نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة للجيل في وقت واحد من مزارع الخلايا العصبية السلائف، إما الطبقات الوحيدة ملتصقة أو neurospheres، من منطقة subventricular والتلفيف المسنن من الفئران الكبار الفردية.
مقايسة neurosphere ونظام الثقافة أحادي الطبقة ملتصقة هي أدوات قيمة لتحديد إمكانية (الانتشار أو تمايز) من الكبار الخلايا الجذعية العصبية في المختبر. هذه المقايسات يمكن استخدامها لمقارنة المحتملة السلائف الخلايا المعزولة من مختلف وراثيا أو المعالجة بشكل مختلف الحيوانات لتحديد تأثير العوامل الخارجية على تكاثر الخلايا العصبية السلائف والتمايز والعصبية لتوليد خطوط الخلايا السلائف التي يمكن أن يعاير أكثر المقاطع المستمر. يتم استخدام مقايسة neurosphere تقليديا لتحديد بعد خاص من الخلايا الجذعية، ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود علامات نهائية مع التي يمكن أن تكون معزولة عن الأنسجة الأولية ولديه ميزة كبيرة لإعطاء تقدير الآن من أعداد الخلايا السلائف في أنسجة المخ المشتقة من الحيوانات الفردية. الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة، في المقابل، لا تستخدم عادة للمقارنة بين انتشار الحيوانات الفردية، كما بدأت كل ثقافة عموما من النسيج مجتمعة بين 5-8 حيوانات. ومع ذلك، لديهم ميزة كبيرة أنه، خلافا neurospheres، أنها تتكون من مجموعة من السكان معظمهم متجانسة من الخلايا السلائف ومفيدة لمتابعة عملية التمايز في الخلايا واحدة. هنا، نحن تصف، بالتفصيل، وجيل من الثقافات neurosphere و، لأول مرة، والثقافات ملتصقة من الحيوانات الفردية. وهذا له العديد من الآثار الهامة بما في ذلك تحليل يقترن الانتشار و / أو المحتملة التمايز في كل من منطقة subventricular (SVZ) والتلفيف المسنن (DG) من خطوط الماوس أو معاملة مختلفة وراثيا، فضلا عن خفض كبير في استخدام الحيوان.
مقايسة neurosphere 1،2 و ثقافة أحادي الطبقة ملتصقة 3،4، كل من البلدان المتقدمة في 1990s في وقت مبكر، لا يزال المعيار الذهبي في المختبر فحوصات الخلايا الجذعية العصبية. في هذه المقايسات، الأنسجة الابتدائي الجزئي تشريح الدماغ من منطقة معينة، نأت الى تعليق خلية واحدة والمثقف في وجود عامل نمو البشرة mitogens (صندوق تعديل العولمة الأوروبي) وعامل نمو الخلايا الليفية-2 (FGF2) لتشكيل إما مجانا العائمة مجموعات (neurospheres) أو الطبقات الوحيدة ملتصقة. كلا النظامين لديها وينبغي إيلاء عدد من مزايا وعيوب ودراسة متأنية للمسألة التي يتعين معالجتها قبل اختيار واحد أو نظام آخر.
Neurospheres تسمح لقراءة واضحة للخروج من الخلافات في عدد الخلايا السلائف والمحتملين. بالإضافة إلى ذلك، neurospheres هي أيضا أداة مفيدة لدراسة المواصفات الذاتية للخلايا عند إزالتها من البيئة الخارجية العادية. Extrinالعظة كذا يمكن دراستها ببساطة عن طريق إضافة عامل تهم متوسطة النمو وتحديد عدد وحجم neurospheres المتولدة. العيب الرئيسي من neurospheres ومع ذلك، هو أنها تشكل مكانة خاصة بهم، مع الخلايا في وسط neurospheres (neurospheres كبيرة على وجه الخصوص) كونها أكثر تمايزا من تلك التي على السطح 5. Neurospheres تحتوي على مزيج من الخلايا الجذعية، التي ارتكبت الأسلاف، وخلايا متباينة، والتفاعلات خلية خلية داخل neurospheres مواجهة صيانة الخلايا الجذعية. هذا هو السبب في neurospheres تحتوي إلا على عدد قليل من الخلايا الجذعية صحيح 6-8.
الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة أيضا توفير نظام جيد في المختبر إلى نموذج في انتشار الجسم الحي. يمكن الثقافات ملتصقة، في الخلايا التي تبقى أكثر عزلة ومتجانسة، والقضاء على الطبيعة غير المتجانسة للneurosphere. في ظل هذه الظروف نمو الخلايا السلائف تتكاثر RAPIDLY والخلايا كلها تقريبا يتم تقسيم والتعبير عن علامات مميزة السلائف العصبية Nestin، Sox2، وBLBP. والعيب الرئيسي لنظام أحادي الطبقة الثقافة مقارنة مع مقايسة neurosphere هو أن الحيوانات المستنسخة الفردية المستمدة من السلائف غير قادرين على رصد وكميا.
وكان من العيب معظم بروتوكولات لكلا النوعين من الثقافات ضرورة لاستخدام أعداد كبيرة نسبيا من الحيوانات، لأن العائد من استراتيجيات العزلة كثيرا ما كان الفقراء. في نفس الوقت، فقد أصبح من الواضح أن تكوين الخلايا العصبية الكبار يساهم في تفريد الدماغ 9، مما أدى إلى ضرورة فردية فيفو السابقين النماذج كذلك. هذه الاحتياجات يمكن تلبيتها عن طريق بروتوكولات "الفأر واحد، ثقافة واحدة" كما هو موضح في هذا التقرير.
يصف بروتوكول البصرية التالية جيل في وقت واحد من الثقافات السلائف العصبية من كل من SVZ وDG الحيوانات الفردية إما ملتصقة مonolayers أو كما neurospheres. الجيل الثقافات من الحيوانات الفردية مفيد بشكل خاص عندما يتطلب الأمر مقارنات بين الحيوانات المعالجة بشكل فردي أو المعدلة وراثيا مختلف الفردية أو البرية من نوع الفئران. ويشمل هذا البروتوكول تعليمات مفصلة للتسليخ مجهري في وقت واحد من المناطق SVZ وDG من الفئران الكبار، تفارق بهم في تعليق خلية واحدة، والثقافة في المختبر إما الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة أو neurospheres وتحليل multipotentiality والمحتملة على المدى الطويل، الكاردينال اثنين خصائص الخلايا الجذعية النية العظام.
تعرض هذه الورقة بروتوكول مفصلة لبدء الثقافات السلائف العصبية، سواء الطبقات الوحيدة ملتصقة كما وneurospheres، من المنطقتين العصبية الرئيسية في مخ الفأر الكبار. هناك عدد من النقاط الهامة التي يجب أن يوضع في الاعتبار عند محاولة أي من هذه النظم في المختبر الثقافة. أولا، اختيار أسلوب التفكك مهم جدا وتعتمد الأنسجة. في أيدينا، 0.05٪ التربسين EDTA-فعالة جدا لتفكك النسيج SVZ، والنتائج في عدد أكبر من neurospheres من عند استخدام تقنية التفكك القائم على غراء. لتفكك النسيج DG ومع ذلك، فإننا نوصي بشدة نهج التفكك القائم على غراء. عند مقارنة مباشرة الأساليب تفارق اثنين على الأنسجة DG، لاحظنا العائد أقل بكثير من خلايا قابلة للحياة، وحوالي 10 أضعاف أقل neurospheres عند استخدام التربسين. هذا الاختلاف في التفكك يمكن أن يكون راجعا إلى الاختلاف في الأنسجة compositioن بين المنطقتين. وتحيط الأنسجة المدمجة التابعة للإدارة العامة من قبل neuropil واسعة ويمكن أن تحدث أضرار واسعة النطاق من خلال العمليات الخلوية التفكك.
والنقطة الثانية الهامة هو أن نلاحظ أنه في حين أن الفحص neurosphere يمكن أن تكون مفيدة في الإدلاء ببيانات كمية عن عدد الخلايا السلائف موجودة في عينة نسيج معين، يجب، مع ذلك، أن تستخدم بعض الحذر في تفسير هذه الأرقام المطلقة. انصهار neurospheres يمكن أن يكون عاملا رئيسيا التباس. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن الخلايا العصبية هي متحركة للغاية ويمكن أن تندمج، حتى في ظل ما من المفترض أن تكون الظروف 'النسيلي' 7،19. تردد neurosphere الناتجة يمكن أن تكون تعتمد اعتمادا كبيرا على العوامل بما في ذلك مكونات المتوسطة، وإجراء تشريح وعملية التفكك. حتى بين معالجات خبرة بعض الاختلاف في عدد neurospheres المتولدة من العينات متطابقة يفترض هو واضح (انظر الشكل 1A.) أكثر فائدة، هو المقارنة المباشرة من وتيرة السلائف بين عينتين معين (أي سيطرة مقابل معاملة أو من النوع البري مقابل خروج المغلوب) التي تمت معالجتها بواسطة نفس الشخص في تجربة واحدة، بدلا من بيان الكمي من مجموع عدد الخلايا السلائف.
عند البت فيها الطرق الثقافة الاثنين هو الأكثر ملاءمة لإجراء تجربة معينة فمن المهم أن نلاحظ أن هذه الأنظمة ثقافة اثنين تختلف في تجانس أنواع الخلايا المتولدة. بالمقارنة مع تكاثر الخلايا الملتصقة الثقافات، والتي تظهر على تجمع الخلايا السلائف متجانسة إلى حد ما (~ 98٪ من الخلايا هي Sox2 +) 20، neurospheres أكثر غير متجانسة وتحتوي، فضلا عن تكاثر الخلايا السلائف، الخلايا العصبية متباينة، والخلايا النجمية 21،22. من المهم أن neurospheres ليست مثقف لفترات طويلة بين المقاطع كما أكبر neurosphere تصبح الأرجح هو أن تجد أنواع الخلايا المتمايزة في جوهرها.
نبدأ عادة ملتصقة أحادي الطبقة الثقافات السلائف العصبية من الأنسجة DG ما بين 5-8 الفئران. لذلك، عند محاولة إنشاء الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة من DG أو SVZ من ماوس واحدة، يحتاج الرعاية القصوى التي يجب اتخاذها أثناء إجراء تفارق الأنسجة من أجل تجنب موت الخلايا المفرطة الناجمة عن أكثر من الطحن من الأنسجة، أو أخذ تمديد الفترات الزمنية بين تشريح وخطوات زراعة النهائي. يصف هذا البروتوكول، للمرة الأولى، جيل من الثقافات أحادي الطبقة ملتصقة السلائف من كل من SVZ وDG الحيوانات الفردية. هناك العديد من الحالات عندما يحتاج المقارنة بين انتشار السلائف والتمايز إلى أن يتم على أساس حيوان واحد. وتشمل هذه القدرة على مقارنة مباشرة للإدارة العامة لوSVZ الحيوانات الفردية المقترنة باستخدام الإحصاءات والبيانات لإقران الثقافة مع البيانات السلوكية أو الفسيولوجية الفردية 9. ثقافات حيوان واحد أيضا:انخفاض استخدام الحيوانات النادرة المعدلة وراثيا، حيث مجموعة من المانحين 5-8 في ثقافة مطابقة سن غير ممكن، وكذلك الحيوانات الفريدة (مثل الصلبان F2 أو الحيوانات المرباة خارج) لجمعية دراسات الجينية.
The authors have nothing to disclose.
وأيد TLW من قبل زمالة ماري كوري الدولية الواردة. وقد تم تمويل هذا العمل أيضا من التمويل المؤسسية الأساسية، Bundesministerium الفراء Bildung وForschung (BMBF) والتمويل جزئيا بدعم من برنامج البحوث ذات الأولوية (SFB) 655 لGK. فإن الكتاب أود أن أشكر آن Karasinsky للرعاية وصيانة جميع الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة وأوديت ليتر، سوزان Ruhwald، فاني بوهمه، وريتشارد يتزيل لزراعة الخلايا والمساعدة المجهري.
CONSUMABLES | |||
poly-D-lysine | Sigma | P7280-5MG | |
laminin | Roche | 11243217001 | |
glass pastuer pipettes | Volac | BS5732 | |
DMEM:F12 (1:1) 1X | Life Technologies | 21331-020 | |
Neural Basal Medium (1X) | Life Technologies | 21103-049 | |
B27 supplements (50X) | Life Technologies | 17504-044 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050-038 | |
Heparain | Sigma | H3393 | |
Penacillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
bFGF | PeproTech | 100-18B | |
0.05% trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
DNaseI | Roche | 10104159001 | |
Accutase | PAA | L11-007 | |
Papain | Worthington | LS003120 | |
Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
HBSS (with Calcium & Magnesium) | Life Technologies | 14025-050 | |
Glucose | Roth | X997.2 | |
HEPES | Sigma | H3375-500G | |
NaHCO3 | Merck | K39347429847 | |
1mL syringes | Braun | 2016-10 | |
27 Gauge needles | Braun | 4657705 | |
scalpels (#22 disposable) | Braun | BA222 | |
Dumont #7 forceps | FST | 11271-30 | |
Dumont 5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
scissors | FST | 14060-10 | |
Iris spatula | FST | 10093-13 | |
70% ethanol | |||
PBS | Life Technologies | 14040-091 | |
flasks/well plates | TPP | 92696 | |
PFA (4%) | Sigma | P6148 | |
hemocytometer | Marienfeld | 650010 | |
trypan blue (0.4%) | Sigma | T8154 | |
NDS | Millipore | 530 | |
TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
mouse monoclonal bIII-tubulin antibody | Promega | G712A | |
rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody | Dako | 20334 | |
O4 | R & D systems | MAB1326 | |
Map2a+b | Sigma | M1406 | |
donkey anti-mouse Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-505-151 | |
donkey anti-rabbit Alexa488 | Dianova | 711-545-152 | |
4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | 861405 | |
Aqua Polymount | Polysciences Inc | 18606 | |
10 ml Combi tips | eppendorf | 30089677 | |
plastic 10ml and 25mL serological pipettes | Corning | 4488/4489 | |
EQUIPMENT | |||
Pipetboy | Integra biosciences | 521942 | |
multidoser pipette | eppendorf | ||
37C waterbath | |||
dissecting microscope | |||
37C:5%Co2 incubator | |||
centrifuge | eppendorf | 5810R |