Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

Published: May 4, 2015 doi: 10.3791/52610
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3,4, 1,2
1Department of Microbiology, University of Washington, 2Departments of Medicine and Laboratory Medicine, University of Washington, 3U.S Military HIV Research Program, Walter Reed Army Institute of Research, 4Henry M. Jackson Foundation

Introduction

Viral replikasyon spor belirli bir ortamda 1 enfeksiyon döl üretmek için bir virüs kapasitesi olarak tanımlanır ve zaman üzerinde 2 nüfus düzeyinde bir virüs çeşidi yaygınlığını belirlemede önemli bir faktör olduğunu. In vivo spor çalışmaları, HIV-1 olarak patojenik insan virüsler, çeşitli in vitro ve birlikte mümkün değildir ex vivo çoğaltma spor deneyleri ilaç direnci ve bağışıklık kaçış mutasyonları, epistazi ve evrim kaynaklanan fitness etkilerini incelemek için geliştirilmiştir viral popülasyonları 3-6. Farklı spor deneyleri arasında, büyüme rekabet tahlilleri in vivo 1,7,8 oluşur olarak iki veya daha fazla viral varyantları, tam olarak aynı çevre koşullarında aynı hücre popülasyonu için rekabet olarak, spor farklılıkları daha duyarlı ve geçerli önlemleri elde etmek için kabul edilmektedir. Büyüme rekabet deneyleri başlayarak birkaç variab önceles enfeksiyonunun farklı çokluklar (İçişleri Bakanlığı), viral giriş oranı, ve analiz için numune alma zamanlaması kullanımı dahil, tespit edilmesi gerekmektedir. Biz viral büyüme kinetiği üzerine ve rekabet deneyleri sonucu bu parametrelerin etkilerini inceledik ve hücre kültürü 9 HIV-1 fitness sağlam ölçümleri için gerekli anahtar faktörleri tespit ettik.

Deney değişkenleri ek olarak, büyüme rekabet deneyleri viral varyantları ölçülmesi için çeşitli yöntemler vardır. 10,11 Toplu veya klonal sıralama 12,13 faiz sitesinde (ler) nükleotid frekansları dayalı rekabet virüslerin oranını belirlemek için kullanılır olmuştur. Bağıl spor zaman bu oran değişiklik elde edilir. DNA dizileme hizmetleri yaygın olarak bulunmaktadır Bu yöntem uygundur. Paralel alel-spesifik dizilim (PASS) yöntemi birden fazla sitelerde sıralama ve rekombinantların 14 saptanmasına olanak 4,7,17,19 ayırt veya transkripsiyon kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ters etiketleri gibi 15 veya eşanlamlı mutasyonları 4,16-18 kullanmak bağımsız olarak sekans benzerliği suşları rekabet çalışma için geçerli yapılabilir her biri (RT-qPCR) 15,16,18,20. Ek bir adım viral genomları içine etiketleri tanıtmak için gerekli ve RT-qPCR tahlil ayrıca belirli maddeler ve enstrümantasyon gerektirir. Biz bulduk toplu Sanger dizileme verimleri karşılaştırılabilir sonuçlar 9.

Büyüme yarışma sonrasında, viral replikasyon spor göreli uygunluk veya t arasında fitness oranı olarak sunulmuşturvira varyantlar WO. bir virüs göreli spor aşı maddesi, ilk oran ya da iki rakip virüsler arasında net büyüme oranı farkı olarak normalleştirilmiş bir viral varyantın nihai oran olarak tanımlanabilmektedir. Biz ikinci yöntemi, sadece üstel büyüme fazında içinde uzunlamasına veri noktalarını kullanarak, en sağlam sonuçlar 9,20 ürettiğini gördük.

Vitro fitness deneyleri, biyolojik klonlar 6-8 ve HIV-1 bulaşıcı moleküler klonlar incelemek için öncelikle kullanılır. İkincisi, genetik manipülasyon için uygun olan, genellikle belirli bir mutasyon veya ilgi duyulan 3-5,21,22 spesifik dizilerinden uygunluk üzerindeki etkisini incelemek için kullanılmıştır. Aşağıdaki protokoller viral büyüme kinetikleri, bir dizi etiketi içeren HIV-1 vektörleri kullanarak yeni tam uzunlukta bulaşıcı HIV-1 molekül klonlar inşa ilgi mutasyonlar tanıtarak, viral stokları yapma ve kurma açısından bir iş akışını açıklarGöreli uygunluğu büyüme rekabet tahlili yapılması ve hesaplanması için (Şekil 1).

Optimize prosedürler kullanılarak, üç rekombinant HIV-1 mutantlar yarattı ve çoğaltma zindeliği belirledi. yeniden birleştirici molekül klonun ilk sentetik COTB (Merkez-of ile pNL4-3, HİV-1 laboratuar sarmalı NL4-3 tam uzunlukta enfeksiyon genomunu ihtiva eden bir plazmid HIV-1 Gag-p24 gen bölgesine değiştirilmesiyle yapılmıştır Ağaç, alt tip B) gag-p24 dizisi 23 prototip gerginlik yaratır. Tek amino değişiklikleri (T186M, T242N ve I256V) daha sonra üç mutant klonlar oluşturmak tanıtıldı. Her mutant verilen genetik arka planda her mutasyonun fitness etkisini gözlemlemek için prototip virüsüne karşı yarıştı edildi. Üç mutantlar prototip virüsü daha hafif anlamlı derecede düşük çoğaltma fsitness çeşitli düzeylerde göstermişlerdir. T242N mutasyonu, daha önce bir orta fitne olduğu bildirilmiştirss Bu çalışmada gösterilen sonuca benzer 24-26, maliyet. Diğer iki mutasyonun spor maliyeti, daha önce bildirilmemiştir.

Protocol

NOT: protokol, aşağıda tarif edildiği gibi, herhangi bir hasta tanımlayıcı bilgiler içermez ve bu nedenle Washington Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından İnsan Konular Araştırma veya İnsan Konular Bölümü kabul edilmez.

