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Neuroscience

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

doi: 10.3791/51225 Published: February 25, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a produção simultânea de culturas de células precursoras neurais, quer como monocamadas aderentes ou neuroesferas, a partir da zona subventricular e giro dentado de ratinhos adultos individuais.

Abstract

O ensaio neuroesfera e do sistema de cultura em monocamada aderente são ferramentas valiosas para determinar o potencial de (a proliferação ou a diferenciação) de células estaminais neuronais adultas in vitro. Estes ensaios podem ser utilizados para comparar o potencial precursor de células isoladas a partir de animais geneticamente diferentes ou tratados diferencialmente para determinar os efeitos de factores exógenos sobre a proliferação e diferenciação de células precursoras neurais e para gerar linhas de células precursoras neuronais que podem ser testadas durante passagens contínuas. O ensaio neuroesfera é tradicionalmente usado para a identificação de post-hoc de células estaminais, principalmente devido à ausência de marcadores definitivos com a qual eles podem ser isolados a partir de tecido primário e tem a grande vantagem de fornecer uma estimativa rápida de números de células de precursor no tecido cerebral derivados de animais individuais. Culturas de monocamadas aderentes, em contraste, não são tradicionalmente utilizadas para comparar a proliferação entre animais individuais, Como cada cultura é geralmente iniciada a partir do tecido combinado de entre 5-8 animais. No entanto, têm a grande vantagem de que, ao contrário de neuroesferas, que consiste de uma população homogénea principalmente de células precursoras e são úteis para seguir o processo de diferenciação em células individuais. Aqui, nós descrevemos, em detalhe, a geração de culturas de neuroesferas e, pela primeira vez, culturas aderentes de animais individuais. Isto tem muitas consequências importantes, incluindo a análise emparelhada da proliferação e / ou diferenciação potencial, tanto na zona subventricular (SVZ) e giro dentado (DG) de linhas de ratinhos tratados ou geneticamente diferentes, bem como uma redução significativa no uso de animais.

Introduction

O ensaio neurosphere 1,2 ea cultura em monocamada aderente 3,4, ambos desenvolvidos no início de 1990, continuam sendo o padrão ouro em ensaios de células-tronco neurais in vitro. Nestes ensaios, o tecido primário é micro dissecados a partir de uma região particular do cérebro, dissociadas numa suspensão de células isoladas e cultivadas na presença do factor de mitogénios crescimento epidérmico (EGF) e factor de crescimento de fibroblastos-2 (FGF2) para formar ou flutuante clusters (neuroesferas) ou monocamadas aderentes. Ambos os sistemas têm deve ser dada uma série de vantagens e desvantagens e uma consideração cuidadosa para a questão que deve ser abordada antes de um ou outro sistema é escolhido.

Neurospheres permitir que uma simples leitura de diferenças no número de células precursoras e potencial. Além disso, neuroesferas são também uma ferramenta útil para o estudo especificação intrínseca das células quando removidas do seu ambiente externo normal. Extrinpistas sic pode ser estudado pela simples adição do factor de interesse para o meio de crescimento e quantificação do número e tamanho das neuroesferas gerados. A principal desvantagem de neuroesferas no entanto, é que eles formam o seu próprio nicho, com as células no centro das neuroesferas (particularmente grandes neuroesferas) sendo mais diferenciadas do que as da superfície 5. As neuroesferas conter uma mistura de células estaminais, células progenitoras comprometidas, e de células diferenciadas e as interacções célula-célula dentro das neuroesferas neutralizam a manutenção das células estaminais. É por isso que neuroesferas conter apenas um pequeno número de células estaminais verdadeiros 6-8.

Culturas de monocamadas aderentes também proporcionar um bom sistema in vitro para o modelo de proliferação in vivo. Culturas aderentes, em que as células permanecem mais isolado e homogêneo, pode eliminar a natureza heterogênea do neurosphere. Sob essas condições de crescimento as células precursoras proliferam rapiDivina e quase todas as células se dividem e expressar as características marcadores precursoras neurais Nestin, Sox2 e BLBP. A desvantagem principal do sistema de cultura em monocamada em comparação com o ensaio de neuroesfera é que os clones derivados de precursores individuais são incapazes de ser monitorizada e quantificado.

