Denne filmen vil illustrere en hurtig, effektiv metode for å metakrylat poly (etylenglykol), slik at kjede-polymeriseringer og hydrogel-syntese. Det vil vise hvordan man på samme måte introdusere methacrylamide funksjoner til peptider, detalj felles analysemetoder for å vurdere funksjon effektivitet, gi forslag til feilsøking og avanserte modifikasjoner, og demonstrere typiske hydrogel karakterisering teknikker.
En av de viktigste fordelene med å bruke poly (etylenglykol) (PEG) makromerer i hydrogeldannelse er syntetisk allsidighet. Muligheten til å trekke fra et stort utvalg av PEG molekylære vekter og konfigurasjoner (arm nummer, armlengde, og forgrening mønster) gir forskerne stram kontroll over resulterende hydrogel strukturer og egenskaper, inkludert Youngs modulus og maskevidde. Denne videoen vil illustrere en rask, effektiv, løsemiddelfritt, mikrobølgeovn-assistert metode for å metakrylat PEG forløpere i poly (etylenglykol) dimethacrylate (PEGDM). Dette syntetiske metoden gir sårt tiltrengte utgangsmaterialer for applikasjoner i levering av legemidler og regenerativ medisin. Den viste metode er overlegen i forhold til tradisjonelle methacrylation metoder som det er vesentlig raskere og enklere, samt mer økonomisk og miljøvennlig, ved hjelp av mindre mengder av reagenser og løsningsmidler. Vi vil også demonstrere en tilpasning av denne teknikken for on-resin metakryloksyetyltrimetoksysilanylamide funksjonalisering av peptider. Denne mot-resin metoden tillater N-terminus av peptider til å bli funksjonalisert med metakrylamid grupper før avbeskyttelse og spalting fra harpiks. Dette gir mulighet for selektiv tilførsel av metakrylamid gruppene til N-termini av peptidene mens aminosyrer med reaktive sidegrupper (f.eks primært amin med lysin, primær alkohol med serin, sekundære alkoholer med treonin, og fenol av tyrosin) forblir beskyttet, hindrer funksjon på flere steder. Denne artikkelen vil detalj felles analysemetoder (proton NMR spektroskopi (H-NMR) og Matrix Assisted Laser desorpsjon ionisering Tid of Flight massespektrometri (MALDI-TOF)) for å vurdere effektiviteten av functionalizations. Vanlige fallgruver og antydet feilsøking metoder vil bli behandlet, slik det vil modifikasjoner av den teknikk som kan anvendes for ytterligere å tune makromer funksjonalitet og resulterende hydrogel fysiske og kjemiskeegenskaper. Bruk av syntetiske produkter for dannelsen av hydrogeler for levering av legemidler og cellemateriale interaksjonsstudier vil bli demonstrert, med spesiell oppmerksomhet på å endre hydrogelmaterialet å påvirke maskevidde, kontrollerende hydrogel stivhet og narkotika utgivelse.
Poly (etylenglykol) (PEG) hydrogeler er vanlige biomaterialer som brukes i regenerativ medisin og medisinering programmer 1-3. Disse hydrogeler gir betydelige fordeler fremfor andre biomaterialer. PEG hydrogeler er syntetiske, med en høy grad av kontroll over tekniske egenskaper som elastisitetsmodul, og nedbrytningshastigheten i forhold til deres naturlige motstykker biomateriale en. Ettersom de er syntetisk avledet, har PEG betydelig mindre batch-til-batch variasjon versus naturlig avledede materialer fire. På grunn av den kjemiske sammensetningen av PEG, er disse hydrogeler er sterkt hydrofile, motstandsdyktig mot protein adsorpsjon, og biokompatibelt 3. Denne motstanden mot protein adsorpsjon tillater PEG hydrogeler å fungere som en "blank slate", slik at forskerne å forhøre og studere spesifikke biologiske eller kjemiske faktorer (narkotika, biomolekyler, celle adhesjon peptider, etc.) og de spesifikke roller disse factors spiller i å kontrollere celle-og / eller vev oppførsel.
Klikk her for å se større bilde .
Figur 1: Eksempler på poly (etylenglykol) (PEG) arkitekturer A) Lineær PEG B) 4-arm PEG med en pentaerythritol kjerne C) 8-arm PEG med en heksaglycerol kjerne D) 8-arm PEG med en…. tripentaerythritol kjerne. n er antallet PEG gjentas på hver arm. Hver repetisjons har en molekylvekt på 44 g / mol, og derfor n kan beregnes ut fra den totale molekylvekt og struktur / arm #.
