Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.
फल ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर प्रतिरक्षा रक्षा के समारोह और विकास के अध्ययन के लिए प्रमुख मॉडल जीवों में से एक है उड़। जन्मजात उन्मुक्ति के कई पहलुओं को कीड़ों और स्तनधारियों के बीच संरक्षित कर रहे हैं, और ड्रोसोफिला आसानी से आनुवंशिक रूप से और प्रयोगात्मक हेरफेर किया जा सकता है, क्योंकि वे प्रतिरक्षा प्रणाली समारोह और रोग के शारीरिक परिणामों के अध्ययन के लिए शक्तिशाली हैं। यहाँ का प्रदर्शन प्रक्रिया उपकला बाधाओं और बचाव का अधिक निष्क्रिय रूपों को दरकिनार और प्रणालीगत संक्रमण पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है, सीधे शरीर गुहा में बैक्टीरिया के लागू होने से मक्खियों के संक्रमण की अनुमति देता है। प्रक्रिया मेजबान मृत्यु दर, प्रणालीगत रोगज़नक़ लोड, और मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली के शामिल होने की डिग्री के मापने दरों के लिए प्रोटोकॉल में शामिल हैं। इस संक्रमण की प्रक्रिया, सस्ती, मजबूत और मात्रात्मक repeatable है, और कार्यात्मक आनुवंशिकी, विकासवादी जीवन इतिहास, और शरीर विज्ञान के अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है।
फल ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर मक्खी, प्रयोगात्मक हेरफेर करने के लिए अत्यधिक उत्तरदायी हैं, और एक व्यापक विकसित किया गया है कि एक व्यापक वैज्ञानिक समुदाय का समर्थन कर रहे समारोह और प्रतिरक्षा रक्षा। ड्रोसोफिला के विकास सस्ती और पीछे करने के लिए आसान कर रहे हैं का अध्ययन करने के लिए प्रमुख मॉडल जीवों में से एक है अनुसंधान उपकरण की सरणी। जन्मजात उन्मुक्ति के कई पहलुओं को टोल की तरह रिसेप्टर्स और एनएफ-केबी परिवार प्रतिलेखन कारक, जे ए / स्टेट संकेतन, और JNK मार्ग प्रतिक्रियाओं द्वारा मध्यस्थता संकेत पारगमन सहित, कीड़े और स्तनधारियों के बीच संरक्षित कर रहे हैं। 1,2 इन जीनों और रास्ते सकते हैं का समारोह डी में पूछे जा मेलानोगास्टर म्यूटेशन का उपयोग कर या आरएनएआई कि वृद्धि या कमी मार्ग गतिविधियों knockdowns 3 -। इसके अतिरिक्त 6, ड्रोसोफिला विकासवादी जीवन इतिहास सिद्धांत के संदर्भ में भी शामिल है, संक्रमण और रोग के शारीरिक परिणामों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 7।– 9 सभी तरह के अध्ययन, हालांकि, मज़बूती से परिभाषित उपचार शर्तों के तहत प्रयोगात्मक मक्खियों को संक्रमित करने की क्षमता पर निर्भर करती है। यहाँ वर्णित प्रक्रिया ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर करने के लिए मजबूत और repeatable जीवाणु संक्रमण पहुंचाने और बाद में संक्रमण की गंभीरता को मापने और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बढ़ाता के लिए एक methodological रूपरेखा प्रस्तुत करता है।
ड्रोसोफिला स्वाभाविक रूप से और प्रयोगात्मक बैक्टीरिया, कवक, वायरस, नेमाटोड और parasitoid का wasps सहित परजीवी और रोगज़नक़ों, की एक विस्तृत विविधता से संक्रमित हो सकते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल प्रणालीगत जीवाणु संक्रमण देने पर ध्यान केंद्रित कर रहा है। बहुत से विभिन्न प्रकार के बैक्टीरिया मक्खियों को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और प्रयोगकर्ता की पसंद से पूछा जा रहा सटीक वैज्ञानिक सवालों के जवाब के आधार पर किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, मानव नैदानिक वियोजन बैक्टीरियल विषैलापन तंत्र 10 अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, या पारिस्थितिकी प्रासंगिक वियोजन preferre हो सकता हैविकासवादी अध्ययन के लिए डी। 11 कुछ बैक्टीरिया डी के सक्षम रोगजनक हैं मेलानोगास्टर, संक्रमण पर proliferating और मेजबान बीमारी या मृत्यु के कारण। अन्य जीवाणुओं को प्रभावी ढंग से मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा प्रबंधित और कुछ दिनों के भीतर मंजूरी दे दी है। इस प्रदर्शन में, Providencia rettgeri मेजबान मृत्यु दर का कारण है और जीवित रहने के मेजबानों में बनी रहती है। Escherichia कोलाई मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा मंजूरी दे दी है कि एक गैर रोगजनक के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा कर सकते हैं कि एक प्रफलन रोगज़नक़ के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा।
संक्रमण सीधे मक्खी के शरीर गुहा में बैक्टीरिया के लागू होने से स्थापित किया जाएगा। इस दृष्टिकोण पर ध्यान दिए बिना संचरण की प्राकृतिक मोड के प्रणालीगत संक्रमण की जांच की अनुमति देता है, उपकला बाधाओं और सुरक्षात्मक व्यवहार नजरअंदाज। प्रयोगात्मक प्रणालीगत संक्रमण की स्थापना के लिए दो प्राथमिक तरीके हैं। पहली बार में एक nanoinjector और खींच लिया गिलास केशिका सुइयों का एक सटीक संख्या इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंमक्खी में बैक्टीरिया। इस विधि संक्रमण खुराक की एक बड़ी गतिशील रेंज की अनुमति के और मात्रात्मक अत्यधिक repeatable होने का लाभ है। दूसरा दृष्टिकोण एक सेप्टिक चिढ़ के साथ संक्रमण वितरित करने के लिए है। यह दृष्टिकोण तेजी से किया जा रहा है और कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता के फायदे हैं। संक्रमण स्थापित हो जाने के बाद, यह प्रणालीगत रोगज़नक़ लोड, मेजबान मृत्यु दर, और inducible प्रतिरक्षा प्रणाली गतिविधि को मापने के लिए संभव हो जाता है। बेशक, अतिरिक्त phenotypes के किसी भी संख्या क़यास संक्रमित डी में मापा जा सकता है बाद संक्रमण उपजाऊपन 12, सीखने की क्षमता 13, चयापचय की स्थिति के 14, या कल्पना की जा सकती है कि वास्तव में किसी भी अन्य विशेषता सहित मेलानोगास्टर।
यहाँ वर्णित प्रक्रिया ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की कठोर और उच्च गुणवत्ता संक्रमण अर्जित करता है। सचित्र उदाहरण मुख्य रूप से Providencia rettgeri और ई के साथ संक्रमण पर ध्यान केंद्रित कोलाई, लेकिन प्रोटोकॉल अत्यधिक अनुकूल है और मेजबान पालन और रखरखाव की स्थिति की एक सीमा से अधिक विविध बैक्टीरिया से संक्रमण के लिए लागू किया जा सकता है।
एक इष्टतम प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के विवरण के संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जीवाणु, मेजबान के जीनोटाइप, और समग्र प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर करेगा। यह दृढ़ता से किसी भी नए प्रयोगात्मक शर्तों और अधिक महत्वाकांक्षी परियोजनाओं को शुरू करने से पहले प्रायोगिक परीक्षा के लिए सिफारिश की है। एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु एक 100 गुना सीमा पर तीन संक्रमण खुराक परीक्षण करने के लिए है। मक्खी प्रति 100 बैक्टीरियल कोशिकाओं – अति उग्र रोगज़नक़ों अक्सर सबसे अच्छा 10 के आदेश पर बहुत कम संक्रामक खुराक पर पेश कर रहे हैं। और अधिक उदार रोगज़नक़ों फ्लोरिडा के अनुसार लगभग 1,000 जीवाणुओं की अधिक मात्रा में इंजेक्ट किया जा सकतावाई, और गैर रोगज़नक़ों मक्खी प्रति 10,000 बैक्टीरिया के रूप में उच्च मात्रा में इंजेक्ट किया जा सकता है। यह एक अनुदैर्ध्य समय श्रृंखला पर रोगज़नक़ लोड, मेजबान मृत्यु दर, और प्रतिरक्षा प्रणाली गतिविधि पर नज़र रखने से उपन्यास में संक्रमण के कैनेटीक्स परिभाषित करने के लिए अक्सर शिक्षाप्रद है। रोगज़नक़ लोड और मेजबान जीन अभिव्यक्ति की माप विनाशकारी assays के होते हैं, क्योंकि यह मापा जा रहा है कि हर समय बिंदु के लिए प्रयोग के शुरू में अलग मक्खियों को संक्रमित करने के लिए आवश्यक है।
चिढ़ या microcapillary आधारित इंजेक्शन का उपयोग करने के लिए जब तय है कि, यह फायदे और सीमाएं प्रत्येक दृष्टिकोण करने के लिए कर रहे हैं नोट करना महत्वपूर्ण है। केशिका इंजेक्शन दोनों विनय टर्गर दबाव बढ़ जाती है और लवण या निलंबित या कैरियर में भंग कर रहे हैं कि अन्य अणुओं का परिचय है, जो मक्खी, में तरल पदार्थ की एक मात्रा का परिचय। केशिका इंजेक्शन भी आवश्यक उपकरणों का एक इंजेक्शन की सुविधा या खरीद करने के लिए उपयोग की आवश्यकता है। सेप्टिक चिढ़ कोई विशेष उपकरणों और परिचय की आवश्यकता हैनगण्य मक्खी में मीडिया, और आम तौर पर मक्खियों की बड़ी संख्या को संक्रमित करने के लिए और अधिक कुशल है। हालांकि, चिढ़ संक्रमण केशिका इंजेक्शन के साथ प्राप्त किया जा सकता है कि संक्रमण खुराक पर सटीक नियंत्रण की अनुमति नहीं देते। वर्तमान प्रोटोकॉल यंत्रवत् इंजेक्शन की मात्रा को नियंत्रित करता है कि एक इंजेक्शन तंत्र पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन दबाव हवा के असतत दालों पर आधारित इंजेक्शन सिस्टम भी कर रहे हैं। 20,21 ये आम तौर पर तंत्र यहाँ विशेषताओं की तुलना में अधिक महंगे हैं और प्रत्येक के लिए हवा नाड़ी की जांच की आवश्यकता होती है आदेश में सुई लगातार इंजेक्शन संस्करणों सुनिश्चित करने के लिए।
मक्खियों जंगली में बैक्टीरिया से संक्रमित हो जाते हैं प्रणालीबद्ध तरीके पर काफी बहस लेकिन बहुत कम डाटा नहीं है। कुछ जांचकर्ताओं ड्रोसोफिला रोगजनक बैक्टीरिया निगलना जब प्राकृतिक संक्रमण के बहुमत होते हैं और बैक्टीरिया बाद में एक प्रणालीगत संक्रमण की स्थापना के लिए पेट भागने में सफल रहे हैं कि मंज़ूर। हालांकि, फ़े बहुत कुछ कर रहे हैंनाम से जाना जाता डब्ल्यू बैक्टीरिया डी के पेट को पार करने में सक्षम होने के लिए मेलानोगास्टर, और यह क्षमता है कि उन मक्खियों 22,23 करने के लिए अत्यधिक घातक हैं। एक वैकल्पिक सिद्धांत में विफल रहा है शिकार के प्रयास या ectoparasitic के कण के हमले से बच के माध्यम से चर्म संबंधी चोटों को बनाए रखने के लिए नियमित रूप से मक्खियों है। इस परिकल्पना जंगली डी के लगातार संग्रह के द्वारा समर्थित है चंगा घावों (अप्रकाशित टिप्पणियों) का संकेत कर रहे हैं कि melanization स्पॉट असर मेलानोगास्टर। कण ड्रोसोफिला 24 में बैक्टीरिया के संक्रमण संचारित करने के लिए दिखाया गया है और कण द्वारा छोड़ा घाव गौणतः मधु मक्खियों 25 में बैक्टीरिया से संक्रमित हो सकते हैं। हालांकि, डी के संचालित घुन या अन्यथा अवसरवादी संक्रमण की प्रकृति में आवृत्ति छल्ली उल्लंघनों के माध्यम से मेलानोगास्टर ज्ञात नहीं है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल सीधे किसी भी उपकला बाधाओं या व्यवहार immu नजरअंदाज जो मात्रात्मक इंजेक्शन के माध्यम से hemolymph में बैक्टीरिया की शुरूआत की अनुमति देता हैसामुदायिक। डी के लिए रोगजनक बैक्टीरिया को खिलाने के लिए तरीके मेलानोगास्टर Vodovar एट अल। 22 और Nehme एट अल। 23 में वर्णित किया गया है।
कई entomopathogenic बैक्टीरिया शोधकर्ताओं आराम से उनके साथ काम करने की इजाजत दी, कम या कोई मानव स्वास्थ्य के जोखिम मुद्रा। इसके अलावा, बहुत कुछ बैक्टीरिया प्रयोगात्मक हस्तक्षेप के बिना संपर्क पर ड्रोसोफिला को संक्रमित करने की क्षमता है, तो दूषित सतहों के माध्यम से एक प्रयोगशाला के माध्यम से जीवाणु संक्रमण के "महामारी" प्रसार का खतरा है या आम तौर पर बहुत कम है मक्खियों भाग निकले। बहरहाल, यह पर्याप्त रोकथाम के उपायों को भागने से संक्रमित मक्खियों को रोकने के लिए जगह में है और किसी भी मक्खियों से बच वापसी के लिए कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए उचित है। प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया जा रहा है रोगाणुओं की कि के अनुरूप एक जैविक सुरक्षा के स्तर पर outfitted किया जाना चाहिए, और सूक्ष्म जीव विज्ञान में मानक सर्वोत्तम प्रथाओं नियोजित किया जाना चाहिए।
प्रयोगात्मक infectiयहाँ वर्णित विधि पर किसी भी मनमाने ढंग से जीवाणु के किसी भी खुराक के साथ ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के संक्रमण की अनुमति देता है। संक्रमण स्थापित किया गया है एक बार, यह जीवाणु प्रसार या निकासी के कैनेटीक्स को मापने के लिए मेजबान मृत्यु दर को ट्रैक करने के लिए, और मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रेरण परख करने के लिए सरल है। संक्रमित मक्खियों आसानी से आकार हो सकता है या संक्रमण के आकार का हो कि शारीरिक कार्यों का परीक्षण सहित अन्य प्ररूपी assays के अधीन करने के लिए किया जा सकता है। वर्णित प्रक्रियाओं, सस्ती कर रहे हैं अपेक्षाकृत कम विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, और आसानी से अनुसंधान और शिक्षण प्रयोगशालाओं में से एक कोने में विभिन्न परियोजनाओं में इस्तेमाल के लिए उन्हें उत्तरदायी बनाने, सीख रहे हैं।
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank the entire Lazzaro lab, and especially Susan Rottschaefer, for their help in both reviewing and testing these protocols. This is a product of their cumulative expertise. Work in the Lazzaro lab is supported by grants R01 AI083932 and R01 AI064950 from the US National Institutes of Health.
Reagent | Company | Part Number |
Incubator | Powers Scientific, Inc | DROS52SD |
Paintbrush | ||
CO2 Flypads | FlyStuff | 59-114 |
CO2 | Airgas | CD FG50 |
Drosophila rearing mix | ||
6 oz Square Bottom Bottles, polypropylene | Genesee Scientific | 32-130 |
Nosterile Extra Large Cotton Balls | Fisher brand | 22-456-882 |
Microscope | Olympus Corporation | SZ51 |
Drosophila Vials polystyrene | VWR international | 89092-720 |
Nosterile Large Cotton Balls | Fisher brand | 22-456-883 |
2L flask | VWR international | 89000-370 |
Petri Dishes with Clear Lids, Raised Ridge; 100 . x 15 mm; | VWR international | 25384-302 |
LB Agar, Miller | Difco | 244520 |
Innoculing Loop | VWR international | 80094-488 |
Rainin Clasic Pipettes in various sizes 0.1 µl to 2 µl, 2 µl to 20 µl, 20 µl to 200 µl, 100 µl to 1000 |
Rainin | PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000 |
Micropipette tips (assorted sizes) | VWR international | 30128-376 53503-810 16466-008 |
Luria Broth Base, Miller | Difco | 241420 |
Disposable Culture Tubes Borosilicate Glass | VWR international | 47729-576 |
S-500 Orbital Shaker | VWR international | 14005-830 |
centrifuge | VWR international | 37001-300 |
PBS pH 7.4 10x | Invitrogen | 70011044 |
SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 |
Semimicrovolume Cuvettes | Bio-Rad | 223-9955 |
Vertical Capillary Puller | Kopf Needle Pipette Puller | |
3.5'' Replacement glass Capillaries for Nanojet II | Drummond Sientific Company | 3-000-203-G/X |
Nanoject II | Drummond Sientific Company | 3-000-204 |
Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
10mL Syringe | BD | 309604 |
Mineral Oil, White, light | Macron Fine Chemicals | 6358-10 |
minutein pins | Fine Science Tools | 26002-10 |
1.5mL Microcentrifuge tubes; Seal Rite | USA Scientific Inc. | 1615-5500 |
Motorized Pestle; Talboys Laboratory Stirrer | Troemner | 103 |
Talboys High Throughput Homogenizer | OPS Diagnostics | 930145 |
5/32'' Grinding Balls | OPS Diagnostics | GBSS 156-5000-01 |
Vortex Genie | Scientific indurstries inc. | G560 |
Multichannel Pipettor (10uL-300uL) | Sartorius | 730360 |
WASP2 Whitley Automated Spiral Plater | Microbiology International | |
ProtoCOL automated colony counter / plate counter/ plate reader | Microbiology International | |
TRIzol | Life Technologies | 15596-026 |
qPCR tubes; Low-Profile 0.2 ml 8-Tube Strips | Bio-Rad | TLS0801 |
qPCR caps; Optical Flat 8-Cap Strips | Bio-Rad | TCS0803 |
RQ1 RNase-Free DNase | Promega | m610a |
M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | m170b |
dNTPs | Promega | U1240 |
Oligo-dT | IDT | |
SsoAdvanced SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5260 |
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5200 |
RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2115 |