Um inconveniente da maior parte dos protocolos para ambos os tipos de culturas tem sido a necessidade de usar um número relativamente grande de animais, porque o rendimento das estratégias de isolamento tem sido muitas vezes pobres. Ao mesmo tempo, tornou-se claro que a neurogénese adulta contribui para a individualização do cérebro 9, o que resulta na necessidade de individualizadas modelos ex vivo bem. Estas necessidades podem ser satisfeitas por protocolos "de um rato e um de cultura", conforme descrito neste relatório.

O seguinte protocolo visuais descreve a produção simultânea de culturas precursoras neurais tanto do SVZ e DG de animais individuais ou m como aderenteonolayers ou como neuroesferas. A geração de culturas de animais individuais é particularmente útil quando são necessárias comparações entre animais tratados individualmente ou vários transgênico indivíduo ou camundongos selvagens. Este protocolo inclui instruções detalhadas para a microdissecção simultânea das regiões SVZ e DG de camundongos adultos, a sua dissociação em uma suspensão única célula, o cultivo in vitro tanto como culturas em monocamada aderentes ou neurospheres e análise de multipotencialidade e potencial a longo prazo, os dois cardeal propriedades de uma célula-tronco fide óssea.

Protocol

1. Configuração básica e Preparação de Meio de Cultura

  1. Pelo menos, dois dias antes do início do ensaio, preparar poli-D-lisina (PDL) / laminina placas revestidas para culturas em monocamada aderente. Para preparar poços / frascos adicionar suficiente PDL (10 mg / ml em dH2O) para revestir a superfície e incuba-se durante a noite à temperatura ambiente. Remover a solução a partir da placa e lavar o prato três vezes com dH2O Deixe secar ao ar. Adicionar laminina (5 mg / ml em DMEM frio: F12) e incubar a 37 ° C durante a noite. Retirar a laminina e usar as placas imediatamente ou armazenar com a laminina, a -20 ° C até ser necessário.
  2. Prepare fogo pipetas polidas com "médio" e "pequenos" furos girando pipetas Pasteur de vidro em uma chama até que as bordas se tornam arredondadas. Autoclave para esterilizar.
  3. No dia da dissecção, preparar a quantidade adequada de meio de cultura através da mistura de Meio Basal Neural com 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg / ml de heparina, 50 unidades / mL de Penicilina / Estreptomicina, / factor de 20 ng ml purificada rato receptor grau de crescimento epidérmico (EGF), e 20 ng / factor de crescimento de fibroblastos bovino recombinante ml (FGF-2). Aquecer o meio de cultura a 37 ° C em um banho de água.
  4. Para a dissociação SVZ, preparar 0,05% de tripsina-EDTA e inibidores de 0,125 mg / ml de tripsina contendo 0,01 mg / ml de ADNasel. Equilibrar as soluções a 37 ° C.
  5. Configurar um microscópio de dissecação e preparar as ferramentas necessárias para remover o cérebro (tesoura e pequena espátula) e para ZSV e DG dissecções (bisturi, 27 G agulha acoplada a seringa de 1 ml, 1 x # 7 fórceps, 1 x # 5/45 fórceps) por imersão em etanol a 70%.