PEG forløpere er tilgjengelige med en rekke arkitekturer og molekylvekter (figur 1 ). Varierende arkitekturen (armen #) og etylenglykol gjentar (n) av PEG kan brukes for å kontrollere egenskapene til hydrogel-nettverk som dannes fra disse makromerer. Umodifisert PEG inneholder terminal hydroksylgrupper som må erstattes med en alternativ funksjonalitet for å legge til rette for kovalente kryssbinding via polymerisasjoner, den mest vanlig ansatt fornetning strategi for PEG hydrogeler, før dannelsen av hydrogel nettverk. Det finnes en rekke kjemiske grupper som kan bli innlemmet i PEG makromerer for å lette polymerisasjon og tverrbinding nettverk (akrylat, metakrylat, vinyl-eter, norbornen, etc.). Til tross for den rekke terminal funksjonalitet som er tilgjengelige for å lette tverrbinding, er det bare to mekanismer som polymerisasjonen kan oppstå: steg-og kjede-vekst (eller en blanding av de to, blandet modus).
g2.jpg "width =" 600px "/>
Klikk her for å se større bilde .
Figur 2:.. Teoretisk hydrogel nettverk skjematisk A) Tradisjonelle kjeden vekst Polymeriseringsresultatene i heterogene nettverk som inneholder tett poly (metylmetakrylat) kryssbinding av regioner og økt nettverks nonidealities som looper, ikke reagert forløpere, og permanente forviklinger B) Step-vekst Polymeriseringsresultatene i betydelig mer homogene nettverksstrukturer (ikke i målestokk).
Funksjonalitet som tverrbinde via kjedevekst polymerisering krever ikke tilstedeværelse av en ytterligere tverrbindingsmiddel. Imidlertid kjede-polymerisert hydrogeler gir heterogene nettverk strukturer inneholdende tverrbindings tette områder (figur 2A) 1. I kontrast, step-vekst polymerisasjon krav som stillesres bruk av et tverrbindingsmiddel eller ko-monomer som er reaktiv med de terminale funksjonelle grupper i den PEG makromerer. Ettersom de terminale funksjonelle grupper i den PEG bare kan reagere med tverrbindingsmiddel og tverrbindingsmiddelet bare kan reagere med de terminale funksjonelle grupper i den PEG, dette resulterer i større nettstruktur homogenitet (figur 2B) 1. Step-vekst polymerisasjoner også vanligvis føre til høyere konvertering av funksjonelle grupper, redusere mengden av ikke-reagerte forløpere og potensial for immun / inflammatoriske responser som følge av løselige, unincorporated makromerer en. Blandet modus polymerisasjons-metoder er også blitt utviklet som kombinerer både trinn-og kjede-vekst polymerisasjon ved bruk av makromerer som både kan selv-reagere (kjede-vekst), og reagere med et tverrbindingsmiddel (step-vekst). Dette gir hydrogeler med egenskapene i hver polymerisasjon mekanisme, og kan brukes til å produsere mer komplekse og varierte nettverkstrukturer enn entenstep-eller kjede-vekst nettverk alene en.
Mens det er et mangfold av funksjonelle grupper som kan brukes til å functionalize PEG og letter hydrogel formasjon, metakrylater og norbornenes er noen av de mest vanlige kjede-og trinn-vekst polymerisasjons-delene, henholdsvis. Begge disse funksjonene gir utmerket kontroll over tid og rom nettverks polymerisasjon, og når det brukes til å innkapsle celler, er disse nettverk støtter høye totale celleoverlevelses 5-7. Dimetakrylat funksjonalisert PEG (PEGDM) tverrbinding via kjede polymerisasjon og tillater inkorporering av biomolekyler eller andre faktorer ved ko-polymerisering med akrylat-, metakrylat-, eller tilsvarende-funksjon biomolekyler 5,6. PEGDM hydrogeler har betydelige fordeler fremfor alternative kjede-vekst-polymerisasjons-systemer, for eksempel akrylat-funksjonalisert PEG (PEGDA). Ved hjelp av tradisjonelle metoder, kan PEGDA syntetiseres raskere enn PEGDM; hoWever, ved hjelp av mikrobølgeovn-assistert syntese, er PEGDM syntese enda mer effektiv. PEGDA er ofte syntetiseres i over natten 8 eller 24-timers 9 reaksjoner, men kan også bli syntetisert i fire timer ved forhøyede temperaturer 10. PEGDM er også tradisjonelt syntetiseres ved omsetning over natten 11 eller i 24 timer 5 med noen metoder for å forlenge reaksjonstiden til 4 dager 12. Ved hjelp av mikrobølge-assistert