Kimerik HIV-1 NL4-3 Moleküler Klonların 1. İnşaat

1.1) büyütmek yerleştirin DNA fragmanını

  1. Kimerik primerler tasarlayın. 5 'hem de yarım ileri ve geri primerler parçası eklenir hangi bir HIV-1 vektör dizisini içerir. Primerlerin 3 'yarısı uç sekansı (Şekil 2) ucunu içermelidir. Kimerik primer sekans, özgün açık okuma çerçeveleri muhafaza emin olun.
    1. Ya da daha büyük 60 ° C'ye eşit olan bir erime sıcaklığı, ~ 50% GC içeriği ve astar dimerler, heterodimerler ve / veya firkete yapı oluşturmak için düşük bir eğilimi olan, uzunluğu primerler, en az 20 baz kullanın. Bu özellikleri değerlendirmekOligoAnalyzer web aracını kullanarak ( https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ).
  2. Kullanım PCR 27 ve kimerik primerler giriş DNA '(Şekil 2) çoğaltmak için. Her bir PCR reaksiyonu için 1X yüksek doğrulukta tampon, 0.2 mM dNTP, yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı 1 U ileri kimerik primeri, 0.5 uM, ters kimerik primerin 0.5 uM, ve uç bölgesi taşıyan DNA numunesinin 1 PG0 ng kullanımı. 50 ul'lik nihai bir hacme kadar dH 2 O ekleyin.
  3. Aşağıdaki gibi termal döngü aşamaları ayarlayın: 10 saniye boyunca 98 ° C'de bir ilk denatürasyon adımı bir DNA gerçekleştirin. 20 sn için iki primerin düşük erime sıcaklığının en az 3 ° C 'de 10 saniye ve DNA tavlama için 98 ° C' de bir DNA denaturasyon 30 devir ile yükseltin. 10 dakika boyunca 72 ° C'de son uzatma gerçekleştirin. 4 ° C'de saklayın PCR ürünleri.
  4. PCR ürünleri 5 ul alınBir önceki adım ve agaroz jel elektroforezi 28 çalıştırın.
    1. DNA büyüklüğü işaretleyici olarak, bir% 0.7 agaroz jeli, 1x TAE tamponu (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA), 0.5 ug / ml etidyum bromür (EtBr) nihai konsantrasyon ve 1kb merdiven kullanın. Elektrotlar arasında 5 V / cm mesafeye ayarlayın güç kaynağı gerilimi. Yükleme boya yaklaşık 2/3 jel uzunluğu boyunca göç zaman elektroforez durdurun. Bir jel dokümantasyon sistemi 28 kullanılarak jel gözünüzde canlandırın.
      NOT: EtBr şüphelenilen kanserojen ve düzgün kurum düzenlemeleri uyarınca, atılmalıdır. EtBr içeren jeller tutarken eldiven daima giyilmelidir. Malzemeyi içeren bitiş taşıma EtBr sonra yeni eldiven ve çapraz bulaşmayı önlemek için diğer malzemeleri veya işleme ekipmanı önce değiştirin.
  5. Arzu edilen PCR ürününe tekabül eden bir ebada sahip olan tek bir DNA bandı tespit edilirse, bu QIAquick PCR Saflaştırma Kiti uyum gibi bir ticari kit kullanılarak PCR ürününün geri kalanı saflaştırmaküreticinin protokollerine ing.
    1. Diğer spesifik olmayan bantlar da mevcutsa, preparatif jel elektroforezi çalıştırmak için PCR ürününün geri kalanı kullanın. Adım 1.1.4 belirtilen aynı parametreler ve koşullar kullanın. Jel kuyu ~ PCR ürünlerinin 45 ul yüklemek için yeterince büyük olduğundan emin olun. Ilgi bandı kesilmiştir ve üretici protokollerine göre QIAquick jel ekstre etme kiti kullanılarak jelden DNA ekstrakte edin.

1.2)) (Tam boy Enfeksiyonlu HIV-1 alt tip B Vektörü içine pNL4-3 insert fragmanı tanıtmak

  1. PCR primerleri olarak aşama 1.1.5 saflaştırılmış PCR ürünleri kullanın. Bir PCR reaksiyonunda şablon DNA olarak pNL4-3VifA 20 kullanımı ve diğer reaksiyon (Şekil 2) şablon olarak pNL4-3VifB 20 kullanımı. Her bir PCR reaksiyonu için, 1 x yüksek doğrulukta tampon kullanarak, 0.2 mM dNTP, yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı 2 U, primer DNA 500 ng ve nihai hacim içinde şablon DNA 50 ng50 ul ume. 10 dakika boyunca 72 ° C'de, ardından 10 saniye, 1 dakika ve 10 dakika boyunca 72 ° C, 48 ° C, 98 ° C 'de, 30 saniye için 98 ° C 35 döngü: termal döngü parametrelerinin ayarlayın.
  2. PCR reaksiyonu, 10 U DPN I 50 ul ekle ve şablon DNA sindirmek, 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Plazmid DNA bir metilasyon yetkili bakteri suşu, örneğin izole olduğundan emin olun., TOP10 kimyasal yetkili Escherichia coli.
  3. Kullanım Dpn Ben yetkili bakteri hücrelerini dönüştürmek için ürünü sindirilmiş. Top10 kimyasal yetkili E. ile ısı-şok dönüşümü kullanın E. coli, imalatçının protokolüne göre yöntem. Yeniden birleştirici plazmit ihtiva eden bakteriyel hücreleri seçmek için, 100 mg / L karbenisilin içeren Luria Broth (LB) kültür plakaları kullanılır.
    1. ~ 10 iyi ayrılmış koloniler ve 100 mg / L karbenisilin içeren 3 ml LB sıvı ortam içinde ayrı ayrı büyümek ve 30 ° C'de inkübe edinShaker O / N.
    2. Üreticinin protokolüne göre, bakteriyel sıvı kültürden plazmid DNA izole etmek için, QIAprep Spin Miniprep kiti kullanılarak.
  4. Plazmid DNA düzgün insert içerip içermediğini belirlemek için çift kısıtlama sindirimi 29 kullanın. Kısıtlama sahası yalnızca tek bir uç bölgesi içinde bulunmaktadır ve diğer kısıtlama alanı uç bölgenin dışında, HİV-1 vektörü içinde sadece bir kez bulunur olduğundan emin olun.
    1. 10 | il son reaksiyon hacmi içinde plazmid DNA Digest en az 300 ng. Seçilen restriksiyon enzimleri arasında, üreticinin protokolüne uygun olarak seçin kısıtlama tamponlar, inkübasyon sıcaklığı ve inkübasyon süresi. Adım 1.1.4 açıklandığı gibi sindirilmiş DNA ve çalıştırmak jel elektroforezi 9 ul alın. Tahmin boyutlarda DNA bantları var rekombinant plazmidler seçin.
  5. Sanger dizileme ile rekombinant plazmid dizisi bütünlüğünü onaylayın. Nadir, istenmeyen ikenmutasyon (lar), PCR reaksiyonları sırasında sokulabilir.
    1. Sekans plasmid DNA, her iki ip kolları. Sıralama primerleri dizayn etmek için adım 1.1.1.1 yönergeleri izleyin. Buna ek olarak, ileri sağlar ve sırasıyla rekombinant plasmid yukarı akış ve uç bölgesinin alt baş dizileme primerleri tavlama, en az 50 bp ters.
    2. Ticari bir DNA dizileme servis sağlayıcıya plazmid DNA ve sıralama primerleri gönderin. Servis sağlayıcı tarafından belirtilen DNA örneği ve primerler hazırlayın.
  6. Üreticinin protokolüne göre bir Endotoksin olmayan Plazmid DNA kit'i kullanılarak mutasyona uğramış plazmid DNA'nın bir endotoksin içermeyen stok yapmak. Takip eden aşamada transfeksiyonu için endotoksin içermeyen plazmid DNA, en az 1 ug hazırlayın.

1.3) tanıtmak Küçük Ölçekli Mutasyonları Via Mutajenezi Sitesi yönettiği

  1. İleri örtüşen ile mutajenik primerler tasarlayın ve istenen mutat içeren primerler tersiyon (lar). Taban (ler), ikame eklenen veya 10-15 homolog üsleri çevrili primerlerin ortasında silinecek yerleştirin. Adım 1.1.1.1 yönergeleri izleyin.
  2. Mutant plazmitleri sentezlenmesi için PCR kullanarak. Her bir PCR reaksiyonu için, 1 x yüksek doğrulukta tampon kullanarak, 10 mM dNTP, yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı 2 U ileri mutajenik primerin 0.5 uM, ters mutajenik primerin 0.5 uM ve kimerik pNL4-3VifB 50 ng, aşamada 1.2.6 gelen 50 ul nihai hacim içinde. 10 dakika boyunca 72 ° C'de, ardından 10 saniye, 1 dakika ve 10 dakika boyunca 72 ° C, 48 ° C, 98 ° C 'de, 30 saniye için 98 ° C 25 çevrim: termal döngü parametrelerinin ayarlayın.
  3. Adımı yineleyin 1.2.6 ile 1.2.2.