2. Colheita de cérebros adultos rato e SVZ / DG microdissecações

  1. Anestesiar adulto solteiro (8 semanas de idade) ratos de acordo com as diretrizes institucionais apropriados. Realizar deslocamento cervical.
  2. Pulveriza-se a cabeça com 70% de etanol para esterilizar a área e para minimizar a quantidade de pele que umdHères para as tesouras e cérebro. Usando uma tesoura afiada decapitar o animal na base do tronco cerebral.
  3. Segurando a cabeça na base do crânio, corte no crânio entre os dois bulbos olfatórios, colocando uma lâmina de um pequeno par de tesouras em cada cavidade ocular e corte coronal. Em seguida, fazer dois cortes laterais na base do crânio, seguido por um corte longitudinal através do crânio, ao longo da sutura sagital Cuidado:. Garantir o ângulo da tesoura é tão superficial quanto possível para evitar danos no cérebro subjacente.
  4. Exponha o cérebro por trás do crânio descascando ou com a lâmina da tesoura ou um par de fórceps curvos. Livre o cérebro do crânio utilizando uma pequena espátula e coloque em PBS frio.
  5. Lavar cérebros com PBS para remover sangue e pele.
  6. Transferir cérebros para um prato de Petri 10 centímetros de plástico contendo PBS
  7. Coloque placa de Petri contendo o cérebro sob um microscópio de dissecação em baixa ampliação e posicione o brain na sua superfície ventral. Usando pinças curvas finas remover os bulbos olfativos, mantendo o cérebro em posição pelo cerebelo.
  8. Girar o cérebro para o aspecto dorsal e, usando um bisturi fazer um corte coronal através do cérebro ao nível do quiasma
  9. Para microdissect o ZSV (para obter instruções mais detalhadas, consulte também Azari et al. 10), coloque a parte rostral do cérebro, de modo que a superfície coronal cortado virado para cima e foco do microscópio para uma maior ampliação. Remova e descarte o septo usando uma pinça curva finas.
  10. Dissecar a SVZ (a fina camada de tecido em torno do ventrículo) colocando a ponta de uma lâmina de uma par de pinças curvas finas no canto lateral do ventrículo lateral imediatamente sob o corpo caloso e outros cerca de 1 mm para dentro do tecido imediatamente adjacente ao ventrículo. Pressione para baixo a pinça em direção à base do prato e para a face ventral do Ventr.igo para remover uma pequena peça triangular de tecido. Coloque a SVZ dissecados numa caixa de Petri sobre gelo.
  11. Para microdissect o DG (para obter instruções mais detalhadas, consulte também Hagihara et al. 11), coloque a porção caudal do cérebro na placa de Petri e corte ao longo da fissura longitudinal usando um bisturi.
  12. Sob um microscópio de dissecção, remover o cerebelo e do diencéfalo utilizando fórceps.
  13. Reorientar o microscópio para que as bordas ao redor do DG são agora visíveis. Para remover o giro denteado, insira a ponta de uma agulha 27 G e deslizar ao longo da fronteira entre a DG e corno de Ammon. Usando fórceps finos, libertar o DG a partir do tecido circundante.

3. ZSV dissociação Tissue

  1. Picar o tecido usando uma lâmina de bisturi para cerca de 1 min até que não há grandes peças permanecem.
  2. Transferir o tecido moído para um tubo de 15 ml usando 1 ml de pré-aquecida de 0,05% de tripsina-EDTA e incubar durante 7 min, emum banho de água regulado para 37 ° C.
  3. Para interromper a reação enzimática, adicionar 1 ml de inibidor de tripsina contendo DNaseI e misturar o conteúdo sacudindo o tubo.
  4. Pellet da suspensão por centrifugação a 300 xg durante 5 minutos e descarta-se o sobrenadante
  5. Ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de crescimento e dissociar cuidado pipetando para cima e para baixo de aproximadamente 7-10x com uma pipeta P1000 Cuidado:. Sobre trituração pode levar ao aumento da morte celular e terá um impacto negativo no crescimento celular subseqüente.
  6. Adicionar meio de crescimento para um volume total de 5 ml e passar a suspensão de células através de uma peneira de 40 milímetros para remover detritos e aglomerados de tecido não dissociada.
  7. Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos, descarta-se o sobrenadante e ressuspender o sedimento resultante em 200 ml de meio de crescimento.

4. DG dissociação Tissue

  1. Picar o tecido usando uma lâmina de bisturi para cerca de 1 min até que não há grandes peças permanecem e transferênciaem pré-aquecido mistura de enzima papaína (DCP 2,5 U / mL, dispase 1 U / ml, a ADNasel de 250 U / ml). Incubar durante 20 min a 37 ° C, misturando por inversão do tubo a cada 3-5 minutos.
  2. Dissociar o tecido usando mecanicamente um furo médio, o fogo polido, Pasteur pipeta pipetando cima e para baixo suavemente 10x.
  3. Incubar durante mais 10 min a 37 ° C, misturando por inversão do tubo a cada 3-5 minutos.
  4. Além disso dissociar o tecido usando um pequeno furo mecanicamente, fogo polido Pasteur pipeta pipetando cima e para baixo suavemente 10x.
  5. Centrifugar a 130 xg durante 5 min.
  6. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de solução tampão (1x HBSS, glicose 30 mM, HEPES 2 mM (pH 7,4), 26 mM de NaHCO 3). Make up para 10 ml com solução tampão.
  7. Centrifugar a 130 xg durante 5 min.
  8. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de 20% de Percoll. (Para preparar 90% de Percoll, adicionar 4,5 ml de 100% de Percoll para 0,5 ml de PBS 10x, em seguida, dilua ainda mais esta a 20%por adição de 1,1 ml de 90% de Percoll com 3,9 ml de PBS 1x).
  9. Centrifugar 450 g durante 15 min.
  10. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de tampão.
  11. Centrifugar a 130 xg durante 5 min.
  12. Ressuspender o sedimento em 200 ul de meio de crescimento.