metode vist her, kan PEGDM bli produsert i en 5 min reaksjon. Mens PEGDM har langsommere reaksjonskinetikk enn PEGDA 13, er tverrbindingsreaksjon for PEGDM fortsatt hurtig, som forekommer i løpet av minutter, og oppnår større makromer konvertering enn PEGDA som økt hydrofobitet av metakrylat-gruppen øker funksjonell gruppe aggregering i løsning, for derved å øke sannsynligheten for radikal overføring og metakrylat konvertering 14. PEGDM Hydrogelene også forbundet med økt cellulær levedyktighet og vekst somsammenlignet med PEGDA hydrogeler, sannsynligvis på grunn av reduksjon i reaksjonshastigheten til enhver tid, noe som reduserer radikal konsentrasjon og uomsatte makromerer stede 14.. Tiol-ene polymeriseringer slik som de som bruker norbornen-funksjonalisert PEG (PEGN) danner hydrogeler via trinnvekst polymerisering, og krever bruk av PEGN og et tverrbindingsmiddel som inneholder et gjennomsnitt på mer enn to funksjonelle grupper. Siden thiyl radikaler reagerer med norbornen karbon-karbon dobbeltbindinger, multi-tiol inneholder crosslinkers ofte brukes til cross PEGN hydrogeler, slik at for lettvinte inkorporering av peptider med cystein aminosyrer funksjonaliteter 7. Mens det er en rekke andre kjemikalier som reagerer via trinnvekst polymerisering (Michael-addisjonsreaksjoner som tiol-akrylat 15 og tiol-vinyl-sulfon 16, et "klikk" reaksjoner som alkynet-azid 17 etc.), tiol-norbornen hydrogelen svært vanlig, så belastningen fraden norbornen ringen betydelig øker reaksjonshastigheten og reduserer muligheten for at norbornen-dobbeltbindingen gjennomgår kjede polymerisasjon 7..
Beslutningen mellom metakrylat, norbornen, eller alternativ funksjon å lette hydrogeldannelse er i stor grad basert på tilnærming. For eksempel, har kjeden vekst polymerisert PEGDM nettverk blitt demonstrert så godt egnet til å kontrollere celle lokalisering i utviklingen av en vev-konstruert periosteum 18,19. Trinn-vekst polymerisert PEG nettverk er bedre egnet for inkorporering av peptidsekvenser for å lette enzymatisk-responsive hydrogel nedbrytning, på grunn av den enkle innarbeidelse av enzymsubstrat-sekvenser ved hjelp av tiol (cystein) inneholdende peptider og norbornen functionalized makromerer 20. Hvis problemstillingen vil være best løses ved bruk av trinn-vekst hydrogeler, Fairbanks et al. Gir en detaljert beskrivelse av norbornene funksjon strategi for PEG 7. Dette papiret vil detalj hvordan PEG-og peptid-sekvenser kan bli funksjonalisert (med et metakrylat for PEG og metakrylamid for peptider) for kjede polymeriseringsreaksjoner.
Tradisjonelt er PEGDM fremstilt ved omsetning av PEG med metakryloyl-klorid og trietylamin i diklormetan. Reaksjonsblandingen tillates å gå videre ved romtemperatur natten over 11 eller i 24 timer 5 med noen metoder som strekker reaksjonstid på 4 dager 12 før filtrering, utfelling i dietyleter, og innsamling. Mens mange variasjoner av denne fremgangsmåten finnes, alle er tidkrevende, krever et stort utvalg av kjemiske syntese av utstyr, og er ikke miljøvennlig, ettersom de innebærer bruk av relativt store mengder av høy renhet reagenser og løsningsmiddel. For å omgå disse begrensningene, Lin-Gibson et al. Utviklet en mikrobølgeovn-assistert, løsemiddelfri metode for å functionalize PEG med te rminal metakrylat grupper (figur 3A) 12. I denne reaksjon, de terminale alkoholgrupper i PEG reagere med en av de karbonyl-atomer av metakrylsyre-anhydrid for å danne en karboksylgruppe. Dette genererer PEGDM produkt, med metakrylsyre som et sideprodukt. Denne syntesen har mange av de karakteristiske fordeler ved mikrobølge-syntese, inkludert redusert reaksjonstid og løsningsmiddel-frie syntesemetoder 21. Mikrobølge syntese er å foretrekke fremfor de tidligere omtalte fremgangsmåter som det er betydelig raskere, krever mindre omfattende synteseutstyr (for eksempel glass, reaksjons-plater), og bruker mindre samlet reagens-og løsningsmiddelmengder som løsningsmidler er kun nødvendig for produktrensing / innsamling og ikke for syntese, noe som gjør det mer økonomisk og miljøvennlig.
