Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

doi: 10.3791/51225 Published: February 25, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gelijktijdig opwekken van neurale precursoren celculturen, hetzij als hechtende monolagen of neurosferen, uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van individuele volwassen muizen.

Abstract

De neurosfeer test en de hechtende monolaagcultuur systeem zijn waardevolle instrumenten om de potentiële (proliferatie of differentiatie) van adulte neurale stamcellen in vitro te bepalen. Deze testen kunnen worden gebruikt voor het vergelijken van de voorloper potentieel van cellen geïsoleerd uit genetisch verschillende of verschillend behandelde dieren om de effecten van exogene factoren neurale precursoren celproliferatie en differentiatie bepalen en neurale precursoren cellijnen die kunnen worden getest op continue passages genereren. De neurosfeer test wordt traditioneel gebruikt voor de post-hoc identificatie van stamcellen, hoofdzakelijk door het ontbreken van definitieve markers waarmee ze kunnen worden geïsoleerd uit primair weefsel en heeft het grote voordeel dat een snelle schatting van precursor celaantallen in hersenweefsel afgeleid van individuele dieren. Hechtende monolaag culturen daarentegen niet traditioneel gebruikt ter vergelijking proliferatie per diersoort, Aangezien elke cultuur algemeen geïnitieerd door de gecombineerde weefsel van 5-8 dieren. Zij hebben echter het grote voordeel dat, anders neurosferen bestaan ​​ze uit een grotendeels homogene populatie van voorlopercellen en zijn nuttig voor het volgen van het differentiatieproces in enkele cellen. Hier beschrijven we in detail het genereren van neurosfeerculturen en voor het eerst adherente culturen van individuele dieren. Dit heeft vele belangrijke implicaties waaronder gepaarde analyse van proliferatie en / of differentiatie potentieel in zowel de subventriculaire zone (SVZ) en dentate gyrus (DG) van behandelde of genetisch verschillend muizenlijnen, evenals een significante vermindering van het dier.

Introduction

De neurosfeer assay 1,2 en de hechtende monolaagcultuur 3,4, beide ontwikkeld in de vroege jaren 1990, nog steeds de gouden standaard in vitro neurale stamcellen assays. In deze testen is primair weefsel micro ontleed uit een bepaald hersengebied, gedissocieerd in een enkele celsuspensie en gekweekt in aanwezigheid van mitogenen epidermale groeifactor (EGF) en fibroblast groeifactor-2 (FGF2) vormen hetzij vrij zwevende clusters (neurospheres) of aanhangende monolagen. Beide systemen hebben een aantal voor-en nadelen en een zorgvuldige afweging moet worden besteed aan de vraag die moet worden aangepakt voordat een of het andere systeem wordt gekozen.

Neurospheres toelaten een eenvoudige uitlezing van de verschillen in de voorloper van het aantal cellen en potentieel. Daarnaast neurosferen zijn ook nuttig intrinsieke specificatie van de cellen te bestuderen wanneer uit hun normale externe omgeving. Extrinsic signalen kunnen worden bestudeerd door eenvoudig toevoegen van de factor van belang aan het groeimedium en dat het aantal en de grootte van de gegenereerde neurosferen. Het grote nadeel van neurosferen echter dat zij vormen hun eigen niche, met de cellen in het midden van de neurosferen (zeer grote neurospheres) die meer gedifferentieerd dan die op het oppervlak 5. Neurosferen een combinatie bevat van stamcellen, progenitorcellen gepleegd en gedifferentieerde cellen en cel-cel interacties in de neurosferen tegen de handhaving van de stamcellen. Daarom neurospheres bevatten slechts een klein aantal ware stamcellen 6-8.

Hechtende monolayer kweken bieden ook een goede in vitro systeem model in vivo proliferatie. Hechtende culturen, waarbij de cellen nog meer geïsoleerd en homogeen kan de heterogeniteit van de neurosphere elimineren. Onder deze groeicondities de voorloper cellen vermenigvuldigen rapidly en bijna alle cellen delen en uiten de karakteristieke neurale voorloper markers Nestin, Sox2 en BLBP. Het belangrijkste nadeel van de monolaag cultuur systeem in vergelijking met de neurosfeer test is dat individuele precursor afgeleide klonen niet kunnen worden gecontroleerd en gekwantificeerd.

Een nadeel van de meeste protocollen voor beide soorten kweken is de noodzaak om relatief grote aantallen dieren gebruikt zijn, omdat het rendement van de isolatie strategieën vaak slecht is. Tegelijkertijd, is gebleken dat volwassen neurogenese bijdraagt ​​aan de individualisering van de hersenen 9, waardoor de behoefte aan individuele ex vivo modellen. Deze behoeften kan worden voldaan door "one-muis-one-cultuur 'protocollen zoals beschreven in dit rapport.

