Een preklinische, muizenmodel van levermetastasen uitgevoerd via een hemispleen injectietechniek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een preklinisch muizenmodel van levermetastasen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Talrijke muismodellen zijn ontwikkeld om menselijke kankers bestuderen en bevorderen het begrip van kankerbehandeling en ontwikkeling. Hier wordt een preklinische murine alvleesklier tumor model van levermetastasen via een hemispleen injectie van syngene muizen pancreas tumorcellen beschreven. Dit model bootst veel van de klinische toestand van patiënten met gemetastaseerde ziekte aan de lever. Muizen consequent ontwikkelen metastasen in de lever waardoor het onderzoek van het metastatische proces, experimentele therapie testen, en de tumor immunologie onderzoek.
Inleiding
Pancreas ductaal adenocarcinoom (PDA) is de vierde belangrijkste oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten 1. De vijf jaars overleving voor patiënten met gemetastaseerd PDA is 2-12% 1. Hoewel adjuvante en neoadjuvante chemotherapie voor pancreaskanker is effectiever dan ooit, er nog steeds een enorme behoefte aan nieuwe therapieën.
De ontwikkeling van nieuwe therapieën vereist betrouwbare preklinische diermodellen. Hoewel subcutane tumor modellen eenvoudig te gebruiken, nadelen omvatten het onvermogen van deze tumoren metastaseren en bootsen de tumorprogressie en micromilieus gezien in humane kankers. Genetisch gemanipuleerde modellen, zoals genetisch gemanipuleerde muis die Kras en p53 knock-in oncogene mutaties (de KPC model) 2 en KPC model met een YFP lineage tracer (de PKCY model) 3 oog op het onderzoek van natuurlijk voorkomende tumoren in immunocompetent muizen. Bovendien is de tumor micro-omgeving ongewijzigd en lijkt op die waargenomen in humane tumor progressie. Helaas, de timing van tumorontwikkeling varieert in deze modellen, waardoor het moeilijk experimentele therapieën bestuderen. Daarnaast terugkruisingen van deze muizen vergt een aanzienlijke hoeveelheid tijd en financiële inzet, wat niet altijd haalbaar is. Tenslotte geïmplanteerd xenograft PDA muismodellen noodzaken immunogecompromitteerd muizen, die zijn veranderd of afwezig tumor micro-omgevingen. Dientengevolge, de werkzaamheid van experimentele therapieën aangetoond in deze preklinische modellen vaak niet reproduceerbaar klinische proeven 4.
Dit hemisplenectomy muizenmodel gebruikt Panc02 tumorcellen, met een zeer tumorigene, methylcholanthreen-geïnduceerde pancreas tumorcellijn afkomstig van C57BL / 6 muizen 5, 6 zijn. Bovendien, andere muizen PDA cellijnen afgeleid van de KPC mice kan in dit model. Schulick et al. Hebben eerder ontwikkelde een hemisplenectomy techniek en creëerde een syngeen muismodel van darmkanker uitzaaiingen 7. Dit hemisplenectomy model (figuur 1) biedt consistente en gelijke tumorinoculatie in immunocompetente muizen zich lenen tot het onderzoek van nieuwe therapeutische middelen 7-10.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven in overeenstemming geweest met de richtlijnen van de Animal Care en gebruik Comite van de Johns Hopkins University, en de dieren werden in overeenstemming met de richtlijnen van de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van het Laboratorium Care (AAALAC) gehandhaafd. De chirurgische ingreep wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een operatiekamer die een minimum van vijftien luchtwisselingen per uur ondergaat. Alle instrumenten worden gesteriliseerd door autoclaaf voorafgaand aan de procedure en opnieuw met 70% ethanol in tussen elke muis gedurende de procedure. Alle muizen verwachting niet de chirurgische procedure overleven geëuthanaseerd onder CO2 gedurende 3 min gevolgd door cervicale dislocatie terwijl onder verdoving.
1 Celbereiding
- Resuspendeer Panc02 gekweekte cellen in fosfaat gebufferde zoutoplossing bij 2 x 10 7 cellen / ml, en houdt op ijs.
2 Muis Voorbereiding
- Dien Ketamine (100 mg / kg) gemengd met xylazine (10 mg / kg) intraperitoneaal 8-12 weken oude C57BL / 6 vrouwtjesmuizen in verdeelde doses.
- Controleer om te zien dat de teen knijpen terugtrekking reflex wordt afgeschaft om te zorgen dat de muis volledig verdoofd.
- Dien bijkomende doses van ketamine (100 mg / kg) gemengd met xylazine (10 mg / kg) indien nodig volledig verdoven de muizen.
- Solliciteer Puralube Vet zalf voor de ogen van de muizen om uitdroging te voorkomen, terwijl de muizen onder narcose.
- Scheer het operatiegebied van de muizen om verontreiniging van de wond te voorkomen.
- Prepareer het linker subcostal gebied van de incisie met 70% ethanol en jodium.
- Plaats een chirurgische doek rond de buik om steriliteit te handhaven.
3 Laparotomie
- Wordt besch subcostal insnijding overeenkomstig het linkeroor door de huid en door het peritoneum met een scalpel.
- Druk de milt door de incisie door toepassing gelijktijdige digitale pressure langs de craniale en caudale aspecten van de incisie.
- Zoek de milt bloedvaten aan de inferieure einde van de milt.
- Verdeel de milt door twee Horizon middelgrote ligeren clips in het midden van de milt voorzichtig om te voorkomen dat de milt bloedvaten in de milt polen beschadigen.
- Plaats de bovenste pool van de milt terug in het peritoneum om verontreiniging te voorkomen.
4 tumorinjectie
- Opstellen 150 ul van fosfaat gebufferde zoutoplossing in een 26 G x 5/8 "spuit.
- Opstellen 100 pl Panc02 (2 x10 6) cellen in dezelfde spuit handhaven de spuit rechtop te allen tijde gedurende de injectie.
- Dompel de naald op een 70% ethanol oplossing. De naald wordt ondergedompeld in 70% ethanol om steriliteit te waarborgen.
- Spuit de cellen langzaam in de blootgestelde hemispleen zijn zeker de spuit rechtop gehouden te allen tijde. De schuine kant van de spuige dient altijd gemeten wordt milt capsule te voorkomen injecteren van de cellen onder de milt. Een bleken van de milt en bloedvaten worden waargenomen na injectie.
- Verhoog de milt en breng een medium Horizon clip onder de milt naar de milt bloedvaten af te sluiten.
- Breng een kleine Horizon clip om de meest distale aspect van de pancreas en milt schepen.
- Afbinden van de pancreas en milt schepen uit de hemispleen door te snijden boven de Horizon clips.
- Plaats de muis in de 'side en irrigeren de incisie met gedestilleerd water.
5 Abdominale Sluiting en Herstel van Anesthesia
- Sluit het buikvlies met een 4-0 rijgsteek.
- Breng 02:58 huidklemmen de huid incisie te sluiten.
- Dien 0,1 mg / kg buprenorfine of 5-10 mg / kg Carprofen subcutaan postoperatieve pijn te verlichten.
- Plaats de muis op een verwarming pad voor recovery tot mobiele en de muis toont regelmatige ademhaling patronen. Dieren worden alleen terug naar het gezelschap van andere dieren na het volledig herstellen van de chirurgische procedure.
6 lijkschouwing Onderzoek en oogsten van de lever
- Tussen 30 tot 60 dagen na de operatie, zal beginnen muizen klinische symptomen van metastase vertonen en euthanasie vereist. Tekenen van gemetastaseerde ziekte waarbij humane euthanasie onder vergrote buik en de ontwikkeling van ascites. Euthanaseren muizen door inademing van CO 2.
- Na inhalatie, voeren cervicale dislocatie.
- Nadat het dier is vastgesteld niet responsief, een insnijding door het peritoneum de buik met een schaar bloot.
- Met behulp van een tang en schaar, voorzichtig snijd de lever uit de buik.
- Leg de lever in OCT compound, en flits bevriezen met vloeibare stikstof. Bewaar de lever bij -80 ° C. Als alternatief kan de live-r kan in 16% neutraal gebufferde formaline vastgesteld op kamertemperatuur 24 uur en in paraffine ingebed.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Panc02 tumorcellen geïnjecteerd in de hemispleen (figuur 1) vormen levermetastasen 100% van de muizen, terwijl longen en peritoneale metastasen niet waargenomen als de techniek goed wordt uitgevoerd. Deze techniek is vastgesteld bij meer dan honderd muizen middels Panc02 cellen in meerdere, onafhankelijke experimenten en reproduceerbaar, alle onbehandelde muizen sterven metastasen lever tussen 30 en 60 dagen na de hemisplenectomy procedure (figuur 2). Om statistische significantie tusse...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze preklinische muizenmodel van alvleesklierkanker metastase naar de lever via een hemispleen injectietechniek is het eerste model beschreven dat veel van de klinische en immunologische condities van patiënten met metastatische ziekte de lever spiegels. Dit model biedt verscheidene voordelen boven andere muizenmodellen. Ten eerste, in tegenstelling tot transgene modellen van pancreaskanker waarbij slechts 30% van de muizen ontwikkelen metastasen naar de lever en de timing van metastasen formatie is erg variabel, dit m...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen relevante belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
KF en KO zijn co eerste auteurs samen met KS
Dit werk werd mede ondersteund door de AHPBA Fellowship (KS), NIH K23 CA148964-01 (LZ), Johns Hopkins School of Medicine Clinical Scientist Award (LZ), Virágh Foundation en de Skip Virágh Pancreatic Cancer Center aan de Johns Hopkins (EMJ en LZ), de Nationale Alvleesklier Foundation (LZ), de Lefkofsky Family Foundation (LZ), het NCI SPORE in Gastro Intestinale Tumoren P50 CA062924 (EMJ, LZ), de Stichting Lustgarten (LZ), en de Sol Goldman Pancreatic Cancer Center subsidies (KS , BHE, LZ).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cell culture media en componenten | zijn afhankelijk van de cellijn | ||
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing | Gibco by Life Technologies | 10010-023 | |
| 15 ml centrifugebuizen | Corning | 430052 | |
| Gebogen operatie schaar | Roboz Surgical Store | RS-6835 | |
| Micro dissecerende Graefe tang | Roboz Surgical Store | RS-5130 | |
| Naaldhouder (normaal) | World Precision Instruments, Inc | ||
| 3-0 of 4-0 hechtdraad | ter beschikking gesteld door de afdeling chirurgie, Johns Hopkins | ||
| Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, klein, hoekig | Teleflex | 137085 | |
| Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, middelgroot, hoekig | Teleflex | 237115 | |
| Weck Horizon middelgrote ligating clips | Teleflex | 002200 | |
| Weck Horizon kleine ligating clips | Teleflex | 001200 | |
| Spuit, 1 cc, tb-spuit, 3/8" slip tip | Becton Dickinson | 309625 | |
| Spuit, 1 cc, tb-spuit, 5/8" slip tip | Becton Dickinson | 309597 | |
| 9 mm Autoclip Applier | Mikron | 427630 | |
| 9 mm Autoclip | Becton Dickinson | 427631 | |
| Verwarmingskussen | Sunbeam | CAT93 | |
| 70% Ethanol | verkocht door talrijke leveranciers | ||
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | 22395DD | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma | X1251 |
Referenties
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer. Cancer letters. 279, 1-7 (2009).
- Rhim, A. D., et al. EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation. Cell. 148, 349-361 (2012).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature reviews. Cancer. 7, 645-658 (2007).
- Corbett, T. H., et al. Induction and chemotherapeutic response of two transplantable ductal adenocarcinomas of the pancreas in C57BL/6 mice. Cancer research. 44, 717-726 (1984).
- Leao, I. C., Ganesan, P., Armstrong, T. D., Jaffee, E. M. Effective depletion of regulatory T cells allows the recruitment of mesothelin-specific CD8 T cells to the antitumor immune response against a mesothelin-expressing mouse pancreatic adenocarcinoma. Clinical and translational science. 1, 228-239 (2008).
- Jain, A., et al. Synergistic effect of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transduced tumor vaccine and systemic interleukin-2 in the treatment of murine colorectal cancer hepatic metastases. Annals of surgical oncology. 10, 810-820 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Selective targeting of antitumor immune responses with engineered live-attenuated Listeria monocytogenes. Cancer research. 66, 1096-1104 (2006).
- Yoshimura, K., et al. Live attenuated Listeria monocytogenes effectively treats hepatic colorectal cancer metastases and is strongly enhanced by depletion of regulatory T cells. Cancer research. 67, 10058-10066 (2007).
- Olino, K., et al. Tumor-associated antigen expressing Listeria monocytogenes induces effective primary and memory T-cell responses against hepatic colorectal cancer metastases. Annals of surgical oncology. 19, Suppl 3. 597-607 (2012).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer cell. 7, 469-483 (2005).
- Marion, A., Aoudi, W., Basarab, A., Delachartre, P., Vray, D. Blood flow evaluation in high-frequency, 40 MHz imaging: a comparative study of four vector velocity estimation methods. Ultrasonics. 50, 683-690 (2010).
- Zheng, L., et al. Tyrosine 23 phosphorylation-dependent cell-surface localization of annexin A2 is required for invasion and metastases of pancreatic cancer. PloS one. 6, e19390(2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