0px "/>
Klikk her for å se større bilde .
Figur 3:. Funksjonalise skjema A) poly (etylenglykol) omsettes med 10 ganger molart overskudd metakrylsyre-anhydrid for å produsere poly (etylenglykol) metakrylat B) Den samme fremgangsmåte kan brukes for å functionalize N-enden av peptid-sekvenser, som danner en. methacrylamide funksjonalisert peptid. Ved å utføre denne fremgangsmåten før spalting av peptidet fra harpiksen, kan den selektive funksjonalisering av de N-terminale utføres som aminosyre-sidegruppene forblir beskyttet. n: antall PEG gjentas i makromer (n = 45.5, 227 og 455, henholdsvis for de to, 10 og 20 kDa lineære PEG benyttes). R1 til RN: aminosyre sidekjeder. PG1 til PGN: sidekjedebeskyttende grupper. TFA: trifluoreddiksyre. TIPS: triisopropylsilane. Dodt: 3,6-dioksa-1 ,8-octanedithiol. H 2 O: vann.
Mikrobølgeassistert methacrylation metode er nylig blitt bearbeidet av vår gruppe til functionalize N-terminus av peptider med metakrylamid grupper (Figur 3B) for å lette peptid inkorporering i en rekke polymerer og polymere nettverk. I denne reaksjon, er det primære amin med N-terminus av peptid reagerer med karbonyl-atom på metakrylsyre-anhydrid for å danne et amid. Dette genererer metakrylamid funksjonalisert peptid, med metakrylsyre fremstilt som et sideprodukt. Ved bruk av denne fremgangsmåten for å functionalize N-enden av peptid-sekvenser, er det viktig at aminosyrer som inneholder reaktive sidekjeder (primære aminer (lysin), alkoholer (serin, treonin), og fenoler (tyrosin)) er beskyttet ved funksjonalisering, og beskyttende grupper er bare spaltes etter metakrylamid inkorporering.
Denne artikkelen vil vise begge disse mikave-baserte metoder for å syntetisere PEGDM og functionalize på harpiks peptidsekvenser, fremhever vanlige fallgruver og foreslå feilsøking metoder. I denne artikkelen vil metoder for å utføre analytiske kjemiske teknikker som vanligvis benyttes for å vurdere produktet funksjon være detaljert, og forslag og ressurser til å utføre mer avanserte modifikasjoner vil bli gitt. Typiske resultater vil bli demonstrert, som inkluderer bruk av det syntetiserte PEGDM å danne hydrogel nettverk, å utnytte de dannede hydrogeler for å kontrollere frigjøring av en modell medikament, og anvendelse av funksjonalis peptider for å lette celle-hydrogel interaksjoner. Spesiell oppmerksomhet vil bli utbetalt til karakter hydrogel maskevidde og diskutere hvordan hydrogelmaterialet kan være innstilt til å påvirke denne underliggende fysiske eiendom, som i sin tur styrer bulk materialegenskaper som stivhet og narkotika frigjøringsprofil.
Metodene som tidligere illustrert er uvurderlig for syntesen av PEGDM og metakrylamid funksjonalisering av peptider eller andre amin-holdige forbindelser. Disse materialene kan deretter brukes for regenerativ medisin og for levering av legemidler anvendelser. På grunn av den hydrofile karakter av PEG, hydrogeler dannet fra PEG makromerer har et høyt vanninnhold som ligner på mange vev i legemet 2. Denne kvalitet gjør PEG meget motstandsdyktig mot protein adsorpsjon og derfor inert i legemet 3.. Imidlertid kan den hygroskopiske karakter av PEG vise seg problematisk i løpet av funksjonalisering. Hvis vann er tilstede i PEG prøven under methacrylation prosedyren, vil metakryl-syreanhydrid reagere preferensielt med vann for fremstilling av metakrylsyre og dårlig funksjonalisering av PEG vil resultere.
Derfor er en av de viktigste tiltak som kan iverksettes for å sikre en vellykket methacrylation av PEG eller peptid å opprettholde anhydRous reaksjonsforhold. Den anbefalte trinnet med å tørke alt glassutstyr før bruk er ment å hindre vannforurensning. Tilstedeværelsen av vann i prøven kan sees i NMR-analyse, som en bred topp ved 1,7 ppm (figur 4). Dersom dårlig methacrylation observeres selv etter tørking alt glassutstyr, kan kjemikalier tørkes over natriumsulfat, eller andre tørkemidler (molekylsikter etc.) før bruk. Destillasjon kan også brukes for å fjerne vann og rense metakrylsyre-anhydrid før bruk, og azeotrop destillasjon kan brukes til å tørk PEG 23. I ekstreme tilfeller kan syntesen utføres i en hanskerommet for ytterligere å sikre tilstrekkelig vannfrie betingelser. En andre runde med methacrylation ved å følge samme prosedyre, kan også utføres for å øke funksjonalisering. Fordi det er alltid en mulighet for at flere runder med funksjon vil være nødvendig, bør man være forsiktig i trinn 1,7 og 1,9 til raskt å samle PEGDM ved vakuumfiltrering. Vakuum-filtrering for lenger enn det som er absolutt nødvendig øker eksponeringen av PEG til luft, noe som øker muligheten for vannadsorpsjon.
Selv om den prosentvise overskudd av metakryl-syreanhydrid til hydroksyl funksjonelle grupper forblir uendret, noe som øker PEG funksjonalisering (f.eks arm #) i PEG-forløperen er vanligvis forbundet med en nedgang i prosent funksjonalisering oppnås (upubliserte resultater, Benoit lab). For å løse dette preemptively reduksjon av funksjonalise effektivitet, eller hvis spesielle vanskeligheter påtreffes oppnå tilstrekkelig høyt funksjonalisering, varigheten av mikrobølge reaksjonen kan økes, forutsatt at mikrobølgeintervall holdes ved 30 sek. Mens 10 molart overskudd er vanligvis tilstrekkelig, kan mengden av metakrylsyre-anhydrid anvendes i reaksjonen også økes for å øke den prosentvise funksjonalise oppnådde 12.
Det er viktig at denytterligere utfellingstrinn (1,9) bli utført for å oppnå gode NMR-signaler. Selv om det er fristende å utføre den andre ventet samme dag som syntese, tørking av prøven natten over før reprecipitating er funnet å hjelpe til med fjerning av overskudd av metakrylsyre og metakrylsyre-anhydrid. Prøveopparbeidelse er også viktig for å oppnå ren NMR spektra, og derfor prøver bør være forberedt på å bruke anbefalte forhold. Figur 4 viser representative 1 H-NMR resultatene for korrekt funksjon PEGDM. Ved å analysere forholdet mellom terminale metakrylat protoner til sentrale PEG protoner, ble PEGDM bestemt til å være tilstrekkelig funksjonalisert. MALDI prøveopparbeidelse er tilsvarende viktig for å oppnå et klart lesing. MALDI er spesielt følsomt for tilstedeværelsen av salter og høy prøvekonsentrasjoner. Dersom en klar MALDI teller (en intensitet over 50 vilkårlige enheter (AU) med et høyt signal: støy-forhold) ikke kan oppnås, prøven solution bør fortynnes 1:100 i MALDI løsemiddel før de blir kombinert med matrisen løsning og analyseres på nytt. Figur 5 viser representative MALDI-TOF resultater etter riktig peptid funksjon, cleavage, og prøveopparbeidelse. Spalting av en liten prøve av harpiks før funksjonalisering (figur 5A) viser korrekt syntese av peptidet GKRGDSG, med korrekt metakrylamid funksjonalisering av peptidet er vist i figur 5B.
Mens funksjonalisering av for-harpiks peptider er en relativt robust fremgangsmåte, spaltings-betingelsene som kreves for hver sekvens krever ofte justering. For lange sekvenser hvor mange aminosyrer har beskyttede sidekjeder (> 30 aminosyrer lange, eller> 15 aminosyrer med beskyttelsesgrupper), bør varigheten av spalting økes med en time. Imidlertid, hvis spalting tiden forlenges for mye, kan peptidbinding spalting føre på grunn av langvarig eksponering surt. MALDI ana lyse kan være svært nyttig i å avsløre eventuelle feil som oppstod i peptidsynteser eller spalting. En observert reduksjon under forventede molekylvekter kan indikere at aminosyre (r) ikke skikkelig par, eller at peptidet fraksjonering inntraff (se tabell 2 for kilder som vanligvis opptrer endringer i molekylvekt). Hvis den observerte molekylvekt er høyere enn forventet av vekten av en beskyttende gruppe som brukes, er det sannsynlig at spalting og avbeskyttelse var utilstrekkelig og peptidet bør recleaved for ekstra tid.
