여기서 우리는 subventricular 영역과 개인 성인 쥐의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서, 부착 단층 또는 neurosphere를 하나로서, 신경 전구 세포 배양의 동시 발생에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.
neurosphere 분석 및 접착 단층 배양 시스템은 생체 전위의 성인 신경 줄기 세포 (증식 또는 분화)을 결정하는 유용한 도구이다. 이러한 분석법은 신경 전구 세포의 증식과 분화에 외인성 요인의 효과를 결정하기 위하여 연속적인 통로를 통해 정량 할 수있는 신경 전구 세포주를 생성하기 위해 유 전적으로 다른 또는 차동으로 처리 된 동물에서 분리 된 세포의 전구체 전위와 비교하는데 사용될 수있다. neurosphere 분석은 전통적으로 주로 그들은 일차 조직으로부터 분리하여 뇌 조직에서 전구체 세포 수의 빠른 추정을주는 중요한 이점을 갖는다 될 수있는 최종적인 마커의 부족으로, 줄기 세포의 사후 식별에 사용된다 각각의 동물에서 유래. 자기편 단층 배양 대조적 전통적 동물 개체 간의 확산을 비교하는 데 사용되지 않는다각각의 문화는 일반적으로 5-8 사이 동물의 결합 조직에서 시작으로. 그러나, 그들은, neurosphere를 달리 그들이 전구체 세포의 대부분 균질 집단으로 구성 및 단일 세포 분화 과정을 다음에 유용한 큰 장점이있다. 여기서는, 처음으로, 개별 동물로부터 접착 배양을, 상세히, neurosphere 문화의 생성을 설명하고. 이 subventricular 영역 (SVZ) 및 처리 또는 유 전적으로 다른 마우스 라인의 치아 이랑 (dentate gyrus) (DG) 모두에서 증식 및 / 또는 분화 가능성의 짝을 분석뿐만 아니라 동물의 사용에 상당한 감소를 포함하여 많은 중요한 의미가 있습니다.
neurosphere 분석 1,2 자기편 단일 층 문화 3,4, 모두가 1990 년대 초에 개발은 여전히 체외 신경 줄기 세포 분석의 황금 표준 남아있다. 이러한 분석에서, 일차 조직이 특정 뇌 영역에서 마이크로 해부, 부동성 어느 인자 -2 (FGF2)가 형성하는 단일 세포 현탁액과 분열 촉진 물질의 표피 성장 인자 (EGF) 및 섬유 아세포 성장의 존재 하에서 배양으로 해리 클러스터 (neurosphere를) 또는 부착 단층. 두 시스템은 장점과 단점 및 심사숙고의 수는 하나 또는 다른 시스템을 선택하기 전에 해결되어야하는 문제에 관련되어야한다.
을 neurospheres은 전구 세포의 수와 가능성의 차이 간단 판독 할 수 있습니다. 또한, neurosphere를 또한 정상적인 외부 환경에서 제거 할 때 셀의 고유 사양을 연구 할 수있는 유용한 도구입니다. ExtrinSIC 큐 단순히 성장 배지의 관심 요소를 첨가하고 생성을 neurospheres의 개수와 크기를 정량화하여 연구 될 수있다. 을 neurospheres의 주요 결점은 있지만, 그들은면 (5)에 비해 더 분화되고 neurosphere를 (특히 대형을 neurospheres)의 중앙에 세포와 자신의 틈새를 형성한다는 것이다. neurosphere를 줄기 세포, 전구 세포 투입하고 분화 된 세포와 neurosphere를 내의 세포 – 세포 상호 작용을 줄기 세포의 유지를 방해의 혼합을 포함한다. neurosphere를 해당 줄기 세포 6-8 단지 소수를 포함하는 이유이다.
자기편 단일 층 문화는 또한 생체 내 증식 모델에 좋은 생체 외 시스템을 제공한다. 세포가 더 고립되고 균일 남아있는 자기편 문화, neurosphere의 이질성을 제거 할 수 있습니다. 이러한 성장 조건에서 전구체 세포를 증식 RAPIDLY 거의 모든 세포는 분열과 특성 신경 전구 마커 네 스틴, SOX2, 그리고 BLBP을 표현하고 있습니다. neurosphere 분석에 비해 단층 배양 시스템의 주요 단점은 각각의 전구체에서 파생 된 클론을 모니터링하고 정량화 할 수없는 것입니다.