5. Geração de culturas aderentes em monocamada

  1. Placa SVZ dissociada ou DG tecido numa única PDL / laminina revestido poço de uma placa de 96 poços e incuba-se a 37 ° C com 5% de CO 2.
  2. Aproximadamente 24 horas após o plaqueamento, uma vez que as células tenham aderido à superfície revestida, trocar o meio de crescimento para remover o excesso de detritos adicional.
  3. A cada 3-4 dias subsequentes, a troca de metade do meio de crescimento com meio fresco para repor os factores de crescimento.
  4. Repita até as células atingirem aproximadamente 80% de confluência e está pronto para ser passado Nota:. Tempo entre revestimento e a primeira passagem podem levar até 2-3 semanas.
  1. Quando as culturas atingem cerca de 80% de confluência remover o meio do poço e lava-se com PBS.
    Nota: Não permitir que as células a ser superior a 90% da confluência como esta pode levar ao desprendimento de células e formação neuroesfera e, além disso, níveis aumentados de morte celular.
  2. Adicionar 50 ml de Accutase e incubar a 37 ° C durante 2-3 minutos (a verificação para ver se as células são arredondadas e isolada).
  3. Remover as células para um tubo de 15 ml e lava-se bem a uma vez com PBS e transferir para o mesmo tubo.
  4. Dilui-se as células para 5 ml com PBS e centrifugar 300 xg durante 5 min.
  5. Para a primeira passagem, diluir as células a 1 ml e a placa em uma PDL / laminina revestido poço de uma placa de 24 poços.
  6. Para passagens subsequentes, ressuspender as células em 200 ml de meio de crescimento e a contagem utilizando um hemocitómetro. Placa de 1 x 10 4 células / cm 2 no poço revestido com tamanho adequado ou balão. i>

7. Diferenciação de culturas aderentes monocamada

  1. Para diferenciar as culturas em monocamada, as células aderentes placa proliferar em PDL / Laminin lamelas revestidas a uma densidade de 1 x 10 4 células / cm2 em meio de crescimento contendo 20 ng / mL de EGF e 10 ng / ml de bFGF.
  2. Quando as células atingem cerca de 80% de confluência (normalmente 2 dias), substituir o meio de crescimento com meio contendo 5 ng / mL de bFGF e 0 ng / mL de EGF.
  3. Seguindo 2 dias em 5 ng / ml de bFGF, substituir o meio com meio de crescimento na ausência de ambos mitogénios por mais 3 dias Nota:. Durante este período de uma quantidade significativa de morte celular ocorre.
  4. Depois de um total de 5 dias, lavar as células diferenciadas com PBS para remover as células mortas, em seguida, fixar com 4% de paraformaldeído (PFA), durante 20 min à temperatura ambiente.
  5. Lavar novamente com PBS, para remover qualquer lamelas PFA e armazenar em poços em 1 ml de PBS a 4 ° C.
jove_title "> 8. Neurosphere Cultura e Quantificação

  1. Dilui-se a SVZ dissociada ou DG tecido de um animal, em 20 ml de meio de cultura e a placa 200 mL / cavidade em uma placa de 96 cavidades utilizando uma pipeta de 10 ml multidoser.
  2. Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 6-7 dias para as neuroesferas SVZ derivados e 10-12 dias para neuroesferas DG-derivados.
    Nota: o crescimento de mais do que estes tempos de incubação recomendadas irá resultar numa proliferação e vai levar a morte celular no centro dos neuroesferas e / ou, de fixação e de diferenciação espontânea.
  3. Contar e medir o diâmetro dos neurospheres usando um retícula ocular montado um microscópio de luz vertical

9. Passagem das neuroesferas

Após os neurospheres primários foram contadas e seu tamanho registrado que pode ser expandida ao longo de várias passagens, começando com um único neurosphere ou uma cultura em massa.

  1. Granel expansão cultura neurosphere
    1. Para passagem neuroesferas combinados como um volume de cultura, remover o meio contendo as neuroesferas da placa, transferir para um tubo de 15 ml e centrifugar a 300 xg durante 5 min.
    2. Descartar o sobrenadante e ressuspender as neuroesferas em 1 ml de pré-aquecida de 0,05% de tripsina-EDTA e incubar à temperatura ambiente durante 3 min.
    3. Adicionar um volume igual de inibidor de tripsina contendo ADNasel e misturar bem.
    4. Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg, remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio de crescimento.
    5. Triturar cima e para baixo cerca de 10x com uma pipeta P1000 dissociar as neurospheres.
    6. Retirar 10 mL da suspensão de células e mistura com um volume igual de azul de tripano e realizar uma contagem de células vivas utilizando um hemocitómetro.
    7. Reseed as células a uma densidade de 1 x 10 4 células / cm 2 na cultura de células de tamanho adequado bem ou frasco.
    8. Incubar a 37 ° Ccom 5% de CO2 até se formarem neuroesferas secundárias.
  2. Expansão neurosphere Único
    1. Para passagem de neuroesferas individuais escolher poços que contêm um único neuroesfera e cuidadosamente remover e descartar cerca de 160 ul de meio de crescimento de cada cavidade sem perturbar o neuroesfera.
    2. Adicionar 100 ml de 0,05% de tripsina-EDTA a cada poço a ser passadas e incubar à temperatura ambiente durante 3 min.
    3. Adicionar 100 ul de inibidor de tripsina contendo DNAseI para parar a reacção.
    4. Triturar aproximadamente 10 vezes para cima e para baixo com uma pipeta P200 para quebrar o neurosphere.
    5. Transferir 200 ml contendo o neuroesfera dissociado de um novo poço de uma placa de 24 poços contendo 1,5 mL de meio de crescimento. Incubar a 37 ° C com 5% de CO2 até se formarem neuroesferas secundárias.
      Nota: para determinar o potencial de longo prazo, uma das propriedades fundamentais de um verdadeiro s neuraiscélula temperatura, neuroesferas devem ser passadas por pelo menos 5-10 passagens. Veja também a literatura sobre a interpretação controversa em parte de tais resultados 12-14.

10. Diferenciação das Culturas neurosphere

Neurospheres primárias ou subculturas podem ser diferenciados para determinar multipotencialidade.

  1. Remover neurospheres em suspensão de sua placa de cultura ou frasco e transferi-los para de 10 cm de plástico placa de Petri.
  2. Sob um microscópio de dissecção remover aproximadamente 15-20 neuroesferas a partir do meio utilizando uma pipeta de P20 e transferir para uma placa de 24 poços contendo meio de cultura, sem factores de crescimento e uma lamela revestida PDL / laminina.
  3. Diferenciar em cerca de 7 dias a 37 ° C com 5% de CO 2.
  4. Lavar as neuroesferas diferenciadas com PBS para remover as células mortas, em seguida, fixar com PFA a 4% durante 20 min à temperatura ambiente.
  5. Lavar novamente com PBS para retirar quaisquer lamelas PFA e armazenar em poços em 1 ml de PBS a 4 ° C

11. Imunocoloração de Neurosphere e culturas aderentes

Nota: Para a coloração com o anticorpo O4 omitir a Triton das etapas de bloqueio e de coloração e lembre-se de usar um anticorpo IgM secundário apropriado.

  1. Incubar as lamelas contendo as neuroesferas diferenciadas ou culturas em monocamada aderente na solução (10% soro normal Donkey em PBS contendo 0,2% de Triton X-100) de bloqueio, durante 60 minutos à temperatura ambiente.
  2. Incubar em solução de bloqueio fresco contendo primário BIII-tubulina, Map2a + b, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) ou anticorpos O4 durante 60 min a temperatura ambiente.
  3. Lavar 3x com PBS.
  4. Incubar em solução de bloqueio fresco contendo anticorpos secundários conjugados com fluorescência adequados e 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; 1:5000) durante 30 min à temperatura ambiente no escuro.
  5. Montar as lamelas em lâminas de microscópio de fluorescência usando montagem médio e ar seco no escuro durante a noite
  6. Ver e imagem usando um microscópio de fluorescência.

Representative Results

Embora as duas regiões de origem neural do cérebro do rato adulto contêm células precursoras neurais, estas células podem comportar-se de maneira muito diferente quando cultivadas in vitro. As culturas em monocamada aderente gerados a partir de ambas as regiões parecem morfologicamente indistinguíveis (Figura 1A), no entanto, as culturas aderentes SVZ derivados proliferar mais rapidamente e necessitam de ser passadas, em média, 1-2 dias mais cedo do que os que são derivados a partir do DG. Tal como neuroesferas, as células precursoras derivadas da SVZ também proliferam mais rapidamente e formam neuroesferas maiores (Figura 1B) do que as células precursoras derivadas de DG (Figura 1C). Embora neuroesferas SVZ derivados são geralmente contados após 6-7 dias em cultura, neuroesferas DG-derivados são geralmente quantificados após 10-12 dias. Além disso, um número muito maior de células precursoras neurais residir no SVZ comparação com o DG, como evidenciado pela quase 10 vezes maior número de neuroesferas, que podem ser génerosted a partir desta região (SVZ: 1,173 ± 74,9 vs DG: 145,3 ± 26,4, p = <0,0001, n = 10 animais por grupo, figura 2A).

Estudos têm demonstrado que as células precursoras dentro do SVZ e DG responder a diferentes estímulos. As células precursoras do DG são ativados por tipos específicos de aprendizagem espacial e por estímulos como o enriquecimento ambiental e atividade física, ao passo que as células precursoras SVZ são ativados por aprendizado olfativo e enriquecimento olfativo. Coerente com isso, um de nós (TLW) previamente demonstrado que a DG contém uma população de células-tronco latentes e as células progenitoras que podem ser ativadas por excitação neural 15-18. Em contraste, verificou-se que as células precursoras de SVZ respondem de maneira muito diferente a este estímulo, com uma diminuição no número neuroesfera em resposta à despolarização níveis de KCl 17. Aqui, temos repetido esta experiência, chapeamento de metade das células isoladas derivadas da SVZ e DG da individual animais em despolarização níveis de KCl e a outra metade dos níveis de controlo de KCl. Demonstramos, como anteriormente, enquanto que as células precursoras DG são activados por despolarização (101,2 ± 17,4 versus 184,8 ± 12,5, p = 0,005, n = 5 animais), a proliferação de células derivadas da SVZ é, de facto, diminuiu significativamente ( 368,0 ± 62,9 vs 266,6 ± 41,6, p = 0,02, n = 5 animais; figura 2B).

Para confirmar o potencial a longo prazo, uma das características fundamentais de uma célula estaminal verdade, neuroesferas individuais ou as culturas de monocamadas aderentes deverá ser capaz de expansão ou seja estendido ao longo de pelo menos 10 passagens. Em cada passagem, a seguir a preparação de uma suspensão de células individuais, o número de células é contado e a expansão de dobragem é calculado. O total de células teórica é então calculada multiplicando a expansão vezes durante esta passagem pelo total teórica da passagem anterior. Este é disp Definiu como um gráfico de linhas, com o número de passagem plotada contra o log10 do número total de células teórico (ver exemplo Figura 3). Para confirmar multipotencialidade, ambas as culturas de monocamada e neuroesferas podem ser diferenciadas pela retirada mitogénio e ser mostrado para dar origem a ambos os neurónios e células da glia (Figura 4).

Figura 1
Figura 1. Adulto células precursoras do rato podem ser cultivadas como culturas em monocamada aderentes (A) ou como neurospheres (B: ZSV, C: DG).. Barra de escala é de 50 mm Clique aqui para ver imagem ampliada.

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Figura 2. Significativamente mais neuroesferas são gerados a partir do SVZ comparação com o DG de ratinhos única (A). As células precursoras de SVZ e DG respondem diferentemente a despolarização in vitro (B).

Figura 3
Figura 3. Para confirmar a potenciação a longo prazo, neuroesferas são expandidas para mais de 10 passagens.