Amino Acid Sletting | MW endring (g / mol) | Uncleaved beskyttelsesgrupper | x "> MW endring (g / mol)Vanligvis Present Ioner | MW endring (g / mol) | |
Ala | -71 | Acetyl | 42 | Cl – | 35 |
Arg | -158 | Allyl | 40 | K + | 39 |
Asn | -114 | Alloc | 85 | Mg 2 + | <td style = "width: 64px;"> 24|
Asp | -115 | Boc | 100 | Na + | 23 |
Cys | -103 | Fmoc | 223 | ||
GLN | -128 | OtBu | 56 | ||
Glu | -129 | Pbf | 252 | ||
Gly | -57 | tBu | 56 | ||
Hans | -137 | TRT | 242 | ||
Ile | -113 | ||||
Leu | DTH: 64px; "> -113|||||
Lys | -128 | ||||
Møtte | -131 | ||||
Phe | -147 | ||||
-97 | |||||
Ser | -87 | ||||
Thr | -101 | ||||
Trp | -186 | ||||
-147 | |||||
Val | -99 |
Tabell 2. Vanligvis observeres endringer i peptid molekylvekt.
Makromerer som produseres ved hjelp av mikrobølge-assistert methacrylation metoder kan anvendes i en rekke regenerativ medisin-eller medikamentavleverings anvendelser. Functionalized peptider og PEGDM syntetiserte her kan også bli innlemmet i polymerer som bruker Nitroxide-mediert Polymerisering (NMP), Atom Transfer radikalpolymerisasjon (ATRP) eller Vendbar Addisjon-Fragmentering Transfer (RAFT) metoder 24. Hydrogel-nett kan også fremstilles i nærvær av celler, som tidligere vist i Jove artikkel av Khetan og Burdick 22.. Dette krever ofte inkorporering av cellen vedheft peptider som RGD-eller ekstracellulære matriks-molekyler, da PEG alene ikke gir celle-materiale interaksjoner kritiske for overlevelse og funksjon av noen celletyper 25. Peptides, for eksempel, kan syntetiseres ved hjelp av tradisjonell fast-fase peptidsyntese, og funksjonalisert som beskrevet her for å muliggjøre inkorporering i hydrogel-nettverk. Som vist i figur 6, inkludering av metakrylamid-funksjonalisert celleadhesjon peptid GK RGDS G i hydrogeler (0,5 mM) muliggjør adhesjon av humane mesenchymale stamceller (MSCS) til PEG hydrogel flater, øker antallet festet og spre-celler (figur 6B ), sammenlignet med PEG hydrogeler uten celle adhesjon peptid ( <strong> Figur 6A). Imidlertid har tidligere arbeider vist at celle-interaksjoner materiale blir ytterligere forbedret ved å inkludere 3400 Da PEG avstandsstykker mellom klebe peptider og hydrogel-nett, for å redusere peptid-inte sterisk hindring. Uten inkludering av avstandsstykket, kan cellene kommuniserer med PEG hydrogeler via ikke-spesifikke proteiner som adsorberer til det peptidet, i stedet for gjennom integrin-medierte interaksjoner med 26 peptider. For å inkorporere PEG spacer og unngå ikke-spesifikke interaksjoner, kan peptidene være konjugert til PEG monofunctionalized via N-hydroksysuccinimidylester aktiverte estere, som beskrevet av Hern og Hubbell 26..
Anvendelser av hydrogel nettverk krever streng kontroll over materialegenskaper. En vesentlig fordel med PEG hydrogeler er en høy grad av kontroll over disse egenskaper. For eksempel er molekylvekten, arm-nummer, og vekt-% av PEG benyttet i dannelsen av hydrogel-nett kan endres for å fin-tune egenskaper for spesifikke applikasjoner. Dette gjør det mulig streng kontroll over hydrogel maskevidde (ξ), som styrer hydrogel svellende forholdet (Q) og stivhet (elastisitetsmodul, E). Dette er illustrert i figur 7A og kvantifisert i figur 8, hvor økende PEG makromer molekylvekt resulterer i en økning i hydrogel maskevidde (figur 8A) og en reduksjon i hydrogel stivhet (figur 8B).
Den underliggende fysiske kjennetegn som styrer bulk atferd i disse hydrogel nettverk, maskevidde, beregnes ved hjelp av Flory-Rehner ligning 16. For å utføre denne beregningen, er den volumetriske hevelse ratio (Q) først beregnes fra ligning 4:
(4)
hvor ρ s er tettheten av vann (1 g / ml), er ρ p tettheten av PEG (1,12 g / ml), i M s hoven massen av hydrogel og M D er tørrvekt av hydrogel (ofte målt etter frysing og lyofilisering av hydrogeler). Den molekylvekt mellom tverrbindinger (M c, i g / mol) blir så beregnet fra ligning 5:
(5)
hvor M N er antall-gjennomsnittlig MV på PEG (i g / mol), er den spesifikke volum av polymeren , Er V 1 det molare volum av vann (18 ml / mol), V 2 er likevekts polymer volumfraksjon av hydrogel
( ), Og X 1 </sub> er den polymer-oppløsningsmiddel interaksjonsparameter for PEG og vann (0,426) 16. Antallet bindinger mellom tverrbindinger (n) blir så beregnet fra ligning 6:
(6)
hvor N b er antall bånd i PEG repeat (3) og M r er MW av PEG repeat (44 g / mol) 27. Dette gjør at rot-middel-kvadrat-ende-til-ende avstand av polymerkjeden (I nm) som skal beregnes fra ligning 7:
(7)
hvor l er den gjennomsnittlige forankringslengde (0.146 nm, beregnet på grunnlag av CC og CO bindingen lengder) og C-n er den karakteristiske forholdet for polymer (4.0 for PEG) 28. Finalt, maskevidde av hydrogel kan beregnes fra ligning 8:
(8)
Hydrogel egenskaper kan likeledes innstilles ved å regulere mengden av PEG anvendes i dannelsen av hydrogeler. Reduksjon av vektprosentandelen av PEG makromer resulterer i en økning i hydrogel mesh størrelse, som deretter reduserer hydrogel stivhet. Figur 7B illustrerer og Figur 9 kvantifiserer hvor vektprosenten av PEG anvendes i hydrogel dannelse kan anvendes for å kontrollere maskestørrelse (figur 9A) og resulterende hydrogel stivhet (figur 9B). Som substrat stivhet har vist seg å påvirke celle-adferd som stamcelledifferensiering 29, er evnen til å tett kontroll stivhet en viktig egenskap i hydrogel fabrikasjon.
Hydrogeler kan også brukes til å kontrol levering av legemidler. Som illustrert i figur 7A, og vist i figur 10, øker molekylvekten av PEG makromerer, øker maskevidden av hydrogel-nettverk, deretter økende frigjøring av innkapslet legemiddel modell, bovint serumalbumin (BSA). Mens hydrogel prøver i denne studien ble ødelagt ved t = 195 timer for å tillate måling av hydrogel våte og tørre masser for beregninger maskevidde, er det vår erfaring at fortsatt BSA utgivelsen ville skje hadde prøvene blitt inkubert for lengre tidsperioder. Den ufullstendig frigjøring av BSA observert i figur 10 er ikke uventet, da andre grupper har også rapportert at BSA er motstandsdyktig mot diffusjon innenfor PEG hydrogel-nettverk 30. Ufullstendig frigjøring av innkapslede protein kan oppstå på grunn av hydrogenbinding mellom proteiner og PEG makromerer eller kovalent binding mellom det metakrylat-gruppen i PEG og primære amingrupper på lysinrester i BSA 31 </sopp>. I tillegg er BSA tilbøyelige til aggregering og disulfidbinding dannelse over tid, noe som kan øke sin effektive Stokes radius og hindrer dens frigjøring fra hydrogeler. Som kjede-vekst-hydrogeler, for eksempel slike PEGDM hydrogeler, er tilbøyelige til nettverks nonidealities og heterogen hydrogel maskevidde (figur 2A), er det også mulig at en brøkdel av den innkapslede BSA er inneholdt i områdene av hydrogel som har betydelig mindre maske størrelse enn gjennomsnittet i gel, hindre utgivelsen. Selv om ufullstendig, nonFickian frigjøring (data ikke vist) av innkapslet BSA ble observert i dette tilfelle styrt Fickian frigjøring av en rekke andre modell legemidler, inkludert insulin og ovalbumin, har blitt demonstrert ved hjelp av tilsvarende PEGDM hydrogeler 30.. I tillegg, Watkins og Anseth har brukt konfokal laser scanning mikroskopi for å demonstrere at utgivelsen av fluorescerende molekyler fra lignende hydrogel er modellert velbehag, med Fickian diffusjon megdikk 32.