De volgende visuele protocol beschrijft de gelijktijdige opwekking van neurale precursoren culturen uit zowel de SVZ en DG van individuele dieren hetzij als aanhangend monolayers of neurosferen. De generatie van de culturen van individuele dieren is vooral handig wanneer vergelijkingen tussen individueel behandelde dieren of verschillende individuele transgene of wild-type muizen zijn vereist. Dit protocol bevat gedetailleerde instructies voor de gelijktijdige microdissectie van het SVZ en DG gebieden van volwassen muizen, de dissociatie in een enkele celsuspensie in vitro kweek of hechtende monolayer kweken of neurospheres en analyse van multipotentiality en lange termijn potentieel, de twee hoofd eigenschappen van een bonafide stamcel.

Protocol

1. Basic Setup en voorbereiding van Cultuur Medium

  1. Ten minste twee dagen voor het begin van de proef, bereid poly-D-lysine (PDL) / laminine beklede platen voor hechtende monolayer kweken. Ter voorbereiding putjes / flessen voeg genoeg PDL (10 mg / ml in dH 2 O) het bekleden van het oppervlak en incubeer overnacht bij kamertemperatuur. Verwijder de oplossing uit de schaal en was de schaal driemaal met dH 2 O. Laat aan de lucht drogen. Voeg laminine (5 mg / ml in koude DMEM: F12) en incubeer bij 37 ° C geïncubeerd. Verwijder de Laminine en ofwel onmiddellijk gebruik maken van de platen of op te slaan met de Laminin bij -20 ° C totdat ze nodig waren.
  2. Bereid brand gepolijst pipetten met "medium" en "kleine" boringen door het draaien van glas pasteurpipetten in een vlam tot de randen worden afgerond. Autoclaaf te steriliseren.
  3. Op de dag van dissectie, bereid de geschikte hoeveelheid kweekmedium door mengen Neural basismedium met 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg / ml heparine, 50 eenheden / ml penicilline / streptomycine, 20 ng / ml gezuiverd muisreceptor kwaliteit epidermale groeifactor (EGF), en 20 ng / ml boviene fibroblast groeifactor (FGF-2). Verwarm het kweekmedium tot 37 ° C in een waterbad.
  4. Voor de SVZ dissociatie bereiden 0,05% trypsine-EDTA en 0,125 mg / ml trypsine remmer die 0,01 mg / ml DNasel. Equilibreer deze oplossingen tot 37 ° C.
  5. Het opzetten van een dissectie microscoop en de voorbereiding van de instrumenten die nodig zijn om de hersenen (schaar en kleine spatel) te verwijderen en voor SVZ en DG dissecties (scalpel, 27 G naald grenst aan 1 ml spuit, 1 x # 7 tang, 1 x # 5/45 forceps) door onderdompeling in 70% ethanol.

2. Oogsten van volwassen muis Brains en SVZ / DG Microdissections

  1. Verdoven alleenstaande volwassene (8 weken oud) muizen volgens de passende institutionele richtlijnen. Voer cervicale dislocatie.
  2. Spray het hoofd met 70% ethanol om het gebied te steriliseren en om de hoeveelheid bont minimaliseren dat eendHères de schaar en de hersenen. Met behulp van een scherpe schaar onthoofden het dier aan de basis van de hersenstam.
  3. Houd het hoofd bij de basis van de schedel, snijd de schedel tussen de twee reukbollen door het plaatsen van een blad van een kleine schaar in elk oog holte en snijden coronaalwaarts. Maak vervolgens twee zijdelingse sneden aan de basis van de schedel, gevolgd door een longitudinale snede door de schedel langs de pijlnaad. Let op: zorg voor de hoek van de schaar is zo ondiep mogelijk om beschadiging van de onderliggende hersenen.
  4. Expose de hersenen door het afpellen van de schedel met ofwel het blad van de schaar of een paar gebogen pincet. Bevrijd de hersenen uit de schedel met een kleine spatel en plaats in koud PBS.
  5. Spoel hersenen met PBS om bloed en haren te verwijderen.
  6. Transfer hersenen om een ​​10 cm plastic petrischaal met PBS
  7. Plaats petrischaal met de hersenen onder een dissectie microscoop bij een lage vergroting en de positie van de brain op het ventrale oppervlak. Met behulp van fijne gebogen pincet verwijder de reukbollen terwijl de hersenen in stand door het cerebellum.
  8. Draai de hersenen op de dorsale zijde en met een scalpel een coronale doorsnede door de hersenen op het niveau van de optische chiasma
  9. Om de SVZ microdissect (voor meer gedetailleerde instructies, zie ook Azari et al.. 10), plaats de rostrale deel van de hersenen, zodat het snijden coronale oppervlak naar boven wijst en de focus van de microscoop op een hogere vergroting. Verwijderen en het septum gooi met behulp van fijne gebogen pincet.
  10. Ontleden de SVZ (het dunne weefsel rondom de ventrikel) door de punt van een blad van een paar fijne gebogen pincet in de laterale hoek van de laterale ventrikel direct onder het corpus callosum en de andere ongeveer 1 mm in het weefsel onmiddellijk grenzend aan het ventrikel. Druk de tang naar de basis van de schaal en naar het ventrale aspect van de ventrIcle een kleine driehoekige stukje weefsel te verwijderen. Plaats de ontleed SVZ in een petrischaal op ijs.
  11. Om de DG microdissect (voor meer gedetailleerde instructies, zie ook Hagihara et al.. 11), plaatst het caudale deel van de hersenen in de petrischaal en snijd langs de longitudinale spleet met behulp van een scalpel.
  12. Onder een dissectie microscoop, verwijder het cerebellum en de diencephalon behulp van een tang.
  13. Heroriëntatie van de microscoop, zodat de randen rond de DG zijn nu zichtbaar. Om de dentate gyrus verwijderen, steek de punt van een 27 G naald en schuif langs de grens tussen de DG en Ammon hoorn. De fijne tang, vrij DG van het omringende weefsel.

3. SVZ Tissue Dissociatie

  1. Hak het weefsel met behulp van een scalpel voor ongeveer 1 minuut totdat er geen grote stukken blijven.
  2. Breng het gehakt weefsel een 15 ml buisje met 1 ml voorverwarmd 0,05% trypsine-EDTA en incubeer gedurende 7 min ineen waterbad tot 37 ° C.
  3. Om de enzymatische reactie te stoppen, voeg 1 ml trypsine-remmer die DNaseI en meng de inhoud door de knop van de buis.
  4. Pellet de suspensie door centrifugeren bij 300 g gedurende 5 minuten en de bovenstaande vloeistof
  5. Resuspendeer de pellet in 1 ml groeimedium en distantiëren door de pipet voorzichtig op en neer op ongeveer 7-10x met behulp van een P1000 pipet. Let op: meer dan triturating kan leiden tot verhoogde celdood en zal een negatieve invloed hebben op latere celgroei.
  6. Voeg groeimedium tot een totaal volume van 5 ml en laat de celsuspensie door een 40 mm zeef om vuil en gedissocieerde weefsel klonten te verwijderen.
  7. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 min, gooi het supernatant en resuspendeer de resulterende pellet in 200 ml groeimedium.

4. DG Tissue Dissociatie

  1. Hak het weefsel met behulp van een scalpel voor ongeveer 1 minuut totdat er geen grote stukken blijven en overdrachtin voorverwarmd PDD enzymmengsel (Papaïne 2,5 U / ml, Dispase 1 U / ml DNasel 250 U / ml). Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C, het mengen door het buisje elke 3-5 minuten.
  2. Distantiëren het weefsel mechanisch met behulp van een medium boring, vuur gepolijst, Pasteur pipet door en neer te pipetteren voorzichtig 10x.
  3. Incubeer nog eens 10 min bij 37 ° C, het mengen door het buisje elke 3-5 minuten.
  4. Verder distantiëren het weefsel mechanisch met een kleine boring, brand gepolijst Pasteur pipet door en neer te pipetteren voorzichtig 10x.
  5. Centrifugeer bij 130 xg gedurende 5 minuten.
  6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml bufferoplossing (1x HBSS, 30 mM glucose, 2 mM HEPES (pH 7,4), 26 mM NaHCO3). Vul aan tot 10 ml met buffer oplossing.
  7. Centrifugeer bij 130 xg gedurende 5 minuten.
  8. Verwijder de supernatant en resuspendeer de pellet in 5 ml 20% Percoll. (Ter voorbereiding 90% Percoll, voeg 4,5 ml van 100% Percoll tot 0,5 ml van 10x PBS dan is dit verder te verdunnen tot 20%door toevoeging van 1,1 ml 90% Percoll 3,9 ml 1x PBS).
  9. Centrifugeer 450 xg gedurende 15 minuten.
  10. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml buffer.
  11. Centrifugeer bij 130 xg gedurende 5 minuten.
  12. Resuspendeer de pellet in 200 ul groeimedium.

5. Generatie van Adherente monolaagculturen

  1. Plate de gedissocieerde SVZ of DG weefsel in een PDL / laminine beklede put van een 96-well plaat en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2.
  2. Ongeveer 24 uur na plating, zodra de cellen hebben gehandeld op het gecoate oppervlak, wisselen het groeimedium om verder te verwijderen overtollige puin.
  3. Elke volgende 3-4 dagen, uitwisseling helft van het groeimedium met vers medium om de groeifactoren te vullen.
  4. Herhaal dit tot de cellen te bereiken ongeveer 80% confluentie en zijn klaar om te worden gepasseerd. Opmerking: de tijd tussen de platen en de eerste passage kan tot 2-3 weken.
  1. Wanneer de culturen te bereiken ongeveer 80% confluentie verwijder het medium uit de put en wassen met PBS.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de cellen tot 90% confluentie overschrijden, omdat dit kan leiden tot onthechting van cellen en neurosfeer vorming en bovendien, verhoogde niveaus van celdood.
  2. Voeg 50 ml Accutase en incubeer bij 37 ° C gedurende 2-3 min (controleren of de cellen afgerond en vrijstaande).
  3. Verwijder de cellen om een ​​15 ml buisje en was de put eenmaal met PBS en dragen dezelfde buis.
  4. Verdun cellen 5 ml met PBS en centrifugeer 300 xg gedurende 5 minuten.
  5. Voor de eerste passage, verdunnen cellen tot 1 ml en de plaat in een PDL / Laminin goed gecoat van een 24 wells plaat.
  6. Voor de volgende passages, resuspendeer cellen in 200 ml groeimedium en tellen met behulp van een hemocytometer. Plaat bij 1 x 10 4 cellen / cm 2 in de juiste maat beklede put of kolf. i>

7. Differentiatie van Adherente monolaagculturen

  1. De hechtende monolaag culturen plaat prolifererende cellen differentiëren op PDL / laminine beklede dekglaasjes bij een dichtheid van 1 x 10 4 cellen / cm 2 in groeimedium bevattende 20 ng / ml EGF en 10 ng / ml bFGF.
  2. Wanneer de cellen ongeveer 80% confluentie (meestal 2 dagen) te bereiken, vervang het groeimedium met medium dat 5 ng / ml bFGF en 0 ng / ml EGF.
  3. Na 2 dagen in 5 ng / ml bFGF, vervang het medium met groeimedium bij ontstentenis van mitogenen voor nog eens 3 dagen. Opmerking: in deze periode een significante hoeveelheid celdood optreedt.
  4. Na een totaal van 5 dagen, was de gedifferentieerde cellen met PBS om dode cellen te verwijderen bevestig met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 min bij kamertemperatuur geroerd.
  5. Was opnieuw met PBS elk PFA en opslaan dekglaasjes in putjes in 1 ml PBS verwijderen bij 4 ° C.
jove_title "> 8. Neurosfeer Cultuur en kwantificering

  1. Verdun de gedissocieerde SVZ of DG weefsel van een dier in 20 ml kweekmedium en plaat 200 ml / putje in een 96-wells plaat met een 10 ml pipet multidoser.
  2. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 6-7 dagen SVZ afgeleide neurosferen en 10-12 dagen voor DG-afgeleide neurosferen.
    Opmerking: groei langer dan deze aanbevolen incubatietijd zal overgroei en zal leiden tot celdood in het midden van de neurosferen en / of spontane hechting en differentiatie.
  3. Telling en meet de diameter van de neurosferen met een oculairgraticule gemonteerd op een rechtopstaande lichtmicroscoop

9. Passage van de Neurosferen

Na de primaire neurosferen zijn geteld en hun grootte afgedrukt kunnen worden uitgebreid over meerdere passages te beginnen met een enkele neurosfeer of een bulk cultuur.