Figura 4
Figura 4. Neuroesferas podem ser diferenciados em BIII-tubuneurônios lin + (A: vermelho), GFAP + astrócitos (A: verde), O4 + oligodendrócitos (B: vermelho) e Map2ab + neurônios (C: vermelho). Clique aqui para ver imagem ampliada.

Discussion

Este trabalho apresenta um protocolo detalhado para o início de culturas precursoras neurais, tanto monocamadas como aderentes e neurospheres, das duas principais regiões neurogênicas do cérebro do rato adulto. Há uma série de pontos importantes que devem ser mantidos em mente ao tentar qualquer um destes sistemas de cultivo in vitro. Em primeiro lugar, a escolha do método de dissociação é muito importante e é dependente do tecido. Nas nossas mãos, 0,05% de tripsina-EDTA é muito eficaz para a dissociação de tecido SVZ, e resulta em um maior número de neuroesferas do que quando se utiliza uma técnica de dissociação à base de papaína. Para a dissociação do DG tecido no entanto, recomendamos uma abordagem baseada na dissociação papaína. Quando se comparam directamente os dois métodos de dissociação em DG tecido, observou-se um rendimento significativamente menor de células viáveis ​​e, aproximadamente, 10 vezes menos neuroesferas quando utilizando tripsina. Esta diferença de dissociação pode ser devida à diferença no Teor de tecidon entre as duas regiões. O tecido compacto do DG é rodeado por uma extensa neurópila e danos extensos de processos celulares podem ocorrer durante a dissociação.

Um segundo ponto importante a salientar é que, embora o ensaio neurosphere pode ser útil para fazer declarações quantitativos sobre o número de células precursoras presentes em uma determinada amostra de tecido, alguns cuidados devem, entretanto, ser empregado na interpretação destes números absolutos. Fusão de neurospheres pode ser um importante fator de confusão. Vários estudos têm mostrado que os neurônios são altamente móveis e podem fundir-se, mesmo em que são supostamente as condições dos clonais '7,19. A freqüência neurosphere resultante pode ser muito dependente de fatores, incluindo os componentes de média, o procedimento de dissecção eo processo de dissociação. Mesmo entre os manipuladores experientes alguma variação no número de neuroesferas gerados a partir de amostras supostamente idênticos é evidente (ver Figura 1A.) Mais útil, é uma comparação direta da freqüência precursor entre duas amostras dadas (ou seja, contra o controle tratado ou do tipo selvagem contra o knock-out) manipulados pela mesma pessoa dentro de um único experimento, ao invés de uma declaração quantitativa do total número de células precursoras.

Ao decidir qual dos dois métodos de cultura é o mais adequado para uma experiência particular, é importante notar que estes dois sistemas de cultura diferem na homogeneidade dos tipos de células geradas. Em comparação com as culturas em proliferação de células aderentes, as quais mostram um conjunto de células precursoras relativamente homogénea (~ 98% de células são Sox2 +) 20, neuroesferas são mais heterogénea e contêm, assim como proliferação de células precursoras de neurónios, astrócitos e diferenciados, 21,22. É importante que as neuroesferas não são cultivadas por longos períodos entre passagens quanto maior o neuroesfera tornar o mais provável é o de encontrar um tipo de células diferenciadas no seu núcleo.

Nós tradicionalmente iniciar aderentes monocamada culturas precursoras neurais a partir do tecido de DG entre 5-8 ratos. Portanto, ao tentar estabelecer as culturas em monocamada aderentes da DG ou ZSV de um único mouse, o maior cuidado deve ser tomado durante o processo de dissociação do tecido, a fim de evitar a morte excessiva de células causada por excesso trituração do tecido, ou tomar estendido períodos de tempo entre a dissecção e etapas finais cultura. Este protocolo descreve, pela primeira vez, a geração de culturas aderentes em monocamada de precursor tanto do SVZ e DG de animais individuais. Existem muitos casos em que a comparação da proliferação e diferenciação de precursores tem de ser feito numa única base animal. Estes incluem a capacidade de comparar diretamente o DG e ZSV de animais individuais usando estatísticas emparelhados e para emparelhar dados de cultura com dados comportamentais ou fisiológicos individuais 9. Culturas animais solteiros também albaixo o uso de animais raros transgênicas, onde um grupo de 5-8 doadores por cultura de correspondência de idade não é possível, assim como animais únicos (por exemplo, cruzes F2 ou animais criados fora) para estudos de associação genética.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

TLW foi apoiado por uma Marie Curie internacionais de entrada Fellowship. Este trabalho também foi financiado por fundos institucional básica, Bundesministerium für Bildung e Forschung (BMBF) financiamento e, em parte, com o apoio do Programa Prioritário de Pesquisa (SFB) 655 para GK. Os autores gostariam de agradecer a Anne Karasinsky para o cuidado e manutenção de todos os animais utilizados neste estudo e Odette Leiter, Susann Ruhwald, Fanny Boehme, e Richard Wetzel para cultura de células e assistência microscopia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-lysine Sigma P7280-5MG
Laminin Roche 11243217001
Glass Pastuer pipettes Volac BS5732
DMEM:F12 (1:1) 1x Life Technologies 21331-020
Neural Basal Medium (1x) Life Technologies 21103-049
B27 supplements (50x) Life Technologies 17504-044
GlutaMAX Life Technologies 35050-038
Heparin Sigma H3393
Penacillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
EGF PeproTech AF-100-15
bFGF PeproTech 100-18B
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
Trypsin inhibitor Sigma T6522
DNaseI Roche 10104159001
Accutase PAA L11-007
Papain Worthington LS003120
Dispase Life Technologies 17105-041
Percoll GE Healthcare 17-0891-02
HBSS (with Calcium and Magnesium) Life Technologies 14025-050
Glucose Roth X997.2
HEPES Sigma H3375-500G
NaHCO3 Merck K39347429847
1 ml Syringes  Braun 2016-10
27 G Needles Braun 4657705
Scalpels (#22 disposable) Braun BA222
Dumont #7 forceps FST 11271-30
Dumont 5/45 forceps FST 11251-35
Scissors FST 14060-10
Iris spatula FST 10093-13
70% Ethanol
PBS Life Technologies 14040-091
flasks/well plates TPP 92696
PFA (4%) Sigma P6148
Hemocytometer Marienfeld 650010
Trypan blue (0.4%) Sigma T8154
NDS Millipore 530
TritonX-100 Sigma T9284
Mouse monoclonal bIII-tubulin antibody Promega G712A
Rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody Dako 20334
O4  R&D Systems MAB1326
Map2a+b Sigma M1406
Donkey anti-mouse Cy3 antibody  Jackson ImmunoResearch 715-505-151
Donkey anti-rabbit Alexa488  Dianova 711-545-152
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)  Invitrogen 861405
Aqua Polymount Polysciences Inc 18606
10 ml Combi tips Eppendorf 30089677
Plastic 10 ml and 25 ml serological pipettes Corning 4488/4489
EQUIPMENT
Pipetboy Integra Biosciences 521942
Multidoser pipette Eppendorf
37 °C waterbath
Dissecting microscope
37 °C:5% CO2 incubator
Centrifuge Eppendorf 5810R

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.

A correction was made to One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In the Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does Figure 1 description in the Results section.

Protocol section 1.1 was changed from:

At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 mg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 mg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.

to:

At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 µg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 µg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.

Protocol section 1.3 was changed from:

On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 µg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.

to:

On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.

Protocol section 3.6 was changed from:

Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 mm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.

to:

Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 µm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.

Protocol section 3.7 was changed from:

Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 ml growth medium.

to:

Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 µl growth medium.

Protocol section 6.2 was changed from:

Add 50 ml Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).

to:

Add 50 µl Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).

Protocol section 6.6 was changed from:

For subsequent passages, resuspend cells in 200 ml growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.

to:

For subsequent passages, resuspend cells in 200 µl growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.

Protocol section 8.1 was changed from:

Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 ml/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.

to:

Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 µl/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.

Protocol section 9.1.6 was changed from:

Remove 10 ml of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.

to:

Remove 10 µl of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.

Protocol section 9.2.2 was changed from:

Add 100 ml of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.

to:

Add 100 µl of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.

Protocol section 9.2.5 was changed from:

Transfer the 200 ml containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.

to:

Transfer the 200 µl containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.

Figure 1 description was updated from:

Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 mm.

to:

Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 µm.

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos
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Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. J. Vis. Exp. (84), e51225, doi:10.3791/51225 (2014).More

Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. J. Vis. Exp. (84), e51225, doi:10.3791/51225 (2014).

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