Viral Stokta 2. Nesil Transfeksiyon kullanma

  1. Gerekli viral stok istenen ve plazmid DNA miktarını hesaplayın. 10 4 IU / ml ya da daha yüksek, bir viral titresi ile viral stok 1.8 ml büyüme rekabet assa iki set için yeterlidirys, monoinfections dahil olmak üzere her üç nüsha olarak yapılır. 6-çukurlu plaka içinde yapılan bir transfeksiyon için, yaklaşık 1.8 mi süpernatan oyuk başına hasat edilir. Plazmid DNA, bir ug 6-çukurlu plaka içinde yapılan her bir transfeksiyon için gereklidir.
  2. 6 gözlü bir plakanın her bir oyuk için transfeksiyon karışımı, örneğin, 100 ul hazırlar., Plazmid DNA ve serum içermeyen DMEM içinde 1 ug, 1 ul X-tremeGENE 9 transfeksiyon reaktifi (ya da benzer ürün) 'den oluşan.
    1. Oyuk başına 1 | ig plazmid DNA kullanılarak gerekli plazmid DNA hacmini belirler. Plazmid DNA 'nın nihai konsantrasyonu, en az 50 ng / | il olduğundan emin olun.
    2. Serum-barındırmayan ortam (DMEM) de aşağıdaki formüle göre gerekli ne kadar belirler: ul = 100 ul DMEM toplam hacmi - ul DNA hacmi.
  3. 6-çukurlu plaka 10 6 HEK 293T-17 (ATCC) hücresi / yuva yayılma ortamı (DMEM +% 10 cenin sığır serumu (FBS)) 2 ml ilave edilir. Bir 37 ° C 'de 1 saat süre ile inkübe% 5 CO 2 atmosfer. Gerektiğinde (adım 2.1 belirlenen) gibi çok sayıda çukur tohumu.
  4. Transfeksiyon karışımı hazırlandı 1.8 ml polipropilen mikrosantrifüj tüpü içine, yukarıda hesaplanan, serumsuz DMEM uygun hacimde bir sıvı bölüntü, ve daha sonra transfeksiyon reaktifi ekleyin.
    1. Pipet reaktif doğrudan medya çözüm içine, mikrosantrifüj tüp plastik yüzeye eklemeyin. Geçen plazmid DNA ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı yavaşça çözüm karıştırmak için. Transfeksiyon komplekslerinin oluşmasını sağlamak için 15 dakika oda sıcaklığında (25 ° C, 15 ° C) inkübe edin.
    2. 6-kuyucuklu plakaya döllenmiş hücrelere damla damla bir tarzda karışımı ekleyin. Hafifçe çalkalayın veya transfeksiyon komplekslerinden eşit dağılımını sağlamak için kuyu girdap.
    3. Naylon ile Seal plakalar.
  5. 48 saat boyunca bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de kültürleri inkübe edin.
  6. Dikkatli bir şekilde toplamak ve bir 15 ml tüp Throu süpernatantı aktarmak için bir pipet kullanın0.22 um'lik bir filtre üst gh.
  7. Kapaklarında lastik conta ile 1.8 mi mikrofüj tüplere süzüldü süpernatan 250 ul veya daha fazla transfer pipet kullanın.
  8. Mağaza kullanılana kadar -80 ° C 'de süpernatanların süzüldü.

3. Periferik Kan Mononükleer Hücreleri üzerinde Viral Stoklar Enfeksiyon titresi (PBMCler) belirleyin

  1. Fitohemaglütininle (PHA) ile PBMC'leri Canlandıracak. Bir viral stok, tohum tamamlandı Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı 2 x 10 6 PBMC'ler başına (cIMDM insan interlökin 2 20 U / ml ile takviye edilmiş IMDM (hIL-2),% 10 fetal büyükbaş hayvan serumu ve% 1 penisilin / streptomisin) desteklenmiş PHA (1.5 ug / ml) ile. 2 x 10 6 hücre / ml'de Tohum PBMC'ler. 72 saat boyunca bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe edin PBMC'ler.
  2. Hasat PHA PBMC'leri uyarılmış. 50 ml konik bir tüp yapışmayan PHA PBMC aktarın. 10 dakika boyunca 228 xg'de tüp Spin. Dikkatle disruptin olmadan süpernatant kaldırmakg hücre topağı. CIMDM 2 x 10 5 PBMC / ml lik bir nihai konsantrasyonda, hücre topağı yeniden askıya.
  3. Tohum, 2 x 10 4 PHA yuvarlak tabanlı 96-kuyulu bir levhadaki PBMC / oyuk 100 ul / kuyucuk cIMDM uyarmıştır.
  4. Viral stoklar 1:10 seyreltme olun. Daha sonra, önce seyreltilmiş stok, 96 çukurlu bir ana levha, on iki 3-kat seri seyreltiler. Bu seyreltme şeması, ml başına 10 Nisan - 10 Haziran enfeksiyöz ünite (IU) aralığında viral titreleri tespit etmek için önerilmektedir.
    1. Örneğin, 1.5 ml bir tüp içinde 180 ul ortama virüs stokunun 20 ul ekle. Dikkatle pipetleme seyreltme karıştırın. Sonra ilk kuyunun 180 ul ortama seyreltilmiş hisse 90 ul transferi ve Pipetleme tarafından iyice karıştırın.
    2. Bir sonraki oyuk 180 ul ortama mevcut kuyudan on kez daha 90 ul aktarma ile seyreltme serisi devam edin. Artış veya ilk seyreltme azaltmak durumunda 10 6 IU / ml daha yüksek titreleriveya daha düşük bir 10 4 lU / ml, sırasıyla beklenmektedir.
  5. Dört nüsha olarak (adım 3,3) numaralı seribaşı PBMC'leri plakasına ana seyreltme plaka seri seyreltilmiş viral stokunun 40 ul ekleyin. 16-24 saat boyunca bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe edin.
  6. Dikkatle her gözden üst fazın 100 ul kaldırmak ve / oyuk 200 ul toplam hacimde taze cIMDM 160 ul ile değiştirin. CO2 atmosferinde% 5 (gün 1), 37 ° C'de inkübe edin.
  7. Günde 4, 7, 10 ve 13 aktarma her bir oyuğa 100 ul bozulması tamponu (PBS içinde% 2 Triton X-100), üstte yüzen madde 100 ul ve taze cIMDM 100 ul ile değiştirin üzerinde. -20 ° C'de süpernatantlar saklayın.
    1. Örnekleme ve titre stabilize kadar her üç günde bir, taze cIMDM eklemeye devam edin.
  8. Gün 7 ve 1 ile p24 ELISA ile, viral stoklar% 50 doku kültürü enfeksiyon dozu (TCID50) belirlemek3 örnek olarak aşama 4'te tarif edilen.
    1. Gün 13 elde TCID 50 günden 7 den titre açıkça daha yüksek ise, virüs stok genişletmek için daha uzun bir zamana ihtiyacı olabilir. İki örnekleme zaman noktalarında bulaşıcı titreleri istikrarlı (veya düşüş) olmak kadar daha sonraki örnekler kullanılarak p24 ELISA tekrarlayın. En yüksek titreleri ile örneklerinden seçin stokları.

4. ELISA Viral Enfeksiyon titresinin belirlenmesi için, HIV-1 p24 tespiti (immünoabsorban tahlil enzim-bağlı)

Not: Aşağıdaki protokol laboratuarımızda 30'da hazırlanan p24 antijen yakalama plakaları kullanılarak geliştirilmiştir. Ticari HİV-1 p24 ELISA plaka / kitleri, aynı zamanda, imalatçının protokolü takip kullanılabilir.

  1. Örnekleri ile çalışmaya başlamadan önce, çalışma stokları birincil antikor (tavşan anti-HIV-1 p24 SF2 antiserum) hazırlanması.
    1. Oda sıcaklığında çözülme p24 antiserumu.
    2. Fosfata içinde% 10 FBS, 2 ml gliserol, 2.5 ml karıştırıne tamponlu serum fizyolojik (PBS).
    3. Antiserumun 0.5 ml ilave edilir ve karıştırılır.
    4. Mağaza -20 ° C 'de parçalar 1 mi.
  2. 37 ° C kuluçka makinesi içinde aşama 3,7 çözülme örnekleri.
  3. P24 yakalama plakasının (% 0.05 Tween-20 ile 1 x PBS) yıkama tamponu ile 5 kez yıkayın.
  4. 50 | il / göz numune seyreltici (% 1 sığır serum albümini (BSA),% 0.2 Tween-20, RPMI-1640 içinde), daha sonra uygun oyuklara örnek 50 ul ekle. Yalnızca alay / negatif kontroller olarak numune seyreltici ile en az üç kuyu ekleyin. 4 ° C 'de 37 ° C ya da O / N C'de 2 saat süreyle inkübe edin.
  5. Kullanmadan önce taze birincil antikor çözüm hazırlayın. Birincil antikor, bir seyreltici (RPMI-1640 içinde% 12 FBS) ile stok çalışan birincil antikorun 2000 kat seyreltme: 1 olun. 96 oyuklu bir plaka içerisinde her bir örnek / kontrol başına 100 ul çözeltisi kullanılmak için yeterli hazırlamak için emin olun.
    1. Örneğin, birincil antikor worki 5 ul, tek bir 96-çukurlu plaka için yeterli solüsyon yapmak için10 ml değerindeki bir son hacim için birincil antikor seyreltici stokları ng.
  6. Yıkama tamponu ile yakalama plaka 5 kez yıkayın.
  7. Her bir oyuğa birincil antikor solüsyonu, 100 ul ekle. % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 1 saat süreyle inkübe edin.
  8. Kullanmadan önce taze ikincil antikor çözüm hazırlayın. İkincil antikor, bir seyreltici (% 7 FBS RPMI-1640 içinde% 0.01 Tween-20) ile ikincil antikor (1 mg / ml Keçi anti-tavşan HRP) ve 14,400 kat seyreltme: 1 olun. Pipetleme hataları azaltmak için, iki aşamalı bir seri seyreltme gerçekleştirin. 96 oyuklu bir plaka içerisinde her bir örnek / kontrol başına 100 ul çözeltisi kullanılmak için yeterli hazırlamak için emin olun.
    1. Örneğin, birinci ikincil antikor seyreltici 99 ul ikincil antikor 1 ul, tek bir 96-çukurlu plaka için yeterli solüsyon yapmak için. Daha sonra 10 ml değerindeki bir son hacim için ikincil antikor seyreltici ilk seyreltme 70 ul ekle.
  9. Yıkama yakalama levhası 5 timyıkama tamponu ile es.
  10. Her bir oyuğa, ikincil antikor çözeltisinin 100 ul ekle. % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de 1 saat süreyle inkübe edin.
  11. Plakayı yıkama tamponu ile 5 kez.
  12. RT TMB alt-tabaka 100 ul ekle. Işıktan korumak için kapalı bir kapta, oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkalayın.
  13. RT durdurma çözeltisi (1 NH2 SO 4), 100 ul ekle.
  14. Her bir göze, bir mikrolevha okuyucusu kullanarak 450-650 nm'de absorbans okuyun. Her sıra enfekte veya bulaşmamış puan absorbans değerini kullanın. Absorbans değeri negatif / sahte kontrol kuyulardan okunan değerden en az üç kat daha fazladır ise bulaşıcı virüs içeren bir kuyu düşünün. Reed-Meunch yöntemi 31 kullanılarak viral stokunun TCID 50 hesaplayın.

5. Viral Büyüme Kinetiği kurulması

5.1) Monoinfection

  1. Tohum 3 x 10 5 PHA ile uyarılan PBMC / oyuk, 48 oyuklu bir plaka içerisinde/ oyuk 500 ul toplam hacim içinde s. Aşılama kadar,% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de kültür plakaları tutun.
  2. Her bir virüs için, cIMDM 2 ml 6000 IU ihtiva eden bir aşı hazırlanması.
  3. Numaralı seribaşı hücreleri inokulum (1,500 IU) 500 ul ekleyerek üç nüsha olarak kuyu aşılamak. Enfekte hücre kültürünün nihai hacim de, 1 ml / ve MOI 0.005.
  4. Kısım yedek olarak kaydedilir biri RNA izolasyonu için, iki 96-yuvalı plakalar, her kalan inokulum 200 ul.
  5. 16-24 saat boyunca bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de kültürleri inkübe edin.
  6. Yıkama kültürleri aşılamadan sonra 16-24 saat.
    1. Çıkarın ve kültür yüzer 750 ul atın.
    2. Taze cIMDM 750 ul ekleyin. 300 x g 'de 10 dakika süre ile plastik örtü ve spin plakaları sarın. Çıkarın ve 750 ul süpernatant atın.
    3. Taze cIMDM 750 ul ekleyin. % 5 CO2 seviyesinde 37 ° C'de inkübe edinmosphere (gün 1).
  7. Günlük günden 2 güne 7 örnek kültürleri.
    1. 1.8 ml'lik bir santrifüj tüpüne kültür yüzey 500 ul aktarın. 3,000 x g'de 1 dakika için spin.
    2. Aktarım RNA izolasyonu için 96 oyuklu iki örnek plakalara hücresiz süpernatan 200 ul, daha yedek olarak tek bir plaka tasarrufu sağlar. RNA izolasyonu kadar -80 ° C'de saklayın supernatantlar.
    3. Her kültürün 500 ul taze cIMDM ekleyin. % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe edilir.
    4. Deneyin sonunda Wescodyne içine kültürleri atın.
    5. Üreticinin standart bir protokol, aşağıdaki yüzer 200 ul (örneğin, QIAamp viral RNA Mini Kit olarak kullanımı, ticari kitler) RNA izole edin. Numunelerin büyük bir sayısı için, Qiagen QIAxtractor kullanın.
    6. CDNA sentezi kadar -80 ° C'de saklayın RNA örnekleri.

5.2) cDNA Sentezi (Ters Transkripsiyon)

  1. Her RNA s içinGeniş, viral RNA'nın 10 ul (7995 5'-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3 ', HXB2 nükleotid 7968) dNTP 1.2 nmol ve cDNA sentezi primerin 1.2 pmol ekleyin. 14 ul'lik nihai bir hacme kadar su ilave edilir. Mix ve tüpün alt kısmında sıvı toplamak için kısaca dönmeye tüp Flick.
  2. Ana karışımı hazırlanana kadar daha sonra 4 ° C'de tutun, 65 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe karışımı.
  3. 5x birinci zincir tamponu (250 mM Tris-HCI, pH 8.3, 375 mM KCI, 15 mM MgCI2), 5 mM DTT, 120 SuperScriptIII U ve 240 U RNaz inhibitörü kullanılarak ana karışımı hazırlayın. 10 ul nihai hacme kadar su ilave edilir.
  4. Mix ve toplamak için dönmeye RNA karışımı, fiske ana karışımı 10 ul ekleyin.
  5. CDNA sentezine izin vermek üzere, 50 ° C'de 90 dakika süreyle inkübe karışımı. Ters transkriptazı inaktive edilmesi için 70 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Gerektiğinde 4 ° C'de tutun.
  6. Karıştırmak Rnase H, fiske 2 U ekleyin ve sonra toplamak için dönerler.
  7. 20 dakika kuluçkalayın37 ° C'de ilave edildi. -20 ° C'de saklayın cDNA.

5.3) cDNA kantitasyonu qPCR Sisteminin Kullanılması

  1. Standart bir seyreltme serisi hazırlayın. / 3 x 10 6 kopyaları, seri seyreltme 10 kat pNL4-3VifA 30 kopya / ul, aşağı ul arasında yapın. Dilüsyonları için distile su kullanın. Kullanmadan önce taze standart dilüsyon serisi hazırlayın ya da küçük gruplar hazırlamak ve -20 ° C'de tutmak. Do not standartları en fazla üç kez dondurma-çözülme.
  2. 96 oyuklu bir plaka qPCR Reaksiyon ayarlayın. Her bir plaka en azından her bir cDNA örnek bir kopyasını negatif kontroller arasında, en az bir kuyu, standart bir seyreltme serisi bir üç kopya içerir ve emin olun.
  3. Her qPCR reaksiyon için, qPCR ana karışımı 12.5 ul, 0.2 uM probu, ileri ve geri primerler, 0.8 uM, her ve cDNA, 1 ul ya da (de negatif kontrol için), standart seyreltme serisi ya da su / tampon kullanır. 25 ul'lik nihai bir hacme kadar su ilave edilir. qPCR prob ışık sen olduğunusas. Kapalı bir kapta tutun.
    1. VifAB ileri primer (GGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACT), Vifa ters primeri (5'-AGGGTCTACTTGTGTGCTATATCTCTTTT-3 ') ve VifAB probu (6FAM-5'-CTCCATTCTATGGAGACTC-3: pNL4-3VifA dayalı moleküler klonundan türetilen cDNA'nın tespit etmek için, Vifa primer sondası kullanımı '-MGBNFQ). VifAB ileri primer, prob ve VifAB VifB ters primeri (5'-CACCTGCGTGCTATACCTTTTCT-3 '): pNL4-3VifB göre klondan türetilen cDNA için, VifB primer sondası kullanılır.
  4. 2 dakika, 10 dakika boyunca 95 ° C, 15 saniye, 1 dakika için 60 ° C, 95 ° C, 40 döngü için 50 ° C'ye kadar PCR çevrim parametreleri ayarlayın. QPCR makinenin çalışması için üreticinin destek belgesini danışın.
  5. Üç nüsha standart dilüsyon serisi verileri kullanılarak standart bir eğri hesaplayın. Kopya sayısını belirlemek için, standart eğrisine cDNA örnek amplifikasyonu verilerini karşılaştırın. Dekar için üreticinin destek belgesini danışınta işleme.

5.4) Viral Üstel Büyüme Faz belirleyin

  1. X-ekseni ve Y ekseni boyunca cDNA kopya sayısı boyunca örnekleme gün viral büyüme kinetiği arsa ve viral üstel büyüme fazı tespit yani. Viral cDNA üstel ilerlemesinde numaraları artış kopyaladığınız zaman.
  2. GRC web aracı (kullanın http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ viral büyüme oranı (g) hesaplamak için). Bu uygulamada, GRC aracı cDNA girdi olarak en az iki zaman noktasında numaraları kopyalama kabul eder ve viral büyüme oranını (g) verir. Doğru büyüme oranlarını elde etmek için (yukarıda adım 5.4.1 bakınız) üstel büyüme fazında içinde sadece zaman noktası verilerini kullanın. GRC web aracında kullanılan matematiksel modelin bir ayrıntılı bilgi için, 20 bkz.

6. Büyüme Rekabet Tahlili

  1. Tohum 3 x 10 5 </ Sup> PHA uyarımlı PBMC (veya 1 x 10 5 CEMx174 hücreleri), bir 48 oyuklu düz tabanlı plaka içinde çukur başına 500 ul toplam hacim içinde.
  2. Aşılama kadar,% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C plaka tutun.
  3. Her virüs için, 6.000 IU içeren inokulum 3 ml hazırlamak.
  4. Çift enfeksiyonu inokulum oluşturmak için steril bir tüpe, her viral inokülüm 1.5 ml aktarın. Bir 48-yuvalı plaka içinde 3 x 10 5 hücre İkili inokulum (1,500 IU) 500 ul ekle. Son kültür hacmi de / 1 ml'dir. Kısım RNA izolasyonu için, iki 96-yuvalı plakalara inokulum 200 ul; Bir yedekleme olarak bir tabak kaydedin.
  5. 16-24 saat boyunca bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de İnoküle hücreleri inkübe edin.
  6. Yıkama kültürleri aşılamadan sonra 16-24 saat.
    1. Çıkarın ve kültür yüzer 750 ul atın.
    2. Taze cIMDM 750 ul ekleyin. 300 x g de 10 dakika süre ile plastik örtü ve spin plakaları sarın. Çıkarın ve 750 atın81 l yüzer madde.
    3. Taze cIMDM 750 ul ekleyin. % 5 CO2 atmosferi (gün 1), 37 ° C'de inkübe edilir.
  7. Seçim örnekleme katı aşama 5.4.1 gözlenen üslü büyüme fazında içinde en az 3 zaman noktasını dahil etmek.
    1. Her numune için, adım 5.1.7 izleyin.
  8. Bölüm 5.2 de tarif edildiği gibi cDNA sentez gerçekleştirir.
  9. QPCR kullanılarak viral varyant oranını belirler.
    1. 3 x 10 6 kopya her adımda 10 kat seyreltilmesi, üçlü olarak standart bir seri seyreltme serisi hazırlayın / 30 kopya / pNL4-3VifA ul ul.
    2. 96 oyuklu bir plaka qPCR Reaksiyon ayarlayın. Her bir levha, en az bir negatif kontrol, üç kopya halinde, standart bir seyreltme serisi, her bir cDNA numunesinin çiftleri içerdiğinden emin olun.
    3. Her qPCR reaksiyonu için, qPCR Master Mix 12.5 ul, 0.2 uM prob, 0.8 ileri uM her ve primerler ters ve cDNA 1 ul ya da standart d kullanın ilution serisi veya (negatif kontrol kuyuları için) su / tampon eklendi. 25 ul'lik nihai bir hacme kadar su ilave edilir. qPCR prob kapalı bir kapta saklayın, ışığa karşı hassastır.
      1. Negatif kontroller ve standart seyreltme serisinde ve cDNA numunesinin bir kopyası ile sinyalleri algılamak için Vifa primer-prob kullanın. CDNA numunesinin diğer kopyası ile VifB primer-prob kullanın.
    4. 15 saniye ve 1 dakika için 60 ° C, sonra 95 ° C 40 döngü, 10 dakika boyunca, daha sonra 2 dakika süre ile 50 ° C arasında 95 ° C PCR çevrim parametreleri ayarlayın ve. QPCR makinenin çalışması için üreticinin destek belgesini danışın.
    5. Standart seyreltme serisi büyütme verilerini kullanarak standart eğri hesaplayın. Kopya sayısını belirlemek için, standart eğrisine cDNA örneklerinin yükseltme verilerini karşılaştırın. Veri işleme için üreticinin destek belgesini danışın.
    6. (GRC web aracını kullanınol.washington.edu/grc/">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/) göreceli viral uygunluğu (d) hesaplamak için.
      NOT: GRC aracı cDNA girdi olarak en az iki kez noktasından numaraları veya kromatogram tepe yükseklikleri kopyalama kabul eder ve iki virüs arasındaki net büyüme oranı farkı (d) verir. Aracı iki zaman noktası verileri net büyüme oranını hesaplamak mümkün olmakla birlikte, bu güçlü üç veya daha fazla zaman noktasında giriş verileri için tavsiye edilir. Üstel büyüme fazında içinde zaman noktalarında elde edilen tek verileri kullanın doğru büyüme oranları elde etmek için (adım 5.4). GRC web aracında kullanılan matematiksel modelin bir ayrıntılı bilgi için, 20 bkz.
  10. Kromatogram tepe-yükseklikleri kullanılarak viral oranlarını belirleme
    1. PCR HIV-1 VifFwd kullanılarak VifAB dizi etiketi ihtiva eden vif fragmanları amplifiye (5'-GAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGG-3 '; HXB2 5266-5291 pozisyonlar) ve VifRev primerler (5'-GTCTTCT GGGGCTTGTTCCATCTGTCC-3 '; HXB2 pozisyonları 5579-5553).
      1. Her bir PCR reaksiyonu için cDNA 1 ul, 1 x NH4 tamponu, her bir primerden 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, U Taq Polimeraz 2.5, ve 0.45 um kullanımı. 50 ul'lik nihai bir hacme kadar su ilave edilir.
      2. 30 sn için, 15 sn için 94 ° C 'de 34 döngü izledi 1 dakikada, 1 dakika boyunca 55 ° C ve 1 dakika için 70 ° C, 94 ° C' de 3 kez 58 ° C, PCR çevrim parametreleri ayarlayın ve daha sonra 70 °, 1 dakika boyunca C ve 4 ° C'de tutun.
    2. Üreticinin protokolüne göre QIAquick PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünleri saflaştırılır.
    3. Sanger sekanslanması için bir DNA dizileme servis sağlayıcıya saflaştırılmış PCR ürünleri gönder.
    4. Sıralama servisi tarafından sağlanmalıdır ortalama okuma kalite puanı, kontrol edin. Ortalama taban çağrı doğruluğu% 85'inden az ise, 6.10.3 için adım 6.10.1 kokan
    5. (ChromatQuan web aracını kullanınf="http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi">http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi ) Her zaman noktasında viral oranını hesaplamak için. aracı dizisi izleme dosyası (* .ab1) ve ilgi nükleotid sitesine dizisi 5 'gerektirir. aracı belirtilen yerinde tepe yoğunluğunu ölçer. tepe yoğunluğuna oranı, iki virüs (Şekil 4B) rasyon karşılık gelir.
    6. GRC web aracı (kullanın http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ viral göreli uygunluğu (d) hesaplamak için girdi olarak) ve kaydedilmiş pik şiddetlerini. Adım 6.10.6 Bkz. 20

Representative Results

HIV-1 Gag-p24 olarak tek bir amino asit değişikliklerinin spor etkisini incelemek için, HIV-1 COTB-p24 geni 23,32,33 ihtiva eden bir pNL4-3 plazmide mutasyonların katılması için oligonükleotid yönlendirilmiş mutagenez kullanılmıştır. Viral stoklar 293T hücrelerinin transfeksiyonu ile üretilir ve 48 saat sonra hasat edilmiştir. Biz Reed-Muench yöntemi 31, her bir virüs stokunun% 50 doku kültürü enfeksiyon dozu (TCID50) tahmin edilmiştir. Prototip TCID50 ve mutant virüsler, 10 4 10 5 IU / ml (Şekil 3A) arasında değişmektedir.

Rekombinant virüslerin büyüme kinetikleri 0.005 MOl'de tek bir donörden alınan PBMC içinde kurulmuştur. RT-qPCR altı gün boyunca günlük olarak, viral cDNA kopyası sayısını ölçmek için kullanılmıştır. Bütün mutant ve prototip virüsleri <Viral RNA kopya sayısı artış azalan bir eğimi (belirtildiği gibi viral büyüme yavaşladı 2. ve 4. günde, aşağıdakiler arasında katlanarak büyüyenstrong> Şekil 3B). cDNA azalma (inokulum karşılık gelir) gün 0 ve 2 arasında sayı hücreleri virüs emilmesi ve gün 1 yıkama (aşama 5.1.6) bağlanmamış virionlann çıkarılması nedeniyle kopyalama. Üslü büyüme fazında, üç mutant prototip virüsü (Şekil 3C), daha yavaş bir büyüme oranını (g) vardı.

Her üç mutantlar 0.005 toplam İçişleri Bakanlığı büyüme rekabet deneylerinde prototip virüsüne karşı yarıştı bulundu. Ikili olarak enfekte kültürlerden viral büyüme kinetikleri monoinfection benzer olduğu; Viral üstel büyüme fazı gün 2 ve 4 arasında, ve virüs büyümesi günde 5 (Şekil 4A) etrafında bir düzlüğe ulaşmıştır.

Viral büyüme oranı farklılıkları, zaman içinde, viral oranı değişikliği elde edilmiştir. Viral oran cDNA kopyası başvuru sayısı ve RT-qPCR kullanarak mutant virüslere ve karşılaştırarak zirve yükseklikleri ile hesaplanmıştırsırayla iki virüs (Şekil 4B) ayırt edici nükleotit siteleri kromatogra-. doruk yüksekliğini ve viral RNA kopya sayısı yöntemleri kullanılarak saptanmıştır büyüme oranı farklılıkları, benzer sonuçlar (Şekil 4C) vermiştir. Her üç mutantlar düşük uygunluğu (Şekil 4C) sahip mutant I256V ile prototip virüs daha düşük çoğaltma uygunluk vardı.

Şekil 1
Şekil 1: Bu yazıda sunulan protokollerin akış diyagramı, viral stokların Virüs hazırlanması protokolleri endişe HIV-1 rekombinant klonların yapımı ve üretimi.. Fitness Tahliller protokoller viral büyüme kinetiği kurulması ve nispi viral uygunluğunu belirlemek için vardır. Kesik çizgiler protokoller için alternatif akımlarını gösterir. Örneğin, bir mutasyonun HIV-1 NL4-3 doğrudan sokulabilirbir rekombinant klonu oluşturmadan molekül klonu.

Şekil 2,
Şekil 2:. Örtüşme uzatma PCR (A) kullanılarak HIV-1 NL4-3 COTB Gag-p24 yeniden birleştirici molekül klonlarının kurulması kimerik primerler dizayn. 5 'primer yarıları NL4-3 vektör dizisi içeren ve 3' yarım uç dizisinin uçlarını içerir. (B), kimerik primerler uç fragmanını COTB Gag-p24 amplifiye edilmesi için kullanılır. (C) uç parçaları yeni bir rekombinant plazmidi üretmek için ikinci bir PCR için primerler olarak kullanılmıştır.

Şekil 3,
Şekil 3:. PBMC'lerde viral büyüme özellikleri (A) Log 10 TCID 50 (B) MOl'de = 0.005 başlamış monoinfections viral büyüme kinetiği. Panel (B) elde edilen üslü büyüme fazında (gün 2-4) de dahil olmak üzere, altı gün boyunca (° C) Viral büyüme oranları. Gösterilen değerler, bir deneyden üç kopyanın ortalamasını temsil eder. Hata çubukları,% 95'lik güven aralıklarını gösterir.

Şekil 4,
Şekil 4: Viral büyüme ve bağıl spor tayinleri (A) dually enfekte PBMC kültürlerinde viral büyüme.. T242N ve prototip virüs (B) Oranlar RT-qPCR veya sıralama tepe yüksekliği metodu kullanılarak belirlenmiştir. (A) 'da gösterildiği gibi, (C) mutant ve ikili olarak enfekte kültürlere prototip virüsler arasında net, viral büyüme oranı farklılıkları (d),. d değerleri f hesaplandı(B) 'de gösterildiği viral oranı verilerini rom. Gösterilen değerler, bir deneyden üç kopyanın ortalamasını temsil eder. Hata çubukları,% 95'lik güven aralıklarını gösterir.

Discussion

rekombinant HIV-1 molekül klonlar ve büyüme rekabet deneyleri yapımı: sunulan protokoller iki ana bölümden oluşuyordu. Bir ikili olarak enfekte edilmiş hücre kültürü içinde iki virüs ayırt etmek amacıyla, rekabet eden moleküler klonlar, bir RT-qPCR primeri-prob deneyi ile veya Sanger dizileme ile tespit edilebilir dizi etiketleri, ihtiva etmesi önemlidir. Bu protokol, HIV-1 NL4-3 Vif aynı bölgesini işgal eder ve aynı amino asit dizisini kodlayan, ancak altı ayn mutasyonla Vifa ve VifB etiketler, kullanır. Bu mutasyonlar etkilemediği gösterilmiştir edildi Viral replikasyon spor 20. Bu protokolde kullanılan PCR bazlı klonlama yöntemi kısıtlama sitesi tabanlı klonlama ile karşılaştırıldığında, klonlama siteleri seçiminde daha fazla esneklik sağlar. Bununla birlikte, PCR klonlama etkinliği uç boyutu arttıkça azalmaktadır. insert büyüklüğü akım limiti ~ 5 kb 34 olduğunu. PCR bazlı klonlama ve bölgeye yönelik mutagenesi içins, yüksek sadakat DNA polimeraz kullanılması ekstra mutasyonların olasılığını azaltmak için çok önemlidir. Ürünlerin yeterli miktarda elde etmek üzere gerekli olan PCR döngüsü az sayıda kullanılması da tavsiye edilir. Deneyimlerimize göre, burada tarif edilen PCR bazlı klonlama ve site-directed mutagenesis adımlardan sonra, herhangi bir ilave mutasyonlar tespit etmedi. Yine PCR ürünleri istenmeyen mutasyonlar kontrol etmek için sıralı olmalıdır. İdeal olarak, tüm HIV kodlama bölgesi yeniden dizilmesi gerekir.

En az üç numune alma zaman noktaları üstel büyüme fazında 9 içinde muayene edilmelidir. Viral büyüme kinetiği ilk büyüme yarışma için uygun kültür dönemi ve örnekleme zamanı noktalarını belirlemek için günlük örnekleme yöntemiyle kurulmalıdır. Viral büyüme kinetiği etkileyen bir faktör enfeksiyonu (İçişleri Bakanlığı) çokluğu olduğunu. Daha ro elde etmek üzere gösterildiği gibi bu protokol, monoinfection ve büyüme rekabet her ikisi için 0.005 bir toplam MOI kullanırAlt Mois 9 daha büstü sonuçlar. Bununla birlikte, alt Mois gerekirse daha uzun bir üstel büyüme fazı elde etmek için kullanılan, ancak sonuç kıvamında pahasına yapılabilir. Bu protokol virüslerinin spor farkları önceden genellikle bilinmemektedir olduğunu varsayarak, 50:50 başlangıç ​​enfeksiyon oranını göstermektedir. Viral replikasyon kinetiği önemli farklılıklar gösteren ilk veriler olduğunda Ancak, eşitsiz girdi oranlarının kullanılması uygundur. Bu gibi durumlarda, 70:30 bir enfeksiyon oranı daha az uygun bir virüs fazlalığı 9 yerleştirilir büyük bir spor farkın tespiti için ayrılması tavsiye edilir.

viral büyüme kinetikleri, ve HIV-1 alt tip B kullanılarak rekabet tahlilleri optimize edilmiştir büyüme gerçekleştirmek için TCID50 belirlenmesi için protokol, PBMC, tek bir donörden NL4-3 COTB-p24 ve PBMC'ler, HIV tutarlı duyarlılık göstermiştir in vitro olarak 1 enfeksiyonu. Kültür dönemive bu protokolde yer alan numune zaman noktaları, insan PBMC içinde, HIV-1 M grubu virüsleri incelemek için uygun olması muhtemeldir. Tek bir kaynaktan elde edilmiş PBMC'ler kullanılarak yüksek viral replikasyon farklı bir donörden hücreleri 35 değişebilir tutarlı sonuçlar elde etmek için önerilmektedir. Bir ikame, aynı havuzu bütün deneylerde boyunca kullanıldığı sürece daha az tercih edilmesine rağmen, birden fazla vericilerden alınma toplanmış PBMC kullanılabilir. Diğer bir alternatif hücre çizgilerinin kullanımı. Burada sunulan protokol T-hücresi hattı CEMx174 23,36 ile başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Bununla birlikte, tohumlanmıştır hücre sayısı yeniden optimize uyumlu hücre büyümesini başarmak için olması önemlidir. Büyüme rekabet adımlarla uygun örnekleme zamanı noktalarını belirlemek için, farklı hücre hatları değişir muhtemelen viral büyüme kinetikleri de, yeniden kurulmalıdır.

Uygunluğu hesaplamak için viral oranını belirlemek için iki farklı yöntem protoc dahildirol. ilk önce, her bir numune toplama noktasında viral cDNA kopyası sayısı ölçmek için RT-qPCR kullanır. Viral replikasyon spor sonra cDNA kopyası sayısına bağlı viral oranı hesaplanmıştır. Alternatif olarak, virüs oranı VifAB etiketi bölgelerinde kromatogram tepe yüksekliğine oranı esas alınarak tespit edilebilir. iki yöntem benzer sonuçlar (Şekil 4) elde edildi. kromatogram doruk yüksekliği yöntemi tasarlanmış sekans etiketi olmadan diğer HIV-1 suşlarının uygulanabilir. RT-qPCR viral varyantları ayırt etmek primerler veya probların kullanımı ilk dikkatle değerlendirilmesi gerekmektedir İçin (20 bakınız). Bununla birlikte, RT-qPCR gibi üstel büyüme fazı içinde birinci zaman noktasında elde edilenler gibi viral RNA'nın, az bir miktarda olan örnekler için daha iyi bir hassasiyet sağlar. Viral cDNA'nın doğrudan ölçümü RNA ekstraksiyonu ve cDNA sentezi ile ilgili ortaya çıkabilecek teknik sorunlar saptanmasını sağlar. Dizi etiketleri ile moleküler klonlar kullanma maliyetli bir çözüm sunar tRT-qPCR yöntemleri o gibi primerlerin ve probların iki çifti birden fazla virüs incelemek için ihtiyaç vardır. Bu strateji aynı zamanda sıralama çalışmada tüm virüsler arasında aynı sitede yapıldığı gibi sırayla tepe yüksekliği varyasyon problemi, komşu üsleri 37 nedeniyle kromatogra- önler. RT-qPCR Sanger sekanslanması için üretilen PCR ürünleri aynı zamanda başka yöntemler ile kullanımı, tek tek klonlann 12,13 toplu dizilemesi STD 4,7,17,19 veya oligonükleotid ligasyon tahlili (OLA) 38 gibi viral oranını belirlemek için olabilir .

