Veränderungen in der Peptidmolekulargewicht.
Makromere mit Mikrowellen-unterstützte Methoden hergestellt Methacrylierung kann in einer Anzahl der regenerativen Medizin oder Arzneimittelabgabeanwendungen verwendet werden. Die funktionalisierten Peptide synthetisiert und PEGDM hier können auch in Polymere unter Verwendung von Nitroxid-vermittelte Polymerisation (NMP), Atomtransfer-Radikalpolymerisation (ATRP) oder der Reversible Addi aufgenommen werdention-Fragmentierung Transfer (RAFT)-Methoden 24. Hydrogel-Netzwerke können auch in Gegenwart von Zellen hergestellt werden, wie zuvor in dem Artikel von JoVE Khetan Burdick und 22 gezeigt. Dies erfordert häufig die Einarbeitung von Zelladhäsion Peptide wie RGD oder extrazelluläre Matrixmoleküle, wie PEG allein bietet keine Zell-Material-Wechselwirkungen entscheidend für das Überleben und die Funktion einiger Zelltypen 25. Peptide können beispielsweise unter Verwendung von herkömmlichen Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert und funktionalisiert wie hier beschrieben, für den Einbau in Hydrogel-Netzwerke zu ermöglichen. Wie in Fig. 6, die Aufnahme des Methacrylamid-funktionalisierten Zelladhäsion Peptid RGDS GK G in Hydrogelen (0,5 mM) erleichtert Adhäsion von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in PEG Hydrogel-Oberflächen, die Erhöhung der Zahl der gebundenen Zellen und Ausbreitung (6B gesehen ), im Vergleich zu PEG-Hydrogele ohne Zelladhäsion Peptid ( <strong> 6A). Allerdings hat früheren Arbeiten gezeigt, dass Zell-Material-Interaktionen werden durch die Aufnahme von 3.400 Da PEG Abstandshalter zwischen Klebstoff Peptide und Hydrogel-Netzwerke erweitert, um Peptid-Integrin sterische Behinderung zu reduzieren. Ohne Einbeziehung des Abstands können Zellen mit PEG-Hydrogele durch unspezifische Proteine, die an das Peptid zu adsorbieren, zu kommunizieren, und nicht durch die Integrin-vermittelte Wechselwirkungen mit Peptiden 26. Um diese PEG-Spacer nehmen und unspezifische Wechselwirkungen zu vermeiden, können Peptide konjugiert werden, um über PEG N-Hydroxysuccinimidyl-aktivierte Ester monofunktionalisierte, wie von Hern und Hubbell 26 beschrieben.
Anwendungen von Hydrogel-Netzwerke erfordern eine strenge Kontrolle über Materialeigenschaften. Ein wesentlicher Vorteil gegenüber PEG-Hydrogele ist ein hohes Maß an Kontrolle über diese Eigenschaften. Beispielsweise das Molekulargewicht, Anzahl der Arm und die Gew.% PEG in der Bildung von Hydrogel-Netzwerken verwendet werden, können verändert werden, um Fein tun werden,E Eigenschaften für spezifische Anwendungen. Dies ermöglicht eine strenge Kontrolle über Hydrogel mesh (ξ), die Hydrogel-Quellverhältnis (Q) und Steifigkeit (Elastizitätsmodul E) steuert. Dies ist in Fig. 7A dargestellt, und in Fig. 8, wo immer quantifiziert PEG Makromer Molekulargewicht ergibt eine Erhöhung in Hydrogel mesh (8A) und eine Abnahme der Steifigkeit Hydrogel (8B).
Das zugrunde liegende physikalische Eigenschaft, die Groß Verhalten in diesen Hydrogel Netzwerke steuert, Maschengröße, wird mit der Flory-Rehner Gleichung 16 berechnet. Um diese Berechnung durchzuführen, wird das Volumenquellverhältnis (Q) zunächst aus der Gleichung 4 berechnet:
(4)
wobei ρ s die Dichte von Wasser (1 g / ml), ist p ρ Dichte von PEG (1,12 g / ml), M s gequollene Masse des Hydrogels und M D Trockenmasse des Hydrogels (häufig nach dem Einfrieren und Gefriertrocknung von Hydrogelen gemessen). Das Molekulargewicht zwischen den Vernetzungen (M c, in g / mol) wird dann aus Gleichung 5 berechnet:
(5)
wobei M n das zahlenmittlere Molekulargewicht von PEG (in g / mol), das spezifische Volumen des Polymers Ist, V 1 das molare Volumen von Wasser (18 ml / mol) ist, V 2 die Gleichgewichtspolymervolumenanteil des Hydrogels
( ) Und X 1 </sub> ist die Polymer-Lösungsmittel-Wechselwirkungsparameter für PEG und Wasser (0,426) 16. Die Anzahl der Bindungen zwischen den Vernetzungen (n) wird dann aus der Gleichung 6 berechnet:
(6)
wobei N b die Anzahl der Bindungen in der PEG-Wiederholung (3) und M r der MW des PEG-repeat (44 g / mol) 27. Dies ermöglicht es dem Root-Mean-Square Ende-zu-Ende-Abstand der Polymerkette (In nm) von Gleichung 7 berechnet werden:
(7)
wobei l die durchschnittliche Bindungslänge (0.146 nm bezogen auf CC-und CO-Bindungslängen berechnet) und C n die charakteristische Verhältnis des Polymers (4,0 PEG) 28. FiNally, Maschenweite des Hydrogels aus Gleichung 8 berechnet werden:
(8)
Hydrogel-Eigenschaften können in ähnlicher Weise durch Einstellen der Menge des PEG bei der Bildung von Hydrogelen verwendet, abgestimmt werden. Verringern der Gewichtsprozentanteil von PEG Makromers zu einer Zunahme in Hydrogel Maschengröße, die anschließend reduziert Hydrogel Steifigkeit. Fig. 7B veranschaulicht und Fig. 9 quantifiziert, wie der Gewichtsanteil von PEG in Hydrogelbildung verwendet werden, können verwendet werden, um Maschengröße zu steuern (Fig. 9A) und resultierende Hydrogel Steifigkeit (Fig. 9B). Als Substrat Steifigkeit hat sich gezeigt, Zellverhalten wie Stammzelldifferenzierung 29 beeinflussen, ist die Fähigkeit, genau steuern Steifigkeit eine wichtige Eigenschaft in Hydrogel Herstellung.
Hydrogele können auch contr verwendet werdenol Drug Delivery. Wie in 7A dargestellt, und in Fig. 10 gezeigt, wodurch das Molekulargewicht des PEG-Makromere erhöht Maschennetz des Hydrogels, anschließend Erhöhung der Freisetzung von eingekapselten Modellarzneistoff, Rinderserumalbumin (BSA). Während Hydrogel-Proben in dieser Studie wurden bei t = 195 Stunden zerstört, um für die Messung der Hydrogel-Nass-und Trockenmassen für Maschen Berechnungen zu ermöglichen, ist es unsere Erfahrung, die weiter BSA Release auftreten würde, hatte die Proben für längere Zeiträume inkubiert worden. Die unvollständige Freisetzung von BSA in Abbildung 10 beobachtet wird, ist nicht unerwartet, als andere Gruppen haben auch berichtet, dass BSA ist beständig gegen Diffusion innerhalb PEG-Hydrogel-Netzwerke 30. Unvollständige Freisetzung von verkapselten Protein kann durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Proteinen und PEG Makromere oder kovalente Bindung zwischen der Methacrylat-Gruppe auf der PEG-und Primäramingruppen auf Lysinreste in BSA 31 auftreten </sbis>. Zusätzlich ist BSA zur Aggregation neigen und Disulfidbindungsbildung über die Zeit, was die effektive Stokes-Radius zu erhöhen und seine Freisetzung aus Hydrogelen behindern können. Als Kettenwachstums Hydrogele, wie diese PEGDM Hydrogele, sind anfällig für Unvollkommenheiten und heterogene Netzwerk Hydrogel Maschenweite (2A), ist es auch möglich, dass eine Fraktion der eingekapselten BSA in Regionen des Hydrogels, die wesentlich kleiner Maschen enthalten Größe als der Gesamtdurchschnitt innerhalb des Gels, die Verhütung der Veröffentlichung. Während unvollständig, nonFickian Mitteilung (Daten nicht gezeigt) von verkapselten BSA wurde in diesem Fall beobachtet, kontrollierte Freisetzung von Fickschen zahlreiche andere Modell Medikamente, darunter Insulin und Ovalbumin, wurde mit ähnlichen PEGDM Hydrogele 30 demonstriert. Zusätzlich Watkins und Anseth haben konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet, um diesen Freisetzung von fluoreszierenden Molekülen aus ähnlichen Hydrogele zeigen, ist annehmbar mit Fickschen Diffusion modelliert michthoden 32.
Während die in dieser Studie gebildeten Hydrogele sind nicht abbaubaren, Netzwerk-Abbau anderer Parameter, die in eingebaut und innerhalb dieser Netzwerke eingestellt werden können. Mit kontrollierter Abbau Hydrogel kann in Veränderungen im Zellverhalten 33, der Förderung des Gewebewachstums oder Host das Einwachsen von Gewebe oder Beseitigung der Notwendigkeit für die Explantation 34 führen. Abbaubaren PEG-Hydrogele werden üblicherweise durch Ringöffnung hydrolytisch abbaubaren D, L-Lactid, Glykolid, ε-Caprolacton oder Gruppen in Hydroxyl-Gruppen innerhalb PEG vor Methacrylierung 35 synthetisiert. Diese drei Gruppen verschlechtern durch Hydrolyse von Ester-Funktionen, wobei die Ester Glykolid mit der grßten Empfindlichkeit gegenüber Zersetzung, gefolgt von Lactid, Caprolacton und Ester, die aufgrund ihrer unterschiedlichen Hydrophobie. Nach dem Einbau von hydrolytisch abbaubaren Gruppen können weiter mit der PEG Methacrylierung detaile Verfahren funktionalisiert werdend in diesem Artikel, was die Bildung von Hydrogel-Netzwerke durch nachfolgende radikalisch initiierte Polymerisation Kette 36,37. Die Abbaugeschwindigkeit von Hydrogel-Netzwerke können durch Variieren der Identität des hydrolytisch abbaubaren Gruppe (Glycolid, Lactid, usw.) und durch Variieren der Anzahl von Wiederholungen abbaubar in der Struktur eingebaut 35,38 gesteuert werden.
Theoretisch könnte das Verfahren hier gezeigt für Acrylierung von PEG und Peptide durch Ersetzen des Methacrylsäureanhydrid mit Acrylsäureanhydrid in den Schritten 1.3 und 3.3, die jeweils verwendet werden. Jedoch ist acrylsäureanhydrid mehr als 20-fache der Kosten Methacrylsäureanhydrid 39,40, wodurch Mikrowellen-unterstützte Acrylierung deutlich weniger attraktiv als Mikrowellen-unterstützte Methacrylierung.
Wir haben ein einfaches, schnelles Verfahren zur Funktionalisierung von PEG und Peptide, wie die Effizienz des Verfahrens zu bewerten gezeigt, gegeben und Ressourcen für usingen die synthetisierten Materialien zu Hydrogel-Netzwerke zu bilden. Diese synthetischen Tools sind in ihrer Anwendung sehr vielseitig, und sollte ein Grundnahrungsmittel in einer beliebigen Anzahl von Drug-Delivery-und Materialforschungslabors beweisen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Howard Hughes Med-in-Grad-Stipendium (AVH) gefördert, von Start-up-Fonds Dr. Danielle Benoit von der University of Rochester und die Unfallchirurgische Forschung und Bildung Stiftung / Muskel-Skelett-Transplant Foundation (OREF vorgesehen / MTF). Die Autoren danken Herrn Dr. James L. McGrath für die Verwendung seiner Geräte zu danken.
3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol | Tokyo Chemical Industry Co, LTD | D2649 | CAS 14970-87-7 |
Acetonitrile | J.T. Baker | UN1648 | CAS 75-05-8 |
Amino Acids | AAPPTech | Glycine: AFG101 | CAS 29022-11-5 |
Arginine: AFR105 | CAS 154445-77-9 | ||
Asparagine: AFD105 | CAS 71989-14-5 | ||
Serine: AFS105 | CAS 71989-33-8 | ||
Anhydrous diethyl ether | Fisher Scientific | UN1155 | CAS 60-29-7 |
Citric acid | Sigma Aldrich | C1857 | CAS 77-92-9 |
Deuterated chloroform | Cambridge Isotope Laboratories Inc. | DLM-7-100 | CAS 865-49-6 |
Dichloromethane | Fisher Scientific | UN1593 | CAS 75-09-2 |
Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A1181 | CAS 7087-68-5 |
Dimethylformamide | Fisher Scientific | D119-4 | CAS 68-12-2 |
Fmoc-Gly-Wang resin | Peptides International | RGF-1301-PI | 100-200 mesh size |
Methacrylic anhydride | Alfa Aesar | L14357 | CAS 760-93-0 |
N-Methylpyrrolidone | VWR | BDH1141-4LG | CAS 872-80-4 |
On-resin peptides | Synthesized in-house | On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc. | |
O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate | AnaSpec Inc | 510/791-9560 | CAS 94790-37-1 |
Peptide Calibration Standard | Care | 206195 | |
Piperazine | Alfa Aesar | A15019 | CAS 11-85-0 |
Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear | Alfa Aesar | B22181 | CAS 25322-68-3 |
Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear | Alfa Aesar | B21955 | |
Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear | Sigma Aldrich | 81300 | JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG |
Thioanisole | Alfa Aesar | L5464 | CAS 100-68-5 |
Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | CAS 76-05-1 |
Triisopropylsilane | Alfa Aesar | L09585 | CAS 6485-79-6 |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Tokyo Chemical Industry Co, LTD | C1768 | CAS 28166-41-8 |