Deze video is een snelle, efficiënte methode om poly (ethyleenglycol) methacrylaat illustreren, waardoor keten polymerisaties en hydrogel synthese. Het zal laten zien hoe je methacrylamide functionaliteiten dezelfde wijze te introduceren in peptiden, detail gemeenschappelijke analytische methoden om functionalisering efficiëntie te beoordelen, suggesties voor het oplossen van problemen en geavanceerde aanpassingen, en tonen typische hydrogel karakterisering technieken.
Een van de belangrijkste voordelen voor het gebruik van poly (ethyleenglycol) (PEG) macromeren in hydrogelvorming synthetisch veelzijdigheid. De mogelijkheid om putten uit een grote verscheidenheid aan PEG molecuulgewichten en configuraties (arm getal, armlengte en vertakking) levert onderzoekers strakke controle resulterende hydrogel structuren en eigenschappen, zoals elasticiteitsmodulus en maaswijdte. Deze video zal een snelle, efficiënte, oplosmiddelvrije, microgolven methode om PEG voorlopers methacrylaat in poly (ethyleenglycol) dimethacrylaat (PEGDM) illustreren. Deze synthetische methode biedt de broodnodige grondstoffen voor toepassingen in drug delivery en regeneratieve geneeskunde. De aangetoonde methode is superieur aan traditionele methacrylation methoden is aanzienlijk sneller en eenvoudiger, evenals economischer en milieuvriendelijker, met kleinere hoeveelheden reagentia en oplosmiddelen. We zullen ook een aanpassing van deze techniek tonen voor on-hars methacrylamide functionalisering van peptiden. Deze on-hars methode kan de N-terminus van peptiden worden gefunctionaliseerd met methacrylamide groepen voor ontscherming en afsplitsing van hars. Dit maakt selectieve toevoeging methacrylamide groepen de N-termini van de peptiden terwijl aminozuren met reactieve zijgroepen (bijv. primair amine van lysine, primaire alcohol van serine, threonine of secundaire alcoholen en fenol tyrosine) beschermd blijven, waardoor functionalisering op meerdere plaatsen. Dit artikel zal detail gemeenschappelijke analysemethoden (proton Nucleaire Magnetische Resonantie spectroscopie (, H-NMR) en Matrix laserdesorptie ionisatie Time of Flight massaspectrometrie (MALDI-TOF)) om de efficiëntie van de funtionaliseringen beoordelen. Valkuilen en stelde probleemoplossingsmethoden worden aangepakt als modificaties van de techniek die kan worden gebruikt om verder afstemmen macromeer en functionaliteit resulterende hydrogel fysische en chemischeeigenschappen. Gebruik van gesynthetiseerde producten voor de vorming van hydrogels voor drug delivery en cel-materiaal interactie studies moeten worden aangetoond, met bijzondere aandacht besteed aan het wijzigen hydrogelsamenstelling te maaswijdte beïnvloeden, controleren hydrogel stijfheid en afgifte van geneesmiddelen.
Poly (ethyleenglycol) (PEG) hydrogelen vaak biomaterialen gebruikt in regeneratieve geneeskunde en drug delivery toepassingen 1-3. Deze hydrogels bieden aanzienlijke voordelen ten opzichte van andere biomaterialen. PEG hydrogelen kunststof, met een hoge mate van controle over technische eigenschappen zoals modulus en afbraaksnelheid vergelijking met hun natuurlijke tegenhangers biomateriaal 1. Als ze synthetisch zijn afgeleid PEG is aanzienlijk minder batch-to-batch variabiliteit versus natuurlijke afgeleide materialen 4. Door de chemische samenstelling van PEG hydrogelen die sterk hydrofiel, bestand tegen eiwitadsorptie en biocompatibele 3. Deze weerstand eiwit adsorptie kan PEG hydrogels om als blanco lei ", waardoor onderzoekers ondervragen en studie specifieke biologische of chemische factoren (drugs, biomoleculen, celadhesie peptiden enz.) en de specifieke rollen deze factors spelen in het controleren van cel-en / of weefsel gedrag.
Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 1: Voorbeelden van poly (ethyleenglycol) (PEG) architecturen A) lineaire PEG B) 4-arm PEG met een pentaerythritol kern C) 8-arm PEG met een hexaglycerol kern D) 8-arm PEG met een…. tripentaerythritol kern. n is het aantal PEG herhalingen aan elke arm. Elke herhaling een molecuulgewicht van 44 g / mol, derhalve n kan worden berekend uit het totale molecuulgewicht en de structuur / arm #.
PEG voorlopers zijn beschikbaar met verschillende architecturen en molecuulgewichten (Figuur 1 ). Het variëren van de architectuur (arm #) en ethyleenglycol herhalingen (n) van PEG kan worden gebruikt om eigenschappen van de hydrogel netwerken gevormd uit deze macromeren regelen. Ongemodificeerde PEG bevat eindstandige hydroxylgroepen die moet worden vervangen door een alternatieve functionaliteit om covalente verknoping via polymerisaties, de meest gebruikte verknopende strategie voor PEG hydrogelen, vóór de vorming van hydrogel netwerken. Er zijn verschillende chemische groepen die in PEG-macromeren kunnen worden opgenomen om polymerisatie en verknoping netwerk (acrylaat, methacrylaat, vinylether, norborneen, enz.) te vergemakkelijken. Ondanks de verscheidenheid aan terminal functionaliteiten om verknoping te vergemakkelijken, zijn er slechts twee mechanismen waardoor polymerisatie kan optreden: stap-en ketengroei (of een mengsel van beide, mixed-mode).
g2.jpg "width =" 600px "/>
Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2:.. Theoretische hydrogel netwerk schema A) Traditionele ketengroei polymerisatie resultaten in heterogene netwerken met dichte poly (methacrylaat) verknopen van regio's en betere netwerk nonidealities zoals lussen, gereageerde voorlopers, en permanente verwikkelingen B) Stap-groei polymerisatie resultaten in aanzienlijk homogeen netwerkstructuren (niet op schaal).
Functionaliteiten die verknopen via ketengroei polymerisatie niet de aanwezigheid van een extra vernettingsmiddel nodig. Echter,-keten gepolymeriseerd hydrogels produceren heterogeen netwerk structuren die dichte verknoping regio's (Figuur 2A) 1. In tegenstelling, stap-groei polymerisatie gesmeerdres het gebruik van een verknopingsmiddel of co-monomeer dat reactief is met de eindstandige functionele groepen van de PEG macromeren. Als de eindstandige functionele groepen op PEG alleen reageren met het verknopingsmiddel en het verknopingsmiddel kan alleen reageren met de eindstandige functionele groepen op PEG, dit resulteert in een grotere homogeniteit netwerkstructuur (figuur 2B) 1. Stap-polymerisaties ook typisch leiden tot hogere omzetting van functionele groepen, het verminderen van de hoeveelheid ongereageerd precursoren en potentieel immune / ontstekingsreacties door oplosbare, niet opgenomen macromeren 1. Gemengde modus polymerisatiewerkwijzen zijn ook ontwikkeld dat zowel stap-en ketengroei polymerisatie gecombineerd door het gebruik van macromeren die zowel zelf-reactie (ketengroei) en reageren met een verknopingsmiddel (stap-groei). Dit levert hydrogels met kenmerken van elke polymerisatie mechanisme en kan worden gebruikt om complexe, afwisselende netwerkstructuren produceren dan beidestief-of keten-groei netwerken alleen 1.
Hoewel er een overvloed aan functionele groepen die kunnen worden gebruikt om PEG functionaliseren en hydrogelvorming vergemakkelijken, methacrylaten en norbornenen zijn enkele van de meest voorkomende ketting-en stap-groei polymerisatie groepen, respectievelijk. Beide functionaliteiten bieden uitstekende spatiotemporal controle over het netwerk polymerisatie, en wanneer gebruikt om cellen in te kapselen, deze netwerken ondersteunen hoge totale cel overlevingskansen 5-7. Dimethacrylaat gefunctionaliseerde PEG (PEGDM) crosslink via ketenpolymerisatie en maakt de opname van biomoleculen of andere factoren door copolymerisatie met acrylaat-, methacrylaat-of soortgelijke gefunctionaliseerde biomoleculen 5,6. PEGDM hydrogels hebben belangrijke voordelen ten opzichte van alternatieve ketengroei polymerisatie systemen zoals acrylaat gefunctionaliseerde PEG (PEGDA). Met behulp van traditionele methoden, kan PEGDA sneller worden gesynthetiseerd dan PEGDM; however, met behulp van microgolf-geassisteerde synthese, PEGDM synthese is nog efficiënter. PEGDA vaak gesynthetiseerd nachts 8 of 24-uurs 9 reacties, maar kan ook worden gesynthetiseerd in vier uur bij verhoogde temperaturen 10. PEGDM wordt traditioneel ook gesynthetiseerd door reactie van 's nachts 11 of 24 uur 5, met een aantal methoden de reactie tijd te breiden tot 4 dagen 12. Met behulp van de microgolf-geassisteerde methode hier aangetoond, kan PEGDM worden geproduceerd in een 5 min reactie. Hoewel PEGDM heeft langzamer kinetiek dan PEGDA 13, de verknopingsreactie voor PEGDM nog snel, voorkomen in minuten en bereikt een grotere macromeer conversie dan PEGDA de verhoogde hydrofobiciteit van de methacrylaatgroep verhoogt functionele groep aggregatie in oplossing, waardoor de kans op toenemende radicale overdracht en omzetting van methacrylaat 14. PEGDM hydrogelen zijn ook geassocieerd met verhoogde cellulaire levensvatbaarheid en groeivergeleken PEGDA hydrogelen waarschijnlijk door de verminderingen reactiesnelheid op een bepaald moment, die radicaalconcentratie en ongereageerd macromeren onderhavige 14 vermindert. Thiol-polymerisaties zoals met-norborneen gefunctionaliseerde PEG (PEGN) vorm hydrogels via stap-groei polymerisatie en vereisen het gebruik van PEGN en een verknopingsmiddel dat een gemiddelde van meer dan twee functionele groepen bevatten. Aangezien thiyl radicalen reageren met norborneen koolstof-koolstof dubbele bindingen, multi-thiol bevattende crosslinkers worden vaak gebruikt om PEGN hydrogels verknopen, waardoor gemakkelijke opname van peptiden met cysteïne aminozuren functionaliteiten 7. Hoewel er tal van andere chemicaliën die via stap-groei polymerisatie reactie (Michael-additiereacties zoals thiol-acrylaat 15 en thiol-vinylsulfon 16, "Instructies" reacties zoals azide-alkyn 17 enz.), thiol-norborneen hydrogelen zeer vaak voor, omdat de stam vande norborneenring de reactiesnelheid aanzienlijk verhoogt en verlaagt de kans op de norbomeen dubbele binding ondergaan ketenpolymerisatie 7.
De beslissing tussen methacrylaat, norborneen, of alternatieve functionalisering aan hydrogelvorming vergemakkelijken is grotendeels gebaseerd op de aanpak. Bijvoorbeeld zijn ketengroei gepolymeriseerde PEGDM netwerken blijkt goed geschikt om cel lokalisatie beheersen de ontwikkeling van een tissue engineered periost 18,19. Stap groei gepolymeriseerd PEG netwerken zijn beter geschikt voor de opname van peptidesequenties enzymatisch-responsieve hydrogel degradatie vergemakkelijken, vanwege het gemak van opname van enzymsubstraat sequenties met thiol (cysteine) bevattende peptiden en gefunctionaliseerde norborneen macromeren 20. Indien de vraagstelling beste worden aangepakt door het gebruik van stap-groei hydrogels, Fairbanks et al.. Een gedetailleerde beschrijving van de norbornene functionaliseringsreacties strategie voor PEG 7. Dit document zal in detail hoe PEG en peptide sequenties kunnen worden gefunctionaliseerd (met een methacrylaat voor PEG, en een methacrylamide voor peptiden) voor ketenpolymerisatie reacties.
Traditioneel PEGDM wordt bereid door PEG met methacryloylchloride en triethylamine in dichloormethaan. De reactie wordt vooruitgang bij kamertemperatuur 11 gedurende 24 uur of 5, met een aantal methoden uitstrekkende reactietijd op 4 dagen 12 vóór filtratie, neerslaan in diethylether en collectie. Terwijl vele variaties van deze benadering bestaan allemaal tijdrovend, vereisen een grote reeks van chemische synthese apparatuur en zijn niet milieuvriendelijk daar het om het gebruik van relatief grote hoeveelheden van hoogzuiver reagentia en oplosmiddel. Om deze beperkingen te omzeilen, Lin-Gibson et al.. Een microgolf-geassisteerde, oplosmiddelvrije methode om PEG functionaliseren met te ontwikkelen rminal methacrylaatgroepen (figuur 3A) 12. In deze reactie, de terminale alcoholgroepen van PEG reageren met een van de atomen van de carbonyl methacrylzuuranhydride een carboxyl vormen. Dit genereert het PEGDM product, met methacrylzuur als een bijproduct. Deze synthese heeft veel van de kenmerkende voordelen van microgolf synthese, inclusief verminderde reactietijd en oplosmiddelvrije synthesemethoden 21. De magnetron synthese de voorkeur de eerder beschreven methoden is het beduidend sneller, vergt minder uitgebreid synthese apparatuur (bijv. glaswerk, reactieplaten) en gebruikt minder algemene reagens en oplosmiddel bedragen als oplosmiddelen alleen vereist voor productzuivering / verzamelen en niet synthese, waardoor het zuiniger en milieuvriendelijker.
0px "/>
Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3:. Functionalisering schema A) poly (ethyleenglycol) reageren met 10x molaire overmaat methacrylzuuranhydride aan poly (ethyleenglycol) methacrylaat B) Dezelfde methode kan worden gebruikt om de N-terminus van peptidesequenties functionaliseren produceren, die een. methacrylamide gefunctionaliseerde peptide. Door deze procedure voor het splitsen van het peptide van de hars, kan selectieve functionalisering van de N-terminus worden uitgevoerd zoals aminozuurzijketens groepen beschermd blijven. n: aantal PEG herhalingen in het macromeer (n = 45,5, 227 en 455 respectievelijk de 2, 10 en 20 kDa lineaire PEG gebruikt). R1 RN: aminozuurzijketens. PG1 naar PGN: zijketenbeschermende groepen. TFA: trifluorazijnzuur. TIPS: triisopropylsilaan. Dodt: 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol. H 2 O: water.
De microgolven methacrylation werkwijze is onlangs aangepast door onze groep aan het N-terminus van peptiden functionaliseren met methacrylamide groepen (figuur 3B) om peptide opname in een verscheidenheid van polymeren en polymere netwerken. In deze reactie, de primaire amine van de N-terminus van het peptide reageert met het carbonyl atoom op de methacrylzuuranhydride een amide. Dit genereert het methacrylamide gefunctionaliseerde peptide met methacrylzuur geproduceerd als een bijproduct. Bij deze procedure aan de N-terminus van peptidesequenties functionaliseren, is het belangrijk dat aminozuren met reactieve zijketens (primaire aminen (lysine), alcohol (serine, threonine) en fenolen (tyrosine)) worden beschermd tijdens functionalisering en beschermende groepen worden alleen gesplitst na methacrylamide oprichting.
Dit artikel zal beide microw tonenave-ondersteunde methoden om PEGDM synthetiseren en functionalize on-hars peptide sequenties, aandacht voor valkuilen en suggereren methoden voor probleemoplossing. In dit artikel zullen methoden om analytisch chemische technieken vaak gebruikt om product functionalizering beoordelen voeren gedetailleerd, en suggesties en middelen voor het uitvoeren van meer geavanceerde aanpassingen zal worden gegeven. Typische resultaten zal worden gedemonstreerd, waaronder het gebruik van de gesynthetiseerde PEGDM om hydrogel netwerken te vormen, het benutten van de gevormde hydrogelen tot het vrijkomen van een model drugscontrole, met gebruikmaking van gefunctionaliseerde peptiden naar cel-hydrogel interacties vergemakkelijken. Bijzondere aandacht zal worden besteed aan het karakteriseren hydrogelmaasgrootte en bespreken hoe hydrogel samenstelling kan worden afgestemd op deze onderliggende fysieke eigenschap, die op zijn beurt bulkmateriaal eigenschappen zoals stijfheid en geneesmiddelafgifteprofiel beïnvloeden.
De methoden eerder toegelicht zijn van onschatbare waarde voor de synthese van PEGDM en methacrylamide functionalisering van peptiden of andere amine bevattende verbindingen. Deze materialen kunnen vervolgens worden gebruikt voor regeneratieve geneeskunde en drug delivery toepassingen. Door de hydrofiele aard van PEG hydrogelen gevormd uit PEG-macromeren een hoog watergehalte vergelijkbaar met veel weefsels van het lichaam 2. Deze eigenschap maakt PEG zeer resistent tegen eiwitadsorptie en derhalve inert in het lichaam 3. Echter, de hygroscopische aard van PEG lastig te bewijzen tijdens functionalisering. Als er water aanwezig is in de PEG monster tijdens de methacrylation procedure, zal de methacrylzuuranhydride bij voorkeur met water reageren tot methacrylzuur produceren, en een slechte functionalisering van PEG zal leiden.
Daarom is een van de belangrijkste stappen die worden genomen om succesvolle methacrylation van de PEG of peptide ervoor te watervrij handhavenrous reactieomstandigheden. De aanbevolen stap van het drogen van al het glaswerk voor gebruik is bedoeld om watervervuiling te voorkomen. De aanwezigheid van water in het monster kan worden gezien in de NMR-analyse, als een brede piek bij 1,7 ppm (Figuur 4). Als slechte methacrylation wordt waargenomen, zelfs na drogen glaswerk, kan chemicaliën worden gedroogd over natriumsulfaat of andere droogmiddelen (moleculaire zeven, enz.) vóór gebruik. Destillatie kan ook worden gebruikt om water te verwijderen en te zuiveren methacrylzuuranhydride voor gebruik en azeotrope destillatie kan worden gebruikt drogen PEG 23. In extreme gevallen, synthese kan worden uitgevoerd in een dashboardkastje uitgevoerd om verder te zorgen voor adequaat watervrije omstandigheden. Een tweede ronde van methacrylation, volgens dezelfde procedure kan ook worden uitgevoerd om functionalisering verhogen. Omdat er altijd een kans dat bijkomende ronden van functionalisering is vereist, moet erop worden gelet bij stap 1.7 en 1.9 snel verzamelen PEGDM vacuümfiltratie. Vacuüm filtratie langer dan absoluut noodzakelijk verhogingen PEG blootstelling aan lucht, waardoor de mogelijkheid voor wateradsorptie.
Hoewel het percentage overmaat methacrylzuuranhydride hydroxyl functionele groepen blijft ongewijzigd en maakt de PEG functionalisering (bijv. arm #) de PEG precursor wordt algemeen geassocieerd met een daling in procenten functionaliseren bereikte (niet gepubliceerde resultaten, Benoit lab). Om preventief pakken deze vermindering van functionalisering efficiëntie, of als bepaalde moeilijkheden ondervonden bereiken voldoende hoog functionalisering, de duur van de microgolf reactie kan worden verhoogd, indien de microgolf interval wordt gehandhaafd op 30 sec. Terwijl 10 molaire overmaat is meestal voldoende, kan de hoeveelheid methacrylzuuranhydride in de reactie worden verhoogd tot het percentage functionalisering bereikte 12 verhogen.
Het is belangrijk dat deAanvullende precipitatiestap (1.9) worden uitgevoerd om goede NMR-signalen bereiken. Hoewel het verleidelijk om de tweede precipitatie dezelfde dag uitgevoerd als synthese, het drogen van het monster nacht voordat opnieuw neerslaan werd gevonden dat het verwijderen van overtollig methacrylzuuranhydride en methacrylzuur steun. Monstervoorbereiding is ook belangrijk voor het bereiken schone NMR spectra, en derhalve monster wordt bereid met de aanbevolen omstandigheden. Figuur 4 toont representatieve 1H NMR-resultaten kunnen gefunctionaliseerde PEGDM. Door het analyseren van de verhouding van de terminal methacrylaat protonen naar het centrum van PEG protonen, werd de PEGDM bepaald adequaat worden gefunctionaliseerde. MALDI monstervoorbereiding is eveneens belangrijk voor een duidelijke lezing bereiken. MALDI is bijzonder gevoelig voor de aanwezigheid van zouten en hoge monsterconcentraties. Indien een duidelijke MALDI lezen (een intensiteit boven de 50 willekeurige eenheden (au) met een hoge signaal: ruisverhouding) niet kan worden verkregen, het monster solution moeten 1:100 in MALDI oplosmiddel worden verdund en vervolgens worden gecombineerd met de matrix-oplossing en opnieuw geanalyseerd. Figuur 5 toont representatieve MALDI-TOF resultaten na correcte peptide functionalisering, decollete, en monstervoorbereiding. Splitsing van een klein monster hars voorafgaand aan functionalisering (figuur 5A) toont correcte synthese van het peptide GKRGDSG, correcte methacrylamide functionalisering van de in figuur 5B peptide.
Terwijl functionalisering van on-hars peptiden is een relatief deugdelijke procedure, de splitsing voorwaarden voor elke sequentie vereist vaak tuning. Voor lange sequenties waar veel aminozuren zijketens (> 30 aminozuren lang, of> 15 aminozuren met beschermende groepen) zijn beschermd, moet de duur van splitsing worden verhoogd met een uur. Indien splitsing tijd te veel wordt verlengd, kan peptidebinding splitsing ontstaan als gevolg van langdurige blootstelling aan zuur. MALDI ana lysis kan zeer nuttig zijn in het openbaren van eventuele fouten die zich in peptide synthese of decollete. Een waargenomen daling beneden wordt molecuulgewichten kunnen aangeven dat aminozuur (aminozuren) niet goed stel of peptide dat fractionering plaatsvond (zie Tabel 2 voor bronnen vaak waargenomen veranderingen in molecuulgewicht). Als het waargenomen molecuulgewicht hoger dan verwacht door het gewicht van een beschermende groep, is het waarschijnlijk dat splitsing en deprotectie was onvoldoende en het peptide worden recleaved extra tijd.
Aminozuurdeletie | MW verandering (g / mol) | Ongesplitste Protecting Groups | x; "> MW verandering (g / mol)Gewoonlijk aanwezig Ionen | MW verandering (g / mol) | |
Ala | -71 | Acetyl | +42 | Cl – | +35 |
Arg | -158 | Allyl | 40 | K + | 39 |
Asn | -114 | Alloc | 85 | Mg 2 + | <td style = "width: 64px;"> 24|
Adder | -115 | Boc | 100 | Na + | +23 |
Cys | -103 | Fmoc | +223 | ||
Gin | -128 | OtBu | +56 | ||
Glu | -129 | Pbf | 252 | ||
Gly | -57 | tBu | +56 | ||
Zijn | -137 | Trt | +242 | ||
Ile | -113 | ||||
Leu | DTH: 64px; "> -113|||||
Lys | -128 | ||||
Voldaan | -131 | ||||
Phe | -147 | ||||
-97 | |||||
Ser | -87 | ||||
Thr | -101 | ||||
Trp | -186 | ||||
-147 | |||||
Val | -99 |
Tabel 2. Vaak waargenomen veranderingen peptide molecuulgewicht.
Macromeren geproduceerd met behulp van microgolven methacrylation werkwijzen kunnen worden gebruikt in een aantal van regeneratieve medicijnen of geneesmiddelafgifte toepassingen. De gefunctionaliseerde peptiden en PEGDM hier gesynthetiseerd kunnen in polymeren met nitroxide gemedieerde polymerisatie (NMP), atoomoverdrachtsradicaalpolymerisatie (ATRP) of Omkeerbare Addi worden opgenomentie-Fragmentatie Transfer (VLOT) methoden 24. Hydrogel netwerken kunnen ook worden geproduceerd in de aanwezigheid van cellen, zoals eerder in de Jupiter artikel aangetoond door Khetan en Burdick 22. Dit vereist vaak het opnemen van celadhesie zoals RGD peptiden of extracellulaire matrix moleculen PEG alleen biedt geen celmateriaal interacties essentieel voor overleving en functie van bepaalde celtypes 25. Peptiden, bijvoorbeeld, kunnen worden gesynthetiseerd met behulp van traditionele vaste-fase peptidesynthese en gefunctionaliseerd zoals hier beschreven, zodat voor opname in hydrogel netwerken. Zoals gezien in figuur 6, opname van het met methacrylamide gefunctionaliseerde cel adhesie peptide GK RGDS G in hydrogelen (0,5 mM) bevordert adhesie van menselijke mesenchymale stamcellen (MSCs) PEG hydrogel oppervlakken, waardoor het aantal aangesloten en verspreiding cellen (Figuur 6B ), vergeleken met PEG hydrogelen zonder de cel adhesie peptide ( <strong> figuur 6A). Echter, eerdere werk aangetoond dat cel-materiaal interacties verder worden versterkt door toevoeging van 3400 Da PEG spacers tussen lijm peptiden en hydrogel netwerken, om peptide-integrine sterische hinder te verminderen. Zonder toevoeging van de spacer kunnen cellen interageren met PEG hydrogelen via niet-specifieke eiwitten die adsorberen aan het peptide, in plaats van door integrine gemedieerde interactie met peptiden 26. Om deze PEG spacer opnemen en voorkomen niet-specifieke interacties kunnen peptiden worden geconjugeerd met PEG via monofunctionalized N-hydroxysuccinimidyl-geactiveerde esters, zoals beschreven door Hern en Hubbell 26.
Toepassingen van hydrogel netwerken vereisen strakke controle over de eigenschappen van het materiaal. Een belangrijk voordeel van PEG hydrogelen is een hoge mate van controle over deze eigenschappen. Bijvoorbeeld, het molecuulgewicht, arm nummer, en de gewichts% PEG gebruikt bij de vorming van hydrogel netwerken worden gewijzigd fine-tune eigenschappen voor specifieke toepassingen. Dit maakt strakke controle hydrogelmaasgrootte (ξ), die hydrogel zwelverhouding (Q) en stijfheid (elasticiteitsmodulus E) regelt. Dit wordt geïllustreerd in figuur 7A en gekwantificeerd in figuur 8, waar toenemende PEG macromeer molecuulgewicht resulteert in een toename hydrogelmaasgrootte (Figuur 8A) en een afname van stijfheid hydrogel (figuur 8B).
De onderliggende fysieke eigenschap dat bulk gedrag besturingselementen in deze hydrogel netwerken, maaswijdte, wordt berekend volgens de Flory-Rehner vergelijking 16. Om deze berekening uit te voeren, wordt de volumetrische zwelverhouding (Q) eerst berekend uit vergelijking 4:
(4)
waar ρ s dichtheid van water (1 g / ml), ρ p dichtheid van PEG (1,12 g / ml), M s is gezwollen massa van de hydrogel en M D wordt drooggewicht van het hydrogel (vaak gemeten na invriezen en vriesdrogen van hydrogels). Het molecuulgewicht tussen verknopingen (M c in g / mol) wordt dan berekend uit vergelijking 5:
(5)
waarbij M N het aantal-gemiddelde MW PEG (in g / mol), is het volume van het polymeer , V1 is de molaire hoeveelheid water (18 ml / mol), V2 is het evenwicht polymeer volumefractie van de hydrogel
( ) En X1 </sub> is de polymeer-oplosmiddel interactie parameter voor PEG en water (0,426) 16. Het aantal bindingen tussen crosslinks (n) wordt dan berekend uit vergelijking 6:
(6)
waarbij N b het aantal bindingen in de PEG herhaling (3) en M r de MW van de PEG repeat (44 g / mol) 27. Hierdoor kan de wortel van het gemiddelde kwadraat end-to-end afstand van de polymeerketen (In nm) te worden berekend uit vergelijking 7:
(7)
waarbij L de gemiddelde lengte binding (0.146 nm, berekend op basis van CC en CO bindingslengten) en C n de karakteristieke verhouding van het polymeer (4.0 voor PEG) 28. FiNally, maaswijdte van de hydrogel kan worden berekend uit vergelijking 8:
(8)
Hydrogel eigenschappen kunnen op soortgelijke wijze worden afgesteld door de hoeveelheid PEG gebruikt bij de vorming van hydrogels. Afnemende het gewichtspercentage PEG macromeer resulteert in een toename hydrogelmaasgrootte, die vervolgens vermindert hydrogel stijfheid. Figuur 7B illustreert en figuur 9 kwantificeert hoe het gewichtspercentage PEG in hydrogelvorming kan worden om maaswijdte (fig. 9A) en resulterende hydrogel stijfheid (figuur 9B). Als substraat stijfheid is aangetoond dat ze cel gedrag zoals stamcel differentiatie 29, de mogelijkheid streng te controleren stijfheid is een belangrijke eigenschap in hydrogel fabricage.
Hydrogels kunnen ook worden gebruikt om control drug delivery. Zoals getoond in figuur 7A en aangetoond in figuur 10, waardoor het molecuulgewicht van PEG macromeren vergroot maaswijdte van de hydrogel netwerk vervolgens verhogen van de afgifte van ingekapselde modelgeneesmiddel, runderserumalbumine (BSA). Terwijl hydrogel monsters in deze studie werden vernietigd op t = 195 uur om voor het meten van hydrogel natte en droge massa voor maaswijdte berekeningen, het is onze ervaring dat bleef BSA hoeveelheden zouden vrijkomen had de monsters werden gedurende langere perioden. De onvolledige afgifte van BSA waargenomen in figuur 10 is niet onverwacht, aangezien andere groepen ook gemeld dat BSA is tegen diffusie in PEG hydrogel netwerken 30. Onvolledige afgifte van ingekapselde eiwit kan optreden door waterstofbinding tussen eiwitten en PEG macromeren of covalente binding tussen de methacrylaatgroep op het PEG en primaire aminegroepen op lysineresten in BSA 31 </sinschrijven>. Daarnaast BSA is gevoelig voor aggregatie en disulfidebrugvorming loop van de tijd, die de effectieve Stokes straal kan verhogen en de release van hydrogelen belemmeren. Als ketengroei hydrogels, zoals deze PEGDM hydrogelen, zijn gevoelig voor netwerk nonidealities en heterogene hydrogelmaasgrootte (Figuur 2A), is het ook mogelijk dat een deel van de ingekapselde BSA in gebieden van de hydrogel die aanzienlijk kleinere mazen hebben formaat dan het algemene gemiddelde in de gel, waardoor de release. Terwijl onvolledig nonFickian afgifte (gegevens niet getoond) van ingekapseld BSA werd waargenomen in dit geval Fickian gereguleerde afgifte van talrijke andere model geneesmiddelen, zoals insuline en ovalbumine, is aangetoond met soortgelijk PEGDM hydrogels 30. Bovendien Watkins en Anseth hebben confocale laser scanning microscopie gebruikt om het vrijkomen van fluorescerende moleculen bij soortgelijke hydrogels aangetoond is acceptabel gemodelleerd met Fickian diffusie mijthods 32.
Terwijl de hydrogels gevormde studie afbreekbare, netwerk afbraak andere parameter die kan worden opgenomen in en afgestemd binnen deze netwerken. Zorgen voor een gereguleerde hydrogel afbraak kan leiden tot veranderingen in celgedrag 33, bevorderen van weefselgroei of gastheerweefsel ingroei of eliminatie van de noodzaak van explantatie 34. Afbreekbare PEG hydrogelen worden gewoonlijk gesynthetiseerd door ring-opening hydrolytisch afbreekbare d, l-lactide, glycolide of ε-caprolacton groepen op hydroxylgroepen in PEG vóór methacrylation 35. Deze drie groepen afgebroken door hydrolyse van de ester functionaliteit, waarbij de glycolide esters met de grootste gevoeligheid voor afbraak, gevolgd door lactide en caprolacton ester, vanwege hun verschillende hydrofobiciteit. Na verwerking van hydrolytisch afbreekbare groepen, kan PEG verder worden gefunctionaliseerd met de methacrylation procedure detailed in dit artikel, waardoor de vorming van hydrogel netwerken door middel van latere radicaal-geïnitieerde ketenpolymerisatie 36,37. De afbraaksnelheid van hydrogel netwerken kan worden geregeld door variatie van de identiteit van de hydrolytisch afbreekbare groep (glycolide, lactide, enz.) en door het variëren van het aantal herhalingen afbreekbare opgenomen in de structuur 35,38.
Theoretisch zou de methoden die hier getoond worden voor acrylering van PEG en peptiden door vervanging van de methacrylzuuranhydride met acryl anhydride in stappen 1.3 en 3.3, respectievelijk. Echter, acrylzuuranhydride meer dan 20 keer de kosten van methacrylzuuranhydride 39,40, waardoor microgolven acrylering aanzienlijk minder aantrekkelijk dan microgolven methacrylation.
Wij hebben een eenvoudige, snelle methode om functionaliseren PEG en peptiden, hoe de efficiëntie van deze werkwijze te evalueren aangetoond en gegeven middelen voor uzingen de gesynthetiseerde materialen om hydrogel netwerken te vormen. Deze synthetische tools zijn zeer veelzijdig in hun toepassingen, en moet een nietje in een aantal drug delivery en materialen onderzoekslaboratoria bewijzen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd deels gefinancierd door een Howard Hughes Med-in-Grad gemeenschap (AVH), van start-up fondsen van de Universiteit van Rochester en de Orthopedische Research and Education Foundation / Spier-Transplantatie Stichting (open-ended vastgoedfondsen verstrekt aan dr. Danielle Benoit / MTF). De auteurs willen graag Dr James L. McGrath bedanken voor het gebruik van zijn apparatuur.
3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol | Tokyo Chemical Industry Co, LTD | D2649 | CAS 14970-87-7 |
Acetonitrile | J.T. Baker | UN1648 | CAS 75-05-8 |
Amino Acids | AAPPTech | Glycine: AFG101 | CAS 29022-11-5 |
Arginine: AFR105 | CAS 154445-77-9 | ||
Asparagine: AFD105 | CAS 71989-14-5 | ||
Serine: AFS105 | CAS 71989-33-8 | ||
Anhydrous diethyl ether | Fisher Scientific | UN1155 | CAS 60-29-7 |
Citric acid | Sigma Aldrich | C1857 | CAS 77-92-9 |
Deuterated chloroform | Cambridge Isotope Laboratories Inc. | DLM-7-100 | CAS 865-49-6 |
Dichloromethane | Fisher Scientific | UN1593 | CAS 75-09-2 |
Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A1181 | CAS 7087-68-5 |
Dimethylformamide | Fisher Scientific | D119-4 | CAS 68-12-2 |
Fmoc-Gly-Wang resin | Peptides International | RGF-1301-PI | 100-200 mesh size |
Methacrylic anhydride | Alfa Aesar | L14357 | CAS 760-93-0 |
N-Methylpyrrolidone | VWR | BDH1141-4LG | CAS 872-80-4 |
On-resin peptides | Synthesized in-house | On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc. | |
O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate | AnaSpec Inc | 510/791-9560 | CAS 94790-37-1 |
Peptide Calibration Standard | Care | 206195 | |
Piperazine | Alfa Aesar | A15019 | CAS 11-85-0 |
Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear | Alfa Aesar | B22181 | CAS 25322-68-3 |
Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear | Alfa Aesar | B21955 | |
Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear | Sigma Aldrich | 81300 | JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG |
Thioanisole | Alfa Aesar | L5464 | CAS 100-68-5 |
Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | CAS 76-05-1 |
Triisopropylsilane | Alfa Aesar | L09585 | CAS 6485-79-6 |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Tokyo Chemical Industry Co, LTD | C1768 | CAS 28166-41-8 |