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim. Burada ifade edilen görüşler yazarlarına aittir ve resmi ya da ABD Savunma Bakanlığı ya da Ordu Bölümü görüşlerini temsil olarak ele alınmamalıdır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Construction of recombinant clones
Chimeric primer/Mutagenic/Sequencing primers IDT Custom DNA oligos
pNL4-3VifA and pNL4-3VifB plasmid Please contact Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)
High-Fidelity DNA polymerase Thermo Scientific F-549S
High-fidelity buffer Thermo Scientific F-549S
dNTP Bioline Bio-39026
Thermal cycler Life Technologies Applied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700
DNA loading dye Thermo Scientific R0631
1 kb Plus DNA ladder Invitrogen 10787-018
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
DpnI enzyme New England Biolabs R0176S
TOP10 chemically competent Escherichia coli Invitrogen C4040-10
Luria Broth base powder Invitrogen 12795-084
Carbenicillin Research Products International C46000-25.0
QIAprep Spin Miniprep kit  Qiagen 27104
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
Transfection
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Roche 6365787001
HEK 293T-17 ATCC CRL-11268 http://www.atcc.org/
0.22 μm filter top tube VWR International 89220-716 
Cell culture
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 10566016
Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium (IMDM) Life Technologies 31980-030
RPMI-1640 media Life Technologies 61870-036
Phytohemagglutinin (PHA) Thermo Scientific R30852801
Human Interleukin-2 Roche 11147528001
Fetal bovine serum JR Scientific 43640
Penicillin and Streptomycin Corning Cellgro 30-001-CI
6 well plate VWR Scientific 73520-906
48 well plate VWR Scientific 62407-338
96 well flat-bottomed plate ISC Bioexpress T-3015-4
96 well round-bottomed plate BD Falcon 353077
1.5 ml Microcentrifuge Tube Mt. Baker Bio MBD-1500
1.5 ml tubes w/ O-ring VWR Scientific 89004-290
50 ml conical tube ISC Bioexpress C-3317-6
ELISA
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100
Phosphate buffer saline (PBS) Invitrogen 14190-250
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F0392
glycerol Sigma-Aldrich G5516
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Rabbit anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum NIH AIDS Reagent Program 4250
Goat anti-rabbit HRP KPL 474-1516
TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-01
H2SO4 Fisher Scientific A300-500 Causes severe burns by all exposure routes. Use personal protective equipment. Use only under a chemical fume hood. Wash off immediately with plenty of water for at least 15 min.
HIV p24 standard AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick) For order details please contact Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx
Microplate reader Molecular Devices VMax Kinetic ELISA Microplate Reader
RNA isolation cDNA synthesis
QIAxtractor Qiagen http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52906
dNTP Bioline Bio-39026
SuperscriptIII Invitrogen 18080-085
First-strand buffer  Invitrogen 18080-085
Dithiothreitol (DTT) Invitrogen 18080-085
Rnase inhibitor Roche 3335402001
RnaseH Invitrogen 18021-071
qPCR
Real-time qPCR machine Life Technologies Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR 
TaqMan® Gene Expression Master Mix Life Technologies 4369016
Forward, reverse primer IDT Custom order
Probe Life Technologies Custom order
optical 96 well reaction plate Life Technologies I19N3Q216
PCR+sequencing
Taq DNA polymerase (Biolase) Bioline Bio-21043
NH4 buffer  Bioline Bio-21043
MgCl2 Bioline Bio-21043
Sequencing primer IDT Custom order
QIAxcel Qiagen http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system
DNA sequencing service provider http://www.htseq.org/
GRC web tool http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/
ChromatQuan web tool http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Domingo, E., Holland, J. J. RNA virus mutations and fitness for survival. Annu Rev Microbiol. 51, 151-178 (1997).
  2. Domingo, E. Mechanisms of viral emergence. Veterinary research. 41 (6), 38 (2010).
  3. Martinez-Picado, J., Martinez, M. A. HIV-1 reverse transcriptase inhibitor resistance mutations and fitness: a view from the clinic and ex vivo. Virus Res. 134 (1-2), 104-123 (2008).
  4. Troyer, R. M. Variable fitness impact of HIV-1 escape mutations to cytotoxic T lymphocyte (CTL) response. PLoS Pathog. 5 (4), e1000365 (2009).
  5. Rolland, M. Amino-acid co-variation in HIV-1 Gag subtype C: HLA-mediated selection pressure and compensatory dynamics. PLoS One. 5 (9), e12463 (2010).
  6. Abraha, A. CCR5- and CXCR4-tropic subtype C human immunodeficiency virus type 1 isolates have a lower level of pathogenic fitness than other dominant group M subtypes: implications for the epidemic. J Virol. 83 (11), 5592-5605 (2009).
  7. Quinones-Mateu, M. E. A dual infection/competition assay shows a correlation between ex vivo human immunodeficiency virus type 1 fitness and disease progression. J Virol. 74 (19), 9222-9233 (2000).
  8. Ball, S. C. Comparing the ex vivo fitness of CCR5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolates of subtypes. B and C. J Virol. 77 (2), 1021-1038 (2003).
  9. Lanxon-Cookson, E. C. Factors affecting relative fitness measurements in pairwise competition assays of human immunodeficiency viruses. J Virol Methods. 194 (1-2), 7-13 (2013).
  10. Garcia-Lerma, J. G., MacInnes, H., Bennett, D., Weinstock, H., Heneine, W. Transmitted human immunodeficiency virus type 1 carrying the D67N or K219Q/E mutation evolves rapidly to zidovudine resistance in vitro and shows a high replicative fitness in the presence of zidovudine. J Virol. 78 (14), 7545-7552 (2004).
  11. Sharma, P. L., Crumpacker, C. S. Attenuated replication of human immunodeficiency virus type 1 with a didanosine-selected reverse transcriptase mutation. J Virol. 71 (11), 8846-8851 (1997).
  12. Martinez-Picado, J., Savara, A. V., Sutton, L., D'Aquila, R. T. Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 73 (5), 3744-3752 (1999).
  13. Wang, J. The HIV-1 reverse transcriptase mutants G190S and G190A, which confer resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, demonstrate reductions in RNase H activity and DNA synthesis from tRNA(Lys, 3) that correlate with reductions in replication efficiency. Virology. 348 (2), 462-474 (2006).
  14. Song, H. Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome. Retrovirology. 9 (89), (2012).
  15. Ali, A., Yang, O. A novel small reporter gene and HIV-1 fitness assay. Journal of Virological Methods. 133 (1), 41-47 (2006).
  16. Maarseveen, N. M. A novel real-time PCR assay to determine relative replication capacity for HIV-1 protease variants and/or reverse transcriptase variants. J Virol Methods. 133 (2), 185-194 (2006).
  17. Liu, Y. Evolution of human immunodeficiency virus type 1 cytotoxic T-lymphocyte epitopes: fitness-balanced escape. J Virol. 81 (22), 12179-12188 (2007).
  18. Anastassopoulou, C. G., Ketas, T. J., Klasse, P. J., Moore, J. P. Resistance to CCR5 inhibitors caused by sequence changes in the fusion peptide of HIV-1 gp41. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (13), 5318-5323 (2009).
  19. Abraha, A., Troyer, R. M., Quinones-Mateu, M. E., Arts, E. J. Methods to determine HIV-1 ex vivo fitness. Methods Mol Biol. 304, 355-368 (2005).
  20. Liu, Y. A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture. J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).
  21. Brumme, Z. L. Reduced replication capacity of NL4-3 recombinant viruses encoding reverse transcriptase-integrase sequences from HIV-1 elite controllers. J Acquir Immune Defic Syndr. 56 (2), 100-108 (2011).
  22. Nomura, S. Significant reductions in Gag-protease-mediated HIV-1 replication capacity during the course of the epidemic in. Japan. J Virol. 87 (3), 1465-1476 (2013).
  23. Rolland, M. HIV-1 conserved-element vaccines: relationship between sequence conservation and replicative capacity. J Virol. 87 (10), 5461-5467 (2013).
  24. Martinez-Picado, J. Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 80 (7), 3617-3623 (2006).
  25. Brockman, M. A. Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A. J Virol. 81 (22), 12608-12618 (2007).
  26. Miura, T. HLA-associated alterations in replication capacity of chimeric NL4-3 viruses carrying gag-protease from elite controllers of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 83 (1), 140-149 (2009).
  27. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, PCR: The Polymerase Chain Reaction. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction (2014).
  28. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments : JoVE. 62 (Apr 20), (2012).
  29. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, Restriction Enzyme Digests. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests (2014).
  30. McClure, J., van't Wout, A. B., Tran, T., Mittler, J. E. Granulocyte-monocyte colony-stimulating factor upregulates HIV-1 replication in monocyte-derived macrophages cultured at low density. J Acquir Immune Defic Syndr. 44 (3), 254-261 (2007).
  31. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimatingfifty percent endpoints. Am J Hyg. 27 (3), 493-497 (1938).
  32. Nickle, D. C. Consensus and ancestral state HIV vaccines. Science. 299 (5612), 1515-1518 (2003).
  33. Rolland, M. Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol. 81 (16), 8507-8514 (2007).
  34. Bryksin, A. V., Matsumura, I. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids. Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).
  35. Spira, A. I., Ho, D. D. Effect of different donor cells on human immunodeficiency virus type 1 replication and selection in vitro. J. Virol. 69 (1), 422-429 (1995).
  36. Manocheewa, S., Swain, J. V., Lanxon-Cookson, E., Rolland, M., Mullins, J. I. Fitness costs of mutations at the HIV-1 capsid hexamerization interface. PLoS One. 8 (6), e66065 (2013).
  37. Zakeri, H., Amparo, G., Chen, S. M., Spurgeon, S., Kwok, P. Y. Peak height pattern in dichloro-rhodamine and energy transfer dye terminator sequencing. Biotechniques. 25 (3), 406-410 (1998).
  38. Lalonde, M. S. Sensitive oligonucleotide ligation assay for low-level detection of nevirapine resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 quasispecies. J Clin Microbiol. 45 (8), 2604-2615 (2007).

Tags

İmmünoloji Sayı 99 HIV-1 rekombinant Mutagenez Viral replikasyon spor Büyüme rekabet Fitness hesaplama
İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manocheewa, S., Lanxon-Cookson, E.… More

Manocheewa, S., Lanxon-Cookson, E. C., Liu, Y., Swain, J. V., McClure, J., Rao, U., Maust, B., Deng, W., Sunshine, J. E., Kim, M., Rolland, M., Mullins, J. I. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (99), e52610, doi:10.3791/52610 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter