Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för samtidig framställning av neurala föregångare cellkulturer, som antingen vidhäftande monolager eller neurosfärer, från subventrikulära zonen och gyrus dentatus enskilda vuxna möss.
Den neurosfär-analysen och den vidhäftande monoskiktsodlingssystemet är värdefulla verktyg för att fastställa den potentiella (proliferation eller differentiering) av vuxna neurala stamceller in vitro. Dessa analyser kan användas för att jämföra föregångaren potentialen av celler som isolerats från genetiskt olika eller differentiellt behandlade djur för att fastställa effekterna av exogena faktorer på neural gångare celltillväxt och differentiering och generera neurala föregångare cellinjer som kan analyseras över kontinuerliga passager. Neurosphere analysen används traditionellt för post hoc identifiering av stamceller, främst på grund av brist på definitiva markörer med vilka de kan isoleras från primär vävnad och har den stora fördelen av att ge en snabb uppskattning av siffror gångare cell i hjärnvävnad kommer från enskilda djur. Adherenta encellslagsodlingar däremot inte traditionellt används för att jämföra spridningen mellan enskilda djur, Eftersom varje kultur i allmänhet initieras från den kombinerade vävnaden på mellan 5-8 djur. De har dock den stora fördelen att, till skillnad från neurosfärer, de består av en till största delen homogen population av föregångarceller och är användbara för att följa den differentieringsprocess i enstaka celler. Här beskriver vi i detalj alstringen av neurosfärkulturer och, för första gången, adherenta kulturer från enskilda djur. Detta har många viktiga konsekvenser inklusive parade analyser av proliferation och / eller differentiering potential i både subventrikulära zonen (SVZ) och gyrus gyrus (GD) i behandlade eller genetiskt olika mus linjer, samt en betydande minskning av djuranvändning.
Den neurosphere analys 1,2 och vidhäftande monolager kultur 3,4, båda utvecklade i början av 1990, fortfarande den gyllene standarden in vitro neurala stamcellsanalyser. I dessa analyser är primär vävnad mikro dissekerat från ett visst område i hjärnan, dissocieras till en enkelcellsuspension och odlades i närvaro av mitogener epidermal tillväxtfaktor (EGF) och fibroblast-tillväxtfaktor-2 (FGF2) för att bilda antingen fritt flytande kluster (neurosfärer) eller vidhäftande monolager. Båda systemen har ett antal fördelar och nackdelar och noggrann hänsyn bör tas till den fråga som ska lösas innan det ena eller det andra systemet väljs.
Neurosfärer tillåta en enkel avläsning av skillnaderna i prekursor cellantalet och potential. Dessutom neurosfärer är också ett användbart verktyg för att studera inneboende specifikation av cellerna när de tas bort från sin normala yttre miljön. Extrinsic ledtrådar kan studeras genom att helt enkelt lägga den faktor av intresse för tillväxtmediet och kvantifiera antalet och storleken på de neuro genereras. Den största nackdelen med neurosfärer är dock att de utgör en egen nisch, med cellerna vid mitten av neurosfärer (särskilt stora neurosfärer) är mer differentierad än de på ytan 5. Neuro innehåller en blandning av stamceller, stamceller och differentierade celler och cell-cell interaktioner inom neuro motverkar underhållet av stamceller. Därför neurospheres innehåller endast ett fåtal riktiga stamceller 6-8.
Adherenta encellslagsodlingar ger också en god in vitro-system för att modellera in vivo spridning. Adherenta kulturer, där cellerna förblir mer isolerade och homogena, kan eliminera den heterogena karaktären hos neurosphere. Under dessa tillväxtbetingelser prekursorcellerna proliferera rapiDLY och nästan alla celler delar sig och uttrycker de karakteristiska neurala föregångare markörer nestin, Sox2 och BLBP. Den största nackdelen med den monolagerkultur system jämfört med neurosfären analysen är att de enskilda förstadiepartiklama-härledda kloner inte kan följas och kvantifieras.
En nackdel med de flesta protokoll för båda typerna av kulturer har varit nödvändigt att använda relativt stort antal djur, eftersom avkastningen av isoleringsstrategier har ofta varit dålig. Samtidigt har det blivit tydligt att vuxna neurogenes bidrar till individualisering av hjärnan 9, vilket resulterar i behovet av individuellt ex vivo-modeller också. Dessa behov kan tillgodoses genom "en-mus-en-kultur"-protokoll som beskrivs i denna rapport.
Följande visuella protokoll beskriver samtidig framställning av neurala föregångare kulturer från både SVZ och GD för enskilda djur antingen som vidhäftande monolayers eller i form av neurosfärer. Den generation av kulturer från enskilda djur är särskilt användbart när jämförelser mellan individuellt behandlade djur eller olika individuella transgena eller vildtyp möss krävs. Detta protokoll innehåller detaljerade instruktioner för samtidig microdissection av SVZ och GD regioner från vuxna möss, deras avståndstagande till en enda cell suspension, in vitro-kultur som antingen vidhäftande encellslagsodlingar eller neurosfärer och analys av multipotentialitet och långsiktig potential, de två kardinal egenskaperna hos ett ben fide stamceller.
Denna uppsats presenterar ett detaljerat protokoll för att inleda neurala föregångare kulturer, såväl som vidhäftande monolager och neurosfärer, från de två stora neurogena regioner av den vuxna musen hjärnan. Det finns ett antal viktiga punkter som måste hållas i åtanke när du försöker någon av dessa in vitro odlingssystem. För det första är valet av dissociation metod mycket viktigt och är vävnadsberoende. I våra händer, är 0,05% trypsin-EDTA mycket effektivt för dissociation av SVZ vävnad, och resulterar i ett större antal neurosfärer än när man använder ett papain baserad dissociation teknik. För dissociation av GD vävnad dock rekommenderar vi starkt en papain baserad dissociation strategi. Vid direkt jämförelse mellan de två dissociation metoder på GD vävnad, observerade vi en betydligt lägre avkastning på levande celler och ungefär 10 gånger färre neurosfärer vid användning av trypsin. Denna skillnad i dissociation skulle kunna bero på skillnaden i vävnads composition mellan de två regionerna. Den kompakta vävnaden i GD omges av omfattande neuropil och omfattande skador av cellulära processer kan förekomma under dissociation.
En annan viktig punkt att notera är att även om neurosphere analysen kan vara bra att göra kvantitativa uttalanden om antalet prekursorceller som finns i ett givet vävnadsprov, viss försiktighet måste dock användas i tolkningen av dessa absoluta tal. Fusion av neurosfärer kan vara en viktig påverkande faktor. Flera studier har visat att nervceller är mycket rörliga och kan smälta, även under vad är förment "klonala" villkor 7,19. Det resulte neurosphere frekvens kan vara mycket beroende av faktorer inklusive mellankomponenter, dissektion förfarandet och dissociation processen. Även mellan erfarna lastare viss variation i antalet neurosfärer som genereras från förment identiska prover är uppenbar (se figur 1A.) Mer användbart, är en direkt jämförelse av utgångsfrekvensen mellan två givna prover (dvs. styrning kontra behandlad eller vildtyp kontra knock-out) hanteras av samma person i ett enda experiment, snarare än en kvantitativ rapport över total prekursorcell nummer.
När man beslutar vilken av de två odlingsmetoder är mest lämpad för ett visst experiment är det viktigt att notera att dessa två kultursystem skiljer sig åt i homogeniteten i de celltyper som genereras. I jämförelse med prolifererande vidhäftande cellkulturer, som visar en i stort sett homogen prekursorcell pool (~ 98% av cellerna är Sox2 +) 20, neurosfärer är mer heterogen och innehåller, liksom prolifererande prekursorceller, differentierade neuroner och astrocyter 21,22. Det är viktigt att de neurosfärer inte är odlade under längre perioder mellan passager som den större neurosfären blir desto mer sannolikt är det att hitta differentierade celltyper i sin kärna.
Vi initierar traditionellt vidhäftande monolayer neurala föregångare kulturer från GD vävnaden på mellan 5-8 möss. Därför, när man försöker fastställa de vidhäftande monolayer kulturer från GD eller SVZ av en enda mus, behöver den största omsorg som skall vidtas under det vävnadsdissociering förfarandet för att undvika överdriven celldöd orsakad av över finfördelning av vävnad, eller ta förlängas perioder mellan dissektion och slutliga odlingssteg. Detta protokoll beskriver, för första gången, generering av vidhäftande monolager föregångare kulturer från både SVZ och GD för enskilda djur. Det finns många tillfällen när jämförelsen av prekursor proliferation och differentiering måste göras på ett enda djur basis. Dessa inkluderar möjligheten att direkt jämföra GD och SVZ enskilda djur med hjälp av parade statistik och för att koppla ihop kultur data med enskilda beteendemässiga eller fysiologiska data 9. Enstaka djur kulturer också allåg användning av sällsynta transgena djur, där ålders-matchning en pool av 5-8 donatorer per kultur inte är möjligt, samt unika djur (t.ex. F2 kors eller ut uppfödda djur) för genetiska associationsstudier.
The authors have nothing to disclose.
TLW fick stöd av ett Marie Curie International Incoming Fellowship. Arbetet finansierades också från grundläggande institutionella medel, Bundesministerium für Bildung och Forschung (BMBF) finansiering och dels med stöd från Priority Research Program (SFB) 655 till GK. Författarna vill tacka Anne Karasinsky för vård och underhåll av alla djur som användes i denna studie och Odette Leiter, Susann Ruhwald, Fanny Böhme, och Richard Wetzel för cellodling och mikroskopi assistans.
CONSUMABLES | |||
poly-D-lysine | Sigma | P7280-5MG | |
laminin | Roche | 11243217001 | |
glass pastuer pipettes | Volac | BS5732 | |
DMEM:F12 (1:1) 1X | Life Technologies | 21331-020 | |
Neural Basal Medium (1X) | Life Technologies | 21103-049 | |
B27 supplements (50X) | Life Technologies | 17504-044 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050-038 | |
Heparain | Sigma | H3393 | |
Penacillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
bFGF | PeproTech | 100-18B | |
0.05% trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
DNaseI | Roche | 10104159001 | |
Accutase | PAA | L11-007 | |
Papain | Worthington | LS003120 | |
Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
HBSS (with Calcium & Magnesium) | Life Technologies | 14025-050 | |
Glucose | Roth | X997.2 | |
HEPES | Sigma | H3375-500G | |
NaHCO3 | Merck | K39347429847 | |
1mL syringes | Braun | 2016-10 | |
27 Gauge needles | Braun | 4657705 | |
scalpels (#22 disposable) | Braun | BA222 | |
Dumont #7 forceps | FST | 11271-30 | |
Dumont 5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
scissors | FST | 14060-10 | |
Iris spatula | FST | 10093-13 | |
70% ethanol | |||
PBS | Life Technologies | 14040-091 | |
flasks/well plates | TPP | 92696 | |
PFA (4%) | Sigma | P6148 | |
hemocytometer | Marienfeld | 650010 | |
trypan blue (0.4%) | Sigma | T8154 | |
NDS | Millipore | 530 | |
TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
mouse monoclonal bIII-tubulin antibody | Promega | G712A | |
rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody | Dako | 20334 | |
O4 | R & D systems | MAB1326 | |
Map2a+b | Sigma | M1406 | |
donkey anti-mouse Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-505-151 | |
donkey anti-rabbit Alexa488 | Dianova | 711-545-152 | |
4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | 861405 | |
Aqua Polymount | Polysciences Inc | 18606 | |
10 ml Combi tips | eppendorf | 30089677 | |
plastic 10ml and 25mL serological pipettes | Corning | 4488/4489 | |
EQUIPMENT | |||
Pipetboy | Integra biosciences | 521942 | |
multidoser pipette | eppendorf | ||
37C waterbath | |||
dissecting microscope | |||
37C:5%Co2 incubator | |||
centrifuge | eppendorf | 5810R |