분리 전략의 수율은 종종 빈약 되었기 때문에 배양 두 유형에도 프로토콜의 단점은, 동물의 상대적으로 많은 수의 사용 필요성왔다. 동시에, 그것은 성인 신경뿐만 아니라 개별적인 생체 외 모델에 대한 필요성의 결과 뇌 9의 개별화에 기여하는 것이 명백 해졌다. 이 보고서에 설명 된대로 이러한 요구는 "한 – 마우스 – 하나의 문화"프로토콜에 의해 충족 될 수있다.
다음 Visual 프로토콜은 SVZ과 DG 개별 동물 중 하나를 부착 한 m에서 모두 신경 전구체 문화의 동시 발생을 설명합니다onolayers 또는 neurosphere를 등. 개별 동물의 문화의 생성은 개별적으로 처리 된 동물 또는 다양한 개별 유전자 변형 또는 야생형 생쥐 사이의 비교가 필요한 경우에 특히 유용합니다. 이 프로토콜은 자세한 어른 생쥐에서 SVZ과 DG 지역의 동시 미세 절제에 대한 지침, 단일 세포 현탁액에 자신의 분리, 부착 단층 문화 또는 neurosphere를하고 multipotentiality 장기 잠재력 분석 중 하나로 체외 문화, 두 추기경을 포함 뼈 성실한 줄기 세포의 특성.
이 논문은 성인 쥐 뇌의 두 가지 주요 신경성 지역에서 신경 전구 문화, 부착 한 단층과 neurosphere를 모두의 개시에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 체외 배양 시스템 중 하나를 시도 할 때 염두에 보관해야합니다 중요한 점은 여러 가지가있을 수 있습니다. 첫째, 분리 방법의 선택은 매우 중요하고 조직 의존적이다. 우리 손에, 0.05 % 트립신-EDTA는 SVZ 조직의 분해에 매우 효과적이며, 파파인 해리 기반 기술을 사용하는 경우보다 neurosphere를 높은 수의 결과. DG 조직의 분리를 위해, 그러나, 우리는 강하게 파파 기반의 분리 방법을 추천합니다. 직접 DG 조직에있는 두 개의 분리 방법을 비교했을 때, 우리는 가능한 세포의 상당히 낮은 수율을 관찰 트립신을 사용하는 경우 약 적은을 neurospheres 10 배. 해리의 차이는 조직 compositio의 차이로 인해 수두 지역 사이의 N. DG의 소형 조직은 광범위한 neuropil에 둘러싸여 세포 과정의 광범위한 손상을 분리하는 동안 발생할 수 있습니다.
주목해야 할 두번째 중요한 점 neurosphere 분석은 주어진 조직 샘플에 존재하는 전구 세포의 수에 대한 정량적 인 설명은 할 유용 할 수 있지만, 약간의주의는, 그러나, 이들의 절대 수치 해석에 사용되어야한다는 것이다. 을 neurospheres의 융합은 중요한 교란 요인이 될 수 있습니다. 몇몇 연구는 신경이 매우 운동성, 심지어 가정으로 '클론'조건 7,19 무엇인지에 따라, 융합 할 수있는 것으로 나타났습니다. 얻어진 neurosphere 주파수는 매체 컴포넌트, 해부 절차와 해리 과정 포함한 요소에 매우 의존 할 수있다. 심지어 경험이 풍부한 핸들러 사이에 가정으로 동일 시료에서 생성 neurosphere를 수있는 몇 가지 변화는 (그림 1A에게 볼 분명하다.) 더 유용하게, 주어진 두 개의 샘플 (즉, 제어 대 치료 또는 야생형 대 녹아웃)가 아니라 전체의 양적 문보다, 하나의 실험에서 동일한 사람에 의해 처리 사이의 전구체 주파수의 직접적인 비교입니다 전구 세포의 수.
그것은 두 배양 시스템이 생성 세포 유형의 균질성에서 다르다는 것을주의하는 것이 중요하다 특정 실험에도 적합이 배양 방법 중 어느 결정할 때. 매우 균일 한 전구 세포 풀 (~ 세포의 98 %가 SOX2 +이다)를 보여 자기편 세포 배양, 증식에 비해 20 neurosphere를 더 이질적 및 포함,뿐만 아니라 증식 전구 세포, 분화 된 신경 세포와 성상 세포 (21, 22). 그것은 neurosphere를 더 큰 같은 구절 사이의 장기간 배양하지 않는 것이 중요합니다 그것이 자신의 핵심에있는 분화 된 세포 유형을 찾을 확률이 더 높다가 neurosphere.
우리는 전통적으로 5-8 사이의 마우스의 DG 조직에서 자기편 단일 층 신경 전구 문화를 시작합니다. 단일 마우스 DG 또는 SVZ에서 점착성 단층 배양을 확립하려고 시도하는 따라서 정성은 조직 triturating 위에 기인 과도한 세포 죽음을 피하기 위해 조직 해리 과정 중에주의 할 필요 또는 확장 복용 해부 및 최종 배양 단계 사이의 시간의 기간. 이 프로토콜은, 처음으로, 설명의 개별 동물의 SVZ와 DG 모두로부터 점착성 단층 배양 전구체의 생성. 전구체의 증식 및 분화의 비교는 하나의 동물에 기초 할 필요가있는 경우 많은 경우가있다. 이들은 직접 DG 페어링 된 통계를 사용하여 개별 동물의 SVZ을 비교하는 개별 행동 또는 생리 학적 데이터 9와 문화의 데이터를 쌍으로 할 수있는 기능을 포함합니다. 단일 동물 문화도 알유전자 협회의 연구에 대한 연령과 일치하는 문화 당 5-8 기증자의 풀 수없는 희귀 형질 전환 동물뿐만 아니라 독특한 동물 (예 : F2 십자가 또는 축소 사육 동물)의 낮은 사용.
The authors have nothing to disclose.
TLW는 마리 퀴리 국제 들어오는 원정대에 의해 지원되었다. 이 작품은 또한 기본적인 제도적 기금에서 조달하고, Bundesministerium은 Bildung와 Forschung (BMBF)의 자금과 일부 GK에 우선 순위 연구 프로그램 (SFB) 655의 지원을 모피. 저자는 배려와 모든 연구에 사용 된 동물과 오데트 라이터, Susann Ruhwald, 패니 BOEHME, 세포 배양과 현미경의 도움 리처드 웨츨의 유지 보수를 위해 앤 Karasinsky에게 감사의 말씀을 전합니다.
CONSUMABLES | |||
poly-D-lysine | Sigma | P7280-5MG | |
laminin | Roche | 11243217001 | |
glass pastuer pipettes | Volac | BS5732 | |
DMEM:F12 (1:1) 1X | Life Technologies | 21331-020 | |
Neural Basal Medium (1X) | Life Technologies | 21103-049 | |
B27 supplements (50X) | Life Technologies | 17504-044 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050-038 | |
Heparain | Sigma | H3393 | |
Penacillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
bFGF | PeproTech | 100-18B | |
0.05% trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
DNaseI | Roche | 10104159001 | |
Accutase | PAA | L11-007 | |
Papain | Worthington | LS003120 | |
Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
HBSS (with Calcium & Magnesium) | Life Technologies | 14025-050 | |
Glucose | Roth | X997.2 | |
HEPES | Sigma | H3375-500G | |
NaHCO3 | Merck | K39347429847 | |
1mL syringes | Braun | 2016-10 | |
27 Gauge needles | Braun | 4657705 | |
scalpels (#22 disposable) | Braun | BA222 | |
Dumont #7 forceps | FST | 11271-30 | |
Dumont 5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
scissors | FST | 14060-10 | |
Iris spatula | FST | 10093-13 | |
70% ethanol | |||
PBS | Life Technologies | 14040-091 | |
flasks/well plates | TPP | 92696 | |
PFA (4%) | Sigma | P6148 | |
hemocytometer | Marienfeld | 650010 | |
trypan blue (0.4%) | Sigma | T8154 | |
NDS | Millipore | 530 | |
TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
mouse monoclonal bIII-tubulin antibody | Promega | G712A | |
rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody | Dako | 20334 | |
O4 | R & D systems | MAB1326 | |
Map2a+b | Sigma | M1406 | |
donkey anti-mouse Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-505-151 | |
donkey anti-rabbit Alexa488 | Dianova | 711-545-152 | |
4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | 861405 | |
Aqua Polymount | Polysciences Inc | 18606 | |
10 ml Combi tips | eppendorf | 30089677 | |
plastic 10ml and 25mL serological pipettes | Corning | 4488/4489 | |
EQUIPMENT | |||
Pipetboy | Integra biosciences | 521942 | |
multidoser pipette | eppendorf | ||
37C waterbath | |||
dissecting microscope | |||
37C:5%Co2 incubator | |||
centrifuge | eppendorf | 5810R |