Mens de hydrogeler som dannes i denne studien er degraderbare, er nettverket nedbrytning annen parameter som kan bli innlemmet i og innstilt i disse nettene. Gir for kontrollert hydrogel nedbrytning kan resultere i forandringer i celle adferd 33, promotering av vev vekst eller verts innvekst av vev, eller eliminering av behovet for explantation 34.. Nedbrytbar PEG hydrogeler er vanligvis syntetisert ved ring-åpning hydrolytisk nedbrytbart d, l-laktid, glykolid, eller ε-kaprolakton grupper på hydroksyl-grupper i PEG før methacrylation 35.. Disse tre grupper nedbrytes ved hydrolyse av ester-funksjonalitet, med glykolid estere som har den største følsomhet overfor nedbrytning, etterfulgt av laktid, kaprolakton og ester, på grunn av deres varierende hydrofobisitet. Etter inkorporering av hydrolytisk nedbrytbart grupper kan være ytterligere funksjonalisert PEG ved hjelp av fremgangsmåten methacrylation detailed i denne artikkelen, slik at dannelsen av hydrogel nettverk gjennom påfølgende radikal-initierte kjeden polymerisasjon 36,37. Graden av nedbrytning av hydrogel-nett kan kontrolleres ved å variere identiteten til hydrolytisk nedbrytbart gruppen (glykolid, laktid, etc.) og ved å variere antallet nedbrytbare gjentar inkorporert i strukturen 35,38.
Teoretisk sett kan metodene vist her, brukes ved acrylation av PEG og peptider ved å erstatte metakryl-syreanhydrid med akrylsyreanhydrid i trinn 1.3 og 3.3, respektivt. Imidlertid er akrylsyreanhydrid mer enn 20 ganger kostnaden for metakrylsyreanhydrid 39,40, noe som gjør mikrobølgeovn-assistert acrylation betydelig mindre attraktive enn mikrobølgeovn-assistert methacrylation.
Vi har vist en enkel, rask metode for å functionalize PEG og peptider, hvordan å vurdere effektiviteten av denne prosedyren, og gitt ressurser for usynger de syntetiserte materialer for å danne hydrogel nettverk. Disse syntetiske verktøyene er svært allsidig i sine søknader, og skulle vise et fast innslag i en rekke levering av legemidler og materialer forskningslaboratorier.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert delvis av en Howard Hughes Med-inn-Grad fellesskap (AVH), ved oppstart midler gitt til Dr. Danielle Benoit fra University of Rochester og ortopedisk forskning og utdanning Foundation / Muskel Transplant Foundation (oref / MTF). Forfatterne ønsker å takke dr. James L. McGrath for bruk av utstyret sitt.
3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol | Tokyo Chemical Industry Co, LTD | D2649 | CAS 14970-87-7 |
Acetonitrile | J.T. Baker | UN1648 | CAS 75-05-8 |
Amino Acids | AAPPTech | Glycine: AFG101 | CAS 29022-11-5 |
Arginine: AFR105 | CAS 154445-77-9 | ||
Asparagine: AFD105 | CAS 71989-14-5 | ||
Serine: AFS105 | CAS 71989-33-8 | ||
Anhydrous diethyl ether | Fisher Scientific | UN1155 | CAS 60-29-7 |
Citric acid | Sigma Aldrich | C1857 | CAS 77-92-9 |
Deuterated chloroform | Cambridge Isotope Laboratories Inc. | DLM-7-100 | CAS 865-49-6 |
Dichloromethane | Fisher Scientific | UN1593 | CAS 75-09-2 |
Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A1181 | CAS 7087-68-5 |
Dimethylformamide | Fisher Scientific | D119-4 | CAS 68-12-2 |
Fmoc-Gly-Wang resin | Peptides International | RGF-1301-PI | 100-200 mesh size |
Methacrylic anhydride | Alfa Aesar | L14357 | CAS 760-93-0 |
N-Methylpyrrolidone | VWR | BDH1141-4LG | CAS 872-80-4 |
On-resin peptides | Synthesized in-house | On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc. | |
O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate | AnaSpec Inc | 510/791-9560 | CAS 94790-37-1 |
Peptide Calibration Standard | Care | 206195 | |
Piperazine | Alfa Aesar | A15019 | CAS 11-85-0 |
Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear | Alfa Aesar | B22181 | CAS 25322-68-3 |
Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear | Alfa Aesar | B21955 | |
Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear | Sigma Aldrich | 81300 | JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG |
Thioanisole | Alfa Aesar | L5464 | CAS 100-68-5 |
Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | CAS 76-05-1 |
Triisopropylsilane | Alfa Aesar | L09585 | CAS 6485-79-6 |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Tokyo Chemical Industry Co, LTD | C1768 | CAS 28166-41-8 |