  1. Bulkkweek neurosfeer expansie
    1. Om passage gecombineerde neurosferen als bulkkweek, verwijder het medium dat de neurosferen van de plaat, overbrengen naar een 15 ml buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten.
    2. Verwijder het supernatant en resuspendeer de neurosferen in 1 ml voorverwarmd 0,05% trypsine-EDTA en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
    3. Voeg een gelijk volume trypsineremmer met DNaseI en meng.
    4. Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 xg, verwijder het supernatant en voeg 1 ml groeimedium.
    5. Vermaal op en neer ongeveer 10x met een P1000 pipet om de neurosferen distantiëren.
    6. Verwijder 10 ml van de celsuspensie en mengen met een gelijk volume van trypan blauw en voer een levende celtelling met een hemocytometer.
    7. Reseed de cellen bij een dichtheid van 1 x 10 4 cellen / cm 2 in de juiste maat celkweek goed of kolf.
    8. Incubeer bij 37 ° Cmet 5% CO 2 tot secundaire neurosferen vorm.
  2. Single neurosfeer expansie
    1. Om passage individuele neurosferen kiezen putten dat een enkel neurosfeer bevatten en zorgvuldig uit elk putje te verwijderen en gooi ongeveer 160 pl van het groeimedium zonder de neurosphere.
    2. Voeg 100 ml van 0,05% trypsine-EDTA aan elk putje worden gepasseerd en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
    3. Voeg 100 ul trypsine inhibitor met DNAsel om de reactie te stoppen.
    4. Vermaal ongeveer 10 keer op en neer met een P200 pipet om uiteen te vallen de neurosphere.
    5. Breng 200 ml dat de gedissocieerde neurosphere een nieuw putje van een 24-wells plaat met 1,5 ml groeimedium. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 totdat secundaire neurosferen vormen.
      Opmerking: op de lange termijn potentieel, een van de kardinale eigenschappen van een echte neurale s bepalenTEM-cel moet neurosferen worden gepasseerd ten minste 5-10 passages. Zie ook de literatuur over de in deel controversiële interpretatie van dergelijke resultaten 12-14.

10. Differentiatie van neurosfeerculturen

Primaire of gepasseerd neurosferen kan worden gedifferentieerd om multipotentiality bepalen.

  1. Verwijder neurosferen in suspensie van hun cultuur plaat of de kolf en overbrengen naar een 10 cm plastic petrischaal.
  2. Onder een dissectie microscoop verwijderen ongeveer 15-20 neurosferen van het medium met behulp van een P20 pipet en over te dragen aan een 24-wells plaat met het kweekmedium zonder groeifactoren en een PDL / Laminin gecoat dekglaasje.
  3. Onderscheid gedurende ongeveer 7 dagen bij 37 ° C met 5% CO2.
  4. Was de gedifferentieerde neurospheres met PBS om alle dode cellen te verwijderen en bevestig daarna met 4% PFA gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
  5. Was opnieuw met PBS aan rchrap elk PFA en opslaan dekglaasjes in putjes in 1 ml PBS bij 4 ° C

11. Immunokleuring van Neurosfeer en Adherente Culturen

Opmerking: Voor kleuring met de O4 antilichaam weglaten de Triton van de blokkering en vlekken stappen en vergeet niet om een geschikte IgM secundair antilichaam te gebruiken.

  1. Incubeer de dekglaasjes met de gedifferentieerde neurospheres of hechtende monolaag culturen blokkerende oplossing (10% normaal Ezel serum in PBS bevattende 0,2% Triton X-100) gedurende 60 min bij kamertemperatuur.
  2. Incubeer in verse blokkerende oplossing die primaire BIII-tubuline, Map2a + b, glia fibrillair zuur eiwit (GFAP) of O4 antilichamen voor 60 min bij kamertemperatuur geroerd.
  3. Was 3x met PBS.
  4. Incubeer in verse blokkerende oplossing die geschikte fluorescentie geconjugeerde secundaire antilichamen en 4,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 1:5000) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  5. Monteer de dekglaasjes op objectglaasjes met behulp van fluorescentie montage medium en de lucht drogen in het donker 's nachts
  6. Bekijk en beeld met behulp van een fluorescentie microscoop.

Representative Results

Hoewel beide neurogene gebieden van de volwassen muis hersenen bevatten beide neurale precursorcellen, kunnen deze cellen zeer verschillend gedragen wanneer gekweekt in vitro. De hechtende monolayer kweken gegenereerd uit beide gebieden lijken morfologisch niet te onderscheiden (figuur 1A), maar de SVZ-afgeleide adherente culturen sneller prolifereren en moet worden gepasseerd, gemiddeld 1-2 dagen eerder dan die welke door DG. Zoals neurosferen, de SVZ-afgeleide voorlopercellen ook sneller groeien en vormen grotere neurosferen (Figuur 1B) dan de DG-afgeleide voorlopercellen (figuur 1C). Hoewel SVZ-afgeleide neurosferen typisch geteld na 6-7 dagen in kweek worden DG afgeleide neurosferen gewoonlijk gekwantificeerd na 10-12 dagen. Bovendien, een veel groter aantal neurale voorlopercellen in het SVZ verblijven opzichte DG, zoals blijkt uit de bijna 10-voudig groter aantal neurosferen dat kan worden generated uit deze regio (SVZ: 1173 ± 74.9 vs DG: 145.3 ± 26.4, p = <0.0001, n = 10 dieren per groep; figuur 2A).

Studies hebben aangetoond dat de voorlopercellen in het SVZ en DG reageren op verschillende stimuli. De voorloper cellen in de DG worden geactiveerd door specifieke soorten ruimtelijke leren en door stimuli zoals milieu verrijking en lichamelijke activiteit, terwijl de SVZ voorloper cellen worden geactiveerd door olfactorische leren en olfactorische verrijking. In overeenstemming met deze, een van ons (TLW) eerder aangetoond dat de DG bevat een bevolking van latente stamcellen en stamcellen die kunnen worden geactiveerd door neurale excitatie 15-18. Daarentegen vonden we dat de SVZ voorlopercellen reageren zeer verschillend op deze stimulus, met een afname van neurosfeer getal in reactie op depolariserende niveaus KCl 17. Hier hebben wij dit experiment herhaald, plating helft van de geïsoleerde cellen afkomstig van de SVZ en DG van individual dieren depolariserende niveaus van KCl en de andere helft controle KCl niveaus. We tonen, zoals eerder, dat terwijl DG precursorcellen worden geactiveerd door depolarisatie (101,2 ± 17,4 versus 184,8 ± 12,5, p = 0,005, n = 5 dieren), de proliferatie van de SVZ-afgeleide cellen in feite aanzienlijk afgenomen ( 368,0 ± 62,9 vs 266,6 ± 41,6, p = 0,02, n = 5 dieren, Figuur 2B).

Om lange termijn potentieel, een van de kardinale kenmerken van een echte stamcel, enkel neurosferen of aanhangende monolaagkweken bevestiging moet namelijk kunnen uitgebreide expansie over ten minste 10 passages. Bij elke passage, na de bereiding van een eencellige suspensie, het aantal cellen wordt geteld en de vouw expansie wordt berekend. Het theoretische totale cel wordt vervolgens berekend door de vouw expansie vermenigvuldigen in die passage door de theoretische totale van de vorige passage. Dit is disp laid als een lijngrafiek met het aantal passages uitgezet tegen de log 10 van het theoretische totale aantal cellen (zie bijvoorbeeld figuur 3). Om multipotentiality bevestiging kan zowel monolaag culturen neurosferen worden onderscheiden door mitogeen terugtrekking en getoond aanleiding geeft tot zowel neuronen en glia (figuur 4).

Figuur 1
. Figuur 1 volwassen muis voorloper cellen kunnen worden gekweekt als hechtende monolaagkweken (A) of als neurosferen (B: SVZ, C: DG).. Schaal bar is 50 mm Klik hier voor grotere afbeelding.

load/51225/51225fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51225/51225fig2.jpg "/>
Figuur 2. Significant meer neurospheres values ​​from SVZ opzichte DG van afzonderlijke muizen (A). De SVZ en DG voorloper cellen reageren verschillend op in vitro depolarisatie (B).

Figuur 3
Figuur 3. Om op lange termijn potentiëring bevestigen, worden neurosferen uitgebreid voor meer dan 10 passages.

Figuur 4
Figuur 4. Neurosferen kunnen worden onderscheiden in BIII-Tubulin + neuronen (A: rood), GFAP + astrocyten (A: groen), O4 + oligodendrocyten (B: rood) en Map2ab + neuronen (C: rood). Klik hier voor grotere afbeelding.

Discussion

Dit document presenteert een gedetailleerd protocol voor de initiatie van neurale precursoren culturen, zowel als hechtende monolagen en neurosferen, van de twee grote neurogene regio's van de volwassen hersenen van muizen. Er zijn een aantal belangrijke punten die moeten worden gehouden bij een poging een van deze in vitro kweeksystemen. Ten eerste is de keuze van dissociatie werkwijze is zeer belangrijk en is afhankelijk weefsel. In onze handen, 0,05% trypsine-EDTA is zeer effectief voor dissociatie van SVZ weefsel, en resulteert in een hoger aantal neurosferen dan bij gebruik van een papaïne-gebaseerde dissociatie techniek. Voor de dissociatie van DG weefsel echter, raden we een-papaïne gebaseerde dissociatie aanpak. Wanneer de twee dissociatie methoden op DG weefsel direct te vergelijken, we zagen een beduidend lagere opbrengst van levensvatbare cellen en ongeveer 10 keer minder neurosferen bij gebruik van trypsine. Dit verschil in dissociatie kan te wijten zijn aan het verschil in weefsel composition tussen de twee regio's. De compacte weefsel van de DG wordt omgeven door uitgestrekte neuropil en uitgebreide schade van cellulaire processen kunnen optreden tijdens dissociatie.

Een tweede belangrijk punt om op te merken is dat, terwijl de neurosphere test nuttig om kwantitatieve uitspraken te doen over het aantal voorlopercellen aanwezig is in een bepaald weefsel monster te maken kan zijn, enige voorzichtigheid moet echter worden toegepast bij de interpretatie van deze absolute aantallen. Fusie van neurosferen kan een belangrijke verstorende factor zijn. Verschillende studies hebben aangetoond dat de neuronen zeer beweeglijk en kan smelten, zelfs onder welke zogenaamd 'klonen' voorwaarden 7,19. De resulterende neurosfeer frequentie kan zeer afhankelijk van factoren zoals de mediumcomponenten, de dissectie procedure en dissociatieproces. Zelfs tussen ervaren handlers enige variatie in het aantal neurosferen gegenereerd uit zogenaamd identieke monsters blijkt (zie figuur 1A.) Meer bruikbaar, is een directe vergelijking van de voorloper frequentie tussen twee gegeven monsters (dwz controle vs behandeld of wild-type vs knock-out) behandeld door dezelfde persoon binnen een enkel experiment, in plaats van een kwantitatieve opgave van de totale nummer voorloper cel.

Bij de beslissing welke van de twee kweekmethoden is het meest geschikt voor een bepaald experiment is belangrijk op te merken dat deze twee kweeksystemen verschillen de homogeniteit van de celtypen geproduceerd. In vergelijking met prolifererende hechtende celculturen, die een vrij homogeen voorlopercel zwembad (~ 98% van de cellen Sox2 +) toon 20, neurosferen zijn heterogeen en bevatten alsook prolifererende voorlopercellen, gedifferentieerde neuronen en astrocyten 21,22. Het is belangrijk dat de neurosferen niet gekweekt gedurende langere perioden tussen passages groter de neurosphere worden hoe waarschijnlijker het is om gedifferentieerde celtypes in hun cen.

We traditioneel initiëren hechtende monolaag neurale voorloper culturen uit de DG weefsel van 5-8 muizen. Daarom, bij een poging om de hechtende monolaagculturen van het DG of SVZ van een enkele muis vast te stellen, de grootst mogelijke zorg nodig heeft tijdens het weefsel dissociatie procedure die moet worden genomen om buitensporige celdood veroorzaakt door over fijnwrijven van het weefsel te voorkomen, of het nemen uitgebreid perioden tussen de dissectie en laatste kweken stappen. Dit protocol beschrijft voor het eerst de productie van hechtende monolayer kweken precursor van zowel de SVZ en DG van individuele dieren. Er zijn veel gevallen waarin de vergelijking van precursor proliferatie en differentiatie moet worden gemaakt op een enkel dier basis. Deze omvatten de mogelijkheid om direct te vergelijken de DG en SVZ van individuele dieren met behulp van gepaarde statistieken en cultuur van gegevens met individuele gedrags-of fysiologische gegevens 9 koppelen. Enkel dier culturen ook al.lage het gebruik van zeldzame transgene dieren, waar-leeftijd overeenkomen met een pool van 5-8 donoren per cultuur is niet mogelijk, maar ook unieke dieren (bijv. F2 kruisen of buiten gefokte dieren) voor genetische associatiestudies.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

TLW werd ondersteund door een Marie Curie-Inkomende Internationale Beurs. Dit werk werd ook gefinancierd van basis-institutionele financiering, Bundesministerium für Bildung en Forschung (BMBF) financiering en deels met steun van Priority Research Program (SFB) 655 naar GK. De auteurs willen graag Anne Karasinsky bedanken voor verzorging en onderhoud van alle in deze studie gebruikte dieren en Odette Leiter, Susann Ruhwald, Fanny Boehme, en Richard Wetzel voor celcultuur en microscopie hulp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-lysine Sigma P7280-5MG
Laminin Roche 11243217001
Glass Pastuer pipettes Volac BS5732
DMEM:F12 (1:1) 1x Life Technologies 21331-020
Neural Basal Medium (1x) Life Technologies 21103-049
B27 supplements (50x) Life Technologies 17504-044
GlutaMAX Life Technologies 35050-038
Heparin Sigma H3393
Penacillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
EGF PeproTech AF-100-15
bFGF PeproTech 100-18B
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
Trypsin inhibitor Sigma T6522
DNaseI Roche 10104159001
Accutase PAA L11-007
Papain Worthington LS003120
Dispase Life Technologies 17105-041
Percoll GE Healthcare 17-0891-02
HBSS (with Calcium and Magnesium) Life Technologies 14025-050
Glucose Roth X997.2
HEPES Sigma H3375-500G
NaHCO3 Merck K39347429847
1 ml Syringes  Braun 2016-10
27 G Needles Braun 4657705
Scalpels (#22 disposable) Braun BA222
Dumont #7 forceps FST 11271-30
Dumont 5/45 forceps FST 11251-35
Scissors FST 14060-10
Iris spatula FST 10093-13
70% Ethanol
PBS Life Technologies 14040-091
flasks/well plates TPP 92696
PFA (4%) Sigma P6148
Hemocytometer Marienfeld 650010
Trypan blue (0.4%) Sigma T8154
NDS Millipore 530
TritonX-100 Sigma T9284
Mouse monoclonal bIII-tubulin antibody Promega G712A
Rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody Dako 20334
O4  R&D Systems MAB1326
Map2a+b Sigma M1406
Donkey anti-mouse Cy3 antibody  Jackson ImmunoResearch 715-505-151
Donkey anti-rabbit Alexa488  Dianova 711-545-152
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)  Invitrogen 861405
Aqua Polymount Polysciences Inc 18606
10 ml Combi tips Eppendorf 30089677
Plastic 10 ml and 25 ml serological pipettes Corning 4488/4489
EQUIPMENT
Pipetboy Integra Biosciences 521942
Multidoser pipette Eppendorf
37 °C waterbath
Dissecting microscope
37 °C:5% CO2 incubator
Centrifuge Eppendorf 5810R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).
  3. Palmer, T. D., Ray, J., Gage, F. H. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol. Cell. Neurosci. 6, 474-486 (1995).
  4. Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system. Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).
  5. Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993, 18-29 (2003).
  6. Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PLoS One. 2, (2007).
  7. Jessberger, S., Clemenson, G. D., Gage, F. H. Spontaneous fusion and nonclonal growth of adult neural stem cells. Stem Cells. 25, 871-874 (2007).
  8. Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12, 4565-4574 (1992).
  9. Freund, J., et al. Emergence of individuality in genetically identical mice. Science. 340, 756-759 (2013).
  10. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (2010).
  11. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J. Vis. Exp. (2009).
  12. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).
  13. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell. Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
  14. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres- re-evaluating the relationship. Nat. Methods. 2, 333-336 (2005).
  15. Walker, T. L., Turnbull, G. W., Mackay, E. W., Hannan, A. J., Bartlett, P. F. The latent stem cell population is retained in the hippocampus of transgenic Huntington's disease mice but not wild-type mice. PLoS One. 6, (2011).
  16. Walker, T. L., et al. Prolactin stimulates precursor cells in the adult mouse hippocampus. PLoS One. 7, (2012).
  17. Walker, T. L., et al. Latent stem and progenitor cells in the hippocampus are activated by neural excitation. J. Neurosci. 28, 5240-5247 (2008).
  18. Walker, T. L., et al. Prominin-1 allows prospective isolation of neural stem cells from the adult murine hippocampus. J. Neurosci. 33, (2013).
  19. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat. Methods. 3, 801-806 (2006).
  20. Babu, H., et al. A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus. Front. Neurosci. 5, 89 (2011).
  21. Parmar, M., Sjoberg, A., Bjorklund, A., Kokaia, Z. Phenotypic and molecular identity of cells in the adult subventricular zone in vivo and after expansion in vitro. Mol. Cell Neurosci. 24, 741-752 (2003).
  22. Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14506-14511 (2002).

Erratum

Formal Correction: Erratum: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.

A correction was made to One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In the Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does Figure 1 description in the Results section.

Protocol section 1.1 was changed from:

At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 mg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 mg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.

to:

At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 µg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 µg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 °C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 °C until required.

Protocol section 1.3 was changed from:

On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 µg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.

to:

On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 °C in a water bath.

Protocol section 3.6 was changed from:

Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 mm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.

to:

Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 µm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.

Protocol section 3.7 was changed from:

Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 ml growth medium.

to:

Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 µl growth medium.

Protocol section 6.2 was changed from:

Add 50 ml Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).

to:

Add 50 µl Accutase and incubate at 37 °C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).

Protocol section 6.6 was changed from:

For subsequent passages, resuspend cells in 200 ml growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.

to:

For subsequent passages, resuspend cells in 200 µl growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.

Protocol section 8.1 was changed from:

Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 ml/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.

to:

Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 µl/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.

Protocol section 9.1.6 was changed from:

Remove 10 ml of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.

to:

Remove 10 µl of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.

Protocol section 9.2.2 was changed from:

Add 100 ml of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.

to:

Add 100 µl of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.

Protocol section 9.2.5 was changed from:

Transfer the 200 ml containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.

to:

Transfer the 200 µl containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 °C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.

Figure 1 description was updated from:

Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 mm.

to:

Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 µm.

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. J. Vis. Exp. (84), e51225, doi:10.3791/51225 (2014).More

Walker, T. L., Kempermann, G. One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice. J. Vis. Exp. (84), e51225, doi:10.3